一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，該方法包括菌種培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)等工序，高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶。該酶對(duì)作物有顯著的防病、促生長(zhǎng)、增產(chǎn)功能。同時(shí)，將羥基類固醇脫氫酶作為一種新型的飼用酶制劑應(yīng)用到畜牧業(yè)的養(yǎng)殖方面，能有效促進(jìn)豬、肉雞的生長(zhǎng)，提高蛋雞產(chǎn)蛋率，減少畜禽疾病，促生長(zhǎng)效果顯著。本發(fā)明的方法中，發(fā)酵液中的活菌體由原來(lái)的每毫升一億個(gè)提高到三百億個(gè)，酶活由原來(lái)的每克干粉中1000個(gè)酶活上升到現(xiàn)在的每克干粉30萬(wàn)個(gè)酶活，大大降低了生產(chǎn)成本，可進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]任何植物個(gè)體，都是由植物自身的組織細(xì)胞與其體內(nèi)外酶、微生物的組合體，也就是說(shuō)酶及微生物本身就是植物中的一部分，其中酶在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，酶能在常溫常壓下催化各種生化反應(yīng)，產(chǎn)生多種抗生素、促生長(zhǎng)激素，活化土壤釋放大量的微量元素，能增加植物的主干根和毛細(xì)根數(shù)量，拓寬養(yǎng)分的輸送管道，讓作物合理平衡吸收養(yǎng)料，促進(jìn)作物生長(zhǎng)、早熟、增收、增強(qiáng)抗逆性、抗病性、抗旱澇等。要是沒(méi)有這些酶，作物就不倉(cāng)tH。
[0003]我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年由農(nóng)作物病蟲(chóng)害造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，農(nóng)作物重茬病害也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，為了防治病蟲(chóng)害導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥的濫用，結(jié)果病蟲(chóng)對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性越來(lái)越強(qiáng)，農(nóng)藥的施用量越來(lái)越大，濃度越來(lái)越高，病害越來(lái)越難治，再加上有機(jī)肥料使用逐年減少，化學(xué)肥料過(guò)度使用，造成土壤板結(jié)，化學(xué)藥物、激素、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo)，生態(tài)環(huán)境也遭到了極大破壞，環(huán)境污染也越來(lái)越嚴(yán)重，不但人畜中毒事件頻頻發(fā)生，而且也造成了農(nóng)作物的抗病能力大大下降，導(dǎo)致作物減產(chǎn)，農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)受到極大影響，嚴(yán)重削弱了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，隨著我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口量日益增加，人民生活水平的不斷提高，不論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)際市場(chǎng)，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)質(zhì)產(chǎn)量要求越來(lái)越嚴(yán)格，對(duì)綠色農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)提出了更高的要求。
[0004]土壤是由礦物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)和微生物三大部分組成，是農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，土壤中的酶及微生物直接參與土壤中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化，采用人為方式向土壤中增加有益酶及微生物、數(shù)量，就能夠增強(qiáng)土壤中的酶活性，從而提高土壤肥力。
[0005]目前土壤的自毒現(xiàn)象比較嚴(yán)重，自毒現(xiàn)象就是指在前茬作物的殘留體在腐爛分解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些毒素，如:醛、醇、烴類，還有積累的藥物殘留及留體激素等，對(duì)下茬作物有顯著的抑制作用，影響作物的自身生長(zhǎng)，加上土壤病原微生物的大量繁殖，數(shù)量逐年上升，由于幼苗抵抗能力弱，易于染病，營(yíng)養(yǎng)元素的虧缺或失衡，土壤營(yíng)養(yǎng)元素呈現(xiàn)生理性不平衡，直接造成作物營(yíng)養(yǎng)平衡失調(diào)，作物根部腐爛，根系不發(fā)達(dá)，影響作物的正常生理代謝，造成作物大面積減產(chǎn)甚至絕收。
[0006]根據(jù)以上所存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明經(jīng)多年研究，成功的開(kāi)發(fā)出一種新型農(nóng)用酶制劑，羥基類固醇脫氫酶，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該酶對(duì)作物有顯著的防病、促生、增產(chǎn)功能。此外，酶是一種生物催化劑，自然中一切生命現(xiàn)象都與酶的活動(dòng)有關(guān)系，酶產(chǎn)品在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用正在進(jìn)入快速發(fā)展階段，逐漸成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)新技術(shù)革命的主要方向和效益提升的關(guān)鍵。隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)快速發(fā) 展，農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷擴(kuò)大，勢(shì)必會(huì)大大增加酶產(chǎn)品的市場(chǎng)需求。本發(fā)明抓住這一機(jī)遇，發(fā)揮自身的研究?jī)?yōu)勢(shì)，將羥基類固醇脫氫酶作為一種新型的飼用酶制劑應(yīng)用到畜牧業(yè)的養(yǎng)殖方面，經(jīng)多批次試驗(yàn)證明，該酶能有效促進(jìn)豬、肉雞的生長(zhǎng)，提高蛋雞產(chǎn)蛋率，減少畜禽疾病，促生長(zhǎng)效果顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為克服上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其包含如下步驟:
配制LB培養(yǎng)基:將10克蛋白胨，5克酵母浸粉和5克氯化鈉不分前后順序投入到1000毫升水中，PH值自然,攪拌溶解后分裝于多個(gè)直徑25mm,長(zhǎng)度200mm的試管中，每個(gè)試管中裝5毫升，將所述多個(gè)試管放醫(yī)用消毒器中，采用0.12-0.14兆帕滅菌20分鐘；
接種:在無(wú)菌條件下打開(kāi)凍干管睪丸酮叢毛單胞菌種，然后向所述凍干管睪丸酮叢毛單胞菌種里面加入以上滅菌好的LB培養(yǎng)基I毫升，搖動(dòng)溶化后制得凍干管菌懸液備用，然后取上面滅好菌的培養(yǎng)基5毫升，在無(wú)菌條件下打開(kāi)試管，并向試管中加入所述凍干管菌懸液0.3毫升，重新將試管密封好，放搖瓶機(jī)中搖動(dòng)制得擴(kuò)大菌種液；
一級(jí)種子培養(yǎng):
一級(jí)種子培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為:
酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化鈉 0.1% — 0.3%
植物甾醇 0.01%—0.15% 維生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸銨 0.25%—0.5%
余量為水PH值自然
將所述一級(jí)種子培養(yǎng)基配方`中的各原料不分前后順序的加入所述一級(jí)種子培養(yǎng)基配方的水中，開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)攪拌制得一級(jí)種子培養(yǎng)液；將所述一級(jí)種子培養(yǎng)液量取所用量加入到三角瓶中，封口后滅菌，將裝有經(jīng)過(guò)滅菌的培養(yǎng)液的三角瓶放超靜工作臺(tái)中降溫，當(dāng)溫度降到27-31°C時(shí)，在無(wú)菌條件下將所述培養(yǎng)好的擴(kuò)大菌種液接到三角瓶中去，100毫升一級(jí)種子培養(yǎng)液接入的擴(kuò)大菌種液為2毫升，完畢后放搖瓶機(jī)中，制得一級(jí)菌種液；
將發(fā)酵設(shè)備的管道、無(wú)菌空氣過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行滅菌處理，以及將種子罐及發(fā)酵罐進(jìn)行空罐滅菌處理；
種子罐培養(yǎng):
種子罐培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為:
酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化鈉0.15%—0.3%
植物甾醇0.1%—0.3% 維生素D3 0.02%—0.2% 硫酸銨0.2%—0.6%
余量為水PH值自然
將所述種子罐培養(yǎng)基配方中的各原料不分前后順序的加入所述種子罐培養(yǎng)基配方的水中，經(jīng)過(guò)高溫滅菌及降溫處理后，將所述培養(yǎng)好的一級(jí)菌種液在無(wú)菌條件下接種到經(jīng)滅菌處理的種子罐中，100公斤種子罐培養(yǎng)基接入所述一級(jí)菌種液的量為I公斤，然后蓋好罐上的接種帽，通過(guò)無(wú)菌通風(fēng)培養(yǎng)制得種子罐菌種液；
發(fā)酵罐培養(yǎng):
發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為:
酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化鈉0.1%—0.5%
植物甾醇0.1%—0.4% 維生素D3 0.01%—0.1% 硫酸銨0.2%—0.7%
維生素E 0.01%—0.15%余量為水PH值自然
首先將所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的水投入到經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵罐中，然后開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)，向發(fā)酵罐中不分前后順序的加入所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的各原料，經(jīng)過(guò)高溫滅菌及降溫處理后，接入菌種，開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)；
羥基類固醇脫氫酶的破壁提取:
首先采用管式離心機(jī)，8000-16000轉(zhuǎn)/每分鐘，控制流量每小時(shí)1000公斤，棄上清，收集濕菌體；然后將收集的濕菌體按I公斤濕菌體加水3-10公斤，攪拌均勻制成菌懸液，再加入總重量為0.01-0.1%的溶菌酶和0.02-0.2%的蝸牛酶，在4°C一35°C的條件下攪拌I小時(shí)，然后放入-40°C冰凍，直至結(jié)冰凍實(shí)為止，取出后溶化冰，然后再放入-40°C結(jié)冰，這樣反復(fù)3-6次即可達(dá)到破壁提取所述羥基類固醇脫氫酶的最佳效果。
[0008]該酶具備的功能與特性
1、該酶是一個(gè)酶系的組成，能將土壤中的有機(jī)成分轉(zhuǎn)化分解成有機(jī)質(zhì)、分解氮化合物，能將有機(jī)質(zhì)中的蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等物質(zhì)再分解為植物極易吸收的氨基酸、脂肪酸、多肽等，提高作物吸收養(yǎng)分的能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
[0009]2、促進(jìn)作物體內(nèi)酶的合成，按作物的生長(zhǎng)需要制造養(yǎng)分，有效抑制病原菌，使土壤根際微生物恢復(fù)平衡，從而達(dá)到抑制有害菌，防病，健株，增產(chǎn)的效果。
[0010]3、提高作物體內(nèi)多種酶的活性，使作物新陳代謝旺盛，糖分，干物質(zhì)積累增加，增強(qiáng)作物抗病能力，大幅提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0011]4、促使有益微生物在作物根部繁殖，從而活化土壤，使土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，釋放增加土壤的有效成分，提高肥料利用率和土壤肥力，防止土壤板結(jié)，改善根際環(huán)境，分解農(nóng)藥殘留，酚、激素、烴類，抑制腐霉菌、鐮刀菌、線蟲(chóng)等病害的發(fā)生。
[0012]5、能快速促進(jìn)作物根際`細(xì)胞分裂，生新根，增加根量，提高根系活力，形成強(qiáng)壯根系，并有顯著的生根，養(yǎng)根，保根效果，有效解決爛根，生根緩慢，使作物生長(zhǎng)健壯。
[0013]6、羥基類固醇脫氫酶系可促進(jìn)作物增殖過(guò)氧化氫酶和幾丁質(zhì)酶，過(guò)氧化氫酶是一種保護(hù)性酶，對(duì)植物抗病起積極的作用，可使作物感病后整體獲得抗病性，幾丁質(zhì)酶可分解真菌、細(xì)菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，使真菌、細(xì)菌細(xì)胞壁被分裂而死亡，幾丁質(zhì)還可活化作物細(xì)胞，啟動(dòng)作物免疫系統(tǒng)，極大的增強(qiáng)作物對(duì)外界不良環(huán)境的抵御能力。
[0014]7、刺激有機(jī)質(zhì)釋放營(yíng)養(yǎng)，豐富的有機(jī)質(zhì)是通過(guò)酶活動(dòng)后，可不斷釋放出植物所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，達(dá)到肥效持久的目的，松土保肥，改善環(huán)境，達(dá)到肥力持久等顯著效果。
[0015]技術(shù)先進(jìn)性:
一、睪丸酮叢毛單胞菌是人體、動(dòng)物體、土壤中存在的菌，(屬胞內(nèi)酶)羥基類固醇脫氫酶，具有降解許多難以降解化合物的能力，我們多年研究發(fā)現(xiàn)，該菌所產(chǎn)生的酶系，能強(qiáng)力分解動(dòng)、植物蛋白質(zhì)、留體激素，烴類、苯酚、壬基酚等有害物質(zhì)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)羥基類固醇脫氫酶能顯著改良土壤與微生物結(jié)構(gòu)，促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，是一種理想抗作物重茬，防土壤板結(jié)，土壤通氣性好，增產(chǎn)的新型酶制劑。
[0016]二、羥基類固醇脫氫酶在農(nóng)業(yè)上具有很高的應(yīng)用價(jià)值，但是該菌中的酶對(duì)污染物及相應(yīng)底物的消化降解，轉(zhuǎn)化，速度很緩慢，限制了該菌(酶)在土地生物修復(fù)，如果單靠自然界中該菌繁殖量十分有限，因此產(chǎn)酶稀少，很難發(fā)揮作用，因此開(kāi)發(fā)羥基類固醇脫氫酶具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0017]三、要真正使羥基類固醇脫氫酶發(fā)揮顯著效果，首先要對(duì)發(fā)酵菌種的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、發(fā)酵培養(yǎng)基、酶的提取等一系列技術(shù)進(jìn)行深入研究，否則是不會(huì)產(chǎn)生效果的，因該菌是野生型菌株，所產(chǎn)的酶屬胞內(nèi)低溫酶系，要想得到有效、有價(jià)值、低成本的酶，首先要看發(fā)酵液中活的菌體是多少，利用原野生菌種發(fā)酵后，每毫升發(fā)酵中只有一億個(gè)活菌，本發(fā)明經(jīng)多年不間斷的努力，千次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中的活菌體由原來(lái)的每毫升一億個(gè)提高到三百億個(gè)，提高了三百倍，我們選用了近100種該酶降解底物，最后反復(fù)篩選出三種底物能全面誘導(dǎo)該酶系酶大幅提高，由原來(lái)的每克干粉中1000個(gè)酶活上升到現(xiàn)在的每克干粉30萬(wàn)個(gè)酶活，大大降低了生產(chǎn)成本，可進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，這是我們從各種培養(yǎng)基的研究，發(fā)酵PH值，滅菌時(shí)間，原材料配比，接種量，發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速，通風(fēng)量(因是好氧菌)等，進(jìn)行了全面探索、研究的成果。
[0018]四、生產(chǎn)該酶所使用的菌種市售可得菌號(hào):ATCC11996
五、生產(chǎn)所使用的設(shè)備:發(fā)酵罐、管式離心機(jī)、粉碎機(jī)、預(yù)混合機(jī)、真空干燥箱、真空冷凍干燥機(jī)、生化培養(yǎng)箱、搖床、超凈工作臺(tái)、鼓風(fēng)干燥箱、醫(yī)用壓力消毒器【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
無(wú)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明的一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其包含如下步驟:
菌種培養(yǎng):
購(gòu)進(jìn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)，首先配置LB培養(yǎng)基、蛋白胨10克，酵母浸粉5克、氯化鈉5克、水1000毫升，PH值自然
操作:將以上蛋白胨等原料不分前后順序投入到配方中的水中攪拌溶解后分裝于多個(gè)直徑25mm，長(zhǎng)度200mm的試管中，每管裝5毫升，放醫(yī)用消毒器中0.12—0.14兆帕滅菌20分鐘，培養(yǎng)基滅菌完畢
接種:在無(wú)菌條件下打開(kāi)購(gòu)進(jìn)的凍干管菌種，然后向里面加入以上滅菌好的培養(yǎng)基I毫升，搖動(dòng)溶化后備用，此稱為凍干管菌懸液，然后取上面滅好菌的培養(yǎng)基5毫升，在無(wú)菌條件下打開(kāi)試管，然后向試管中加入溶化好的凍干管菌懸液0.3毫升，重新將試管密封好，放搖瓶機(jī)中，27-31 °C，150-210轉(zhuǎn)/分鐘，8_40小時(shí)即可，此稱擴(kuò)大菌種液一、一級(jí)種子培養(yǎng):
配方:培養(yǎng)基各組分的重量百分比
酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化鈉 0.1% — 0.3%
植物甾醇 0.01%—0.15% 維生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸銨 0.25%—0.5%
余量為水PH值自然
操作:
將上述原料稱好后不分 前后的倒入配方中的水中，開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)攪拌20分鐘，此稱為一級(jí)種子培養(yǎng)液
將攪拌好的一級(jí)種子培養(yǎng)液量取所用量加入到三角瓶中，然后8層紗布外加一層牛皮紙?jiān)?，放入醫(yī)用高壓鍋中滅菌，滅菌前首先打開(kāi)消毒器上的排氣閥，等有少量蒸汽排出時(shí)關(guān)閉，當(dāng)消毒器壓力達(dá)到0.05兆帕?xí)r，打開(kāi)排氣閥門排氣6-8分鐘，然后關(guān)閉排氣閥門，繼續(xù)加溫，當(dāng)消毒器中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r開(kāi)始計(jì)時(shí)，滅菌時(shí)間20分鐘，完畢后讓其自然降溫，當(dāng)消毒器上的壓力表歸零時(shí)，打開(kāi)消毒器，取出滅菌的培養(yǎng)基，將裝有培養(yǎng)基的三角瓶放超靜工作臺(tái)中降溫，當(dāng)溫度降到27-31°C時(shí)，在無(wú)菌條件下將上述培養(yǎng)好的擴(kuò)大菌種液接到三角瓶中去，接種量為2%為宜，即一級(jí)種子培養(yǎng)液100毫升,擴(kuò)大菌種液為2暈升，完畢后放搖瓶機(jī)中溫度27-31°C、150-210轉(zhuǎn)/每分鐘，6_20小時(shí)即可，此稱為一級(jí)菌種液。
[0020]發(fā)酵設(shè)備的管道及無(wú)菌空氣過(guò)濾系統(tǒng)的滅菌
操作:打開(kāi)各進(jìn)出管道的閥門及無(wú)菌空氣管道閥門，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，讓蒸汽與管道閥門聯(lián)通并有蒸汽排出，通氣10分鐘，然后關(guān)閉各排氣閥門，讓管道內(nèi)蒸汽壓力保持0.12-0.14兆帕，保持40分鐘。
[0021]種子罐及發(fā)酵罐的空罐滅菌
關(guān)閉各個(gè)閥門，打開(kāi)罐夾層的排污閥門，打開(kāi)直接蒸汽閥門向罐內(nèi)通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，當(dāng)罐內(nèi)達(dá)到121°C 土1°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，滅菌時(shí)間為40分鐘，然后關(guān)閉罐底部排污閥，罐中溫度降到25°C _35°C之間備用。
[0022]種子罐培養(yǎng):
配方:培養(yǎng)基各組分的重量百分比
酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化鈉0.15%—0.3%
植物甾醇0.1%—0.3% 維生素D3 0.02%—0.2% 硫酸銨0.2%—0.6%
余量為水PH值自然
具體操作:
首先將配方中所使用的水投入到已滅菌的種子罐中，然后開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)，分別加入配方中所需的原料(加入順序不分前后)，通入蒸汽加熱，利用夾層蒸汽加熱到95°C時(shí)，再改用直接蒸汽加熱，當(dāng)罐中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r，保溫35分鐘達(dá)到滅菌效果，然后關(guān)閉蒸汽，開(kāi)始降溫，當(dāng)罐中溫度降到27-31°C時(shí)備用，此稱為種子罐培養(yǎng)。將以上培養(yǎng)好的一級(jí)菌種液在無(wú)菌條件下接種到種子罐中，接種量是罐內(nèi)培養(yǎng)基的1%，即100公斤種子罐培養(yǎng)基接入一級(jí)菌種液I公斤，然后蓋好罐上的接種帽，開(kāi)始無(wú)菌通風(fēng)培養(yǎng)，無(wú)菌空氣用量為每100公斤種子培養(yǎng)基每分鐘用無(wú)菌空氣0.05立方，PH值自然，攪拌速度140轉(zhuǎn)/每分鐘，罐壓0.05兆帕，溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間10小時(shí)即可，此稱為種子罐菌種液發(fā)酵罐培養(yǎng)
配方:培養(yǎng)基各組分的重量百分比
酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化鈉0.1%—0.5%
植物甾醇0.1%—0.4% 維生素D3 0.01%—0.1%硫酸銨0.2%—0.7%
維生素E 0.01%—0.15% 余量為水PH值自然
具體操作:
首先將配方中所需用的水投入到已滅菌的發(fā)酵罐中，然后開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)，向發(fā)酵罐中投入配方中的各種材料(加入順序不分前后)，然后通入蒸汽加熱，利用夾層蒸汽加熱到95°C后再改用直接蒸汽加熱，當(dāng)罐中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r，保溫25分鐘即可達(dá)到滅菌效果，然后開(kāi)始降溫，當(dāng)罐中溫度降至30°C時(shí)，開(kāi)始接入菌種，接種時(shí)首先提高種子罐的罐壓力，達(dá)到0.1兆帕，發(fā)酵 罐壓力維持在0.05兆帕，然后打開(kāi)接種管道的閥門，將種子罐培養(yǎng)好的菌液輸送到發(fā)酵罐中去，然后關(guān)閉接種管道閥門開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度27-31°C、80-140轉(zhuǎn)/每分鐘，通風(fēng)量每100公斤培養(yǎng)液每分鐘通入無(wú)菌空氣，前5小時(shí)0.07立方米，5小時(shí)至發(fā)酵完畢是0.1立方米，PH值自然，發(fā)酵時(shí)間為16-24小時(shí)結(jié)束。
[0023]離心收集菌體:
采用管式離心機(jī)，8000-16000轉(zhuǎn)/每分鐘，控制流量每小時(shí)1000公斤，棄上清，收集濕菌體(泥)
羥基類固醇脫氫酶的破壁提取:
將收集的濕菌體(泥)按I公斤濕菌體加水5公斤，攪拌均勻制成菌懸液，然后加入總重量0.01%溶菌酶和0.02%的蝸牛酶，在4°C一35°C的條件下攪拌I小時(shí)，然后放入_40°C冰凍，直至結(jié)冰凍實(shí)為止，取出后溶化冰，然后再放入_40°C結(jié)冰，這樣反復(fù)3-6次即可達(dá)到破壁提取的最佳效果。
[0024]羥基類固醇脫氫酶的冷凍干燥
向破壁的酶液中加入3-10%的海藻糖、8-20%脫脂奶粉、3-6%的丙三醇、1.5-5%的維生素C、3-10%的麥芽糊精(加入順序不分前后)，在80-160轉(zhuǎn)/每分鐘的條件下攪拌I小時(shí)，然后分裝到冷凍干燥盤中預(yù)凍，預(yù)凍溫度_40°C，時(shí)間5小時(shí)，全部結(jié)冰凍實(shí)為止，然后抽真空干燥，真空度15帕以下,溫度_65°C,凍干時(shí)間一般在40—50時(shí)之間即可,水分含量3%_5%，然后用低溫粉碎機(jī)粉碎，細(xì)度60-80目，然后將收集粉碎好的凍干酶粉用塑料袋密封好，放入4°C冰箱中保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0025]上面所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思和范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)思的前提下，本領(lǐng)域中普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變`型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)內(nèi)容，已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書中。
【權(quán)利要求】
1.一種采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其特征在于包含如下步驟: 配制LB培養(yǎng)基:將10克蛋白胨，5克酵母浸粉和5克氯化鈉不分前后順序投入到1000毫升水中，PH值自然,攪拌溶解后分裝于多個(gè)直徑25mm,長(zhǎng)度200mm的試管中，每個(gè)試管中裝5毫升，將所述多個(gè)試管放醫(yī)用消毒器中，采用0.12-0.14兆帕滅菌20分鐘； 接種:在無(wú)菌條件下打開(kāi)凍干管睪丸酮叢毛單胞菌種，然后向所述凍干管睪丸酮叢毛單胞菌種里面加入以上滅好菌的LB培養(yǎng)基I毫升，搖動(dòng)溶化后制得凍干管菌懸液備用，然后取上面滅好菌的培養(yǎng)基5毫升，在無(wú)菌條件下打開(kāi)試管，并向試管中加入所述凍干管菌懸液0.3毫升，重新將試管密封好，放搖瓶機(jī)中搖動(dòng)制得擴(kuò)大菌種液； 一級(jí)種子培養(yǎng): 一級(jí)種子培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為: 酵母浸粉 0.15%—0.25% 蛋白胨 0.25%—0.45% 氯化鈉 0.1% — 0.3% 植物甾醇 0.01%—0.15% 維生素 D3 0.01%—0.15% 硫酸銨 0.25%—0.5% 余量為水PH值自然 將所述一級(jí)種子培養(yǎng)基配方中的各原料不分前后順序的加入所述一級(jí)種子培養(yǎng)基配方的水中，開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)攪拌制得一級(jí)種子培養(yǎng)液；將所述一級(jí)種子培養(yǎng)液量取所用量加入到三角瓶中，封口后滅菌，將裝有經(jīng)過(guò)滅菌的培養(yǎng)液的三角瓶放超靜工作臺(tái)中降溫，當(dāng)溫度降到27-31°C時(shí)，在無(wú)菌條件下將所述培養(yǎng)好的擴(kuò)大菌種液接到三角瓶中去，100毫升一級(jí)種子培養(yǎng)液接入的擴(kuò)大菌種液為2毫升，完畢后放搖瓶機(jī)中，制得一級(jí)菌種液； 將發(fā)酵設(shè)備的管道、無(wú)菌空氣過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行滅菌處理，以及將種子罐及發(fā)酵罐進(jìn)行空罐滅菌處理； 種子罐培養(yǎng): 種子罐培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為: 酵母浸粉0.1%—0.4% 蛋白胨0.2%—0.5% 氯化鈉0.15%—0.3% 植物甾醇0.1%—0.3% 維生素D3 0.02%—0.2% 硫酸銨0.2%—0.6% 余量為水PH值自然 將所述種子罐培養(yǎng)基配方中的各原料不分前后順序的加入所述種子罐培養(yǎng)基配方的水中，經(jīng)過(guò)高溫滅菌及降溫處理后，將所述培養(yǎng)好的一級(jí)菌種液在無(wú)菌條件下接種到經(jīng)滅菌處理的種子罐中，100公斤種子罐培養(yǎng)基接入所述一級(jí)菌種液的量為I公斤，然后蓋好罐上的接種帽，通過(guò)無(wú)菌通風(fēng)培養(yǎng)制得種子罐菌種液； 發(fā)酵罐培養(yǎng): 發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中各組分的重量百分比為: 酵母浸粉0.1%—0.3% 蛋白胨0.15%—1.5% 氯化鈉0.1%—0.5% 植物甾醇0.1%—0.4% 維生素D3 0.01%—0.1% 硫酸銨0.2%—0.7% 維生素E 0.01%—0.15%余量為水PH值自然 首先將所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的水投入到經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵罐中，然后開(kāi)動(dòng)攪拌機(jī)，向發(fā)酵罐中不分前后順序的加入所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方中的各原料，經(jīng)過(guò)高溫滅菌及降溫處理后，接入菌種，開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)； 羥基類固醇脫氫酶的破壁提取:首先采用管式離心機(jī)，8000-16000轉(zhuǎn)/每分鐘，控制流量每小時(shí)1000公斤，棄上清，收集濕菌體；然后將收集的濕菌體按I公斤濕菌體加水3-10公斤，攪拌均勻制成菌懸液，再加入總重量為0.01-0.1%的溶菌酶和0.02-0.2%的蝸牛酶，在4°C一35°C的條件下攪拌I小時(shí)，然后放入-40°C冰凍，直至結(jié)冰凍實(shí)為止，取出后溶化冰，然后再放入_40°C結(jié)冰，這樣反復(fù)3-6次即可達(dá)到破壁提取所述羥基類固醇脫氫酶的最佳效果。
2.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述擴(kuò)大菌種液是在27-31°C的溫度下，采用150-210轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，在搖瓶機(jī)中搖動(dòng)8-40小時(shí)制得。
3.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述一級(jí)種子培養(yǎng)液的滅菌，是將所述一級(jí)種子培養(yǎng)液放入醫(yī)用高壓鍋中滅菌，滅菌前首先打開(kāi)消毒器上的排氣閥，等有少量蒸汽排出時(shí)關(guān)閉，當(dāng)消毒器壓力達(dá)到0.05兆帕?xí)r，打開(kāi)排氣閥門排氣6-8分鐘，然后關(guān)閉排氣閥門，繼續(xù)加溫，當(dāng)消毒器中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r開(kāi)始計(jì)時(shí)，滅菌時(shí)間20分鐘，完畢后讓其自然降溫，當(dāng)消毒器上的壓力表歸零時(shí)，打開(kāi)消毒器，取出滅菌后的培養(yǎng)液。
4.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述一級(jí)菌種液是在27-31°C的溫度下，采用搖瓶機(jī)在150-210轉(zhuǎn)/每分鐘的轉(zhuǎn)速下，搖動(dòng)6-20小時(shí)制得。
5.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述發(fā)酵設(shè)備的管道及無(wú)菌空氣過(guò)濾系統(tǒng)的滅菌是通過(guò):打開(kāi)各進(jìn)出管道的閥門及無(wú)菌空氣管道閥門，通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，讓蒸汽與管道閥門聯(lián)通并有蒸汽排出，通氣10分鐘，然后關(guān)閉各排氣閥門，讓管道內(nèi)蒸汽壓力保持0.12-0.14兆帕，保持40分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述種子罐及發(fā)酵罐的空罐滅菌是通過(guò):關(guān)閉各個(gè)閥門，打開(kāi)罐夾層的排污閥門，打開(kāi)直接蒸汽閥門向罐內(nèi)通入0.12-0.14兆帕的蒸汽，當(dāng)罐內(nèi)達(dá)到121°C ±1°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，滅菌時(shí)間為40分鐘，然后關(guān)閉罐底部排污閥，罐中溫度降到25°C _35°C之間備用。
7.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述種子罐培養(yǎng)程序中的高溫滅菌及降溫處理，是:通入蒸汽加熱，利用夾層蒸汽加熱到95°C時(shí)，再改用直接蒸汽加熱，當(dāng)罐中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r，保溫35分鐘達(dá)到滅菌效果，然后關(guān)閉蒸汽，開(kāi)始降溫，當(dāng)罐中溫度降到30°C時(shí)備用。
8.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述通過(guò)無(wú)菌通風(fēng)培養(yǎng)制得種子罐菌種液的過(guò)程中，無(wú)菌空氣用量為每100公斤種子培養(yǎng)基每分鐘用無(wú)菌空氣0.05立方，PH值自然，攪拌速度80-180轉(zhuǎn)/每分鐘，罐壓0.05兆帕，溫度27-31°C，培養(yǎng)時(shí)間6-20小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中的高溫滅菌及降溫處理是:通入蒸汽加熱，利用夾層蒸汽加熱到95°C后再改用直接蒸汽加熱，當(dāng)罐中蒸汽壓力達(dá)到0.12-0.14兆帕?xí)r，保溫25分鐘即可達(dá)到滅菌效果，然后開(kāi)始降溫，當(dāng)罐中溫度降至27-31°C時(shí)。
10.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述發(fā)酵罐培養(yǎng)步驟中，所述接入菌種的過(guò)程為:接種時(shí)首先提高種子罐的罐壓力，達(dá)到0.1兆帕，發(fā)酵罐壓力維持在0.05兆帕，然后打開(kāi)接種管道的閥門，將種子罐培養(yǎng)好的菌液輸送到發(fā)酵罐中去，然后關(guān)閉接種管道閥門。
11.如權(quán)利要求1所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度27-3--、80-140轉(zhuǎn)/每分鐘，通風(fēng)量每100公斤培養(yǎng)液每分鐘通入無(wú)菌空氣，前5小時(shí)0.07立方米，5小時(shí)至發(fā)酵完畢是0.1立方米，PH值自然，發(fā)酵時(shí)間為16-24小時(shí)結(jié)束。
12.如權(quán)利要求1-11任一權(quán)利要求所述的采用睪丸酮叢毛單胞菌高效生產(chǎn)羥基類固醇脫氫酶的方法，其中羥基類固醇脫氫酶的冷凍干燥方法為，向破壁的羥基類固醇脫氨酶液中不分前后順序的加入重量比為3-10%的海藻糖、8-20%的脫脂奶粉、3-6%的丙三醇、.1.5-5%的維生素C和3-10%的麥芽糊精，在80-160轉(zhuǎn)/每分鐘的條件下攪拌I小時(shí)，然后分裝到冷凍干燥盤中預(yù)凍，預(yù)凍溫度_40°C，時(shí)間5小時(shí)，全部結(jié)冰凍實(shí)為止，然后抽真空干燥，真空度15帕以下,溫度_65°C,凍干時(shí)間一般在40—50小時(shí)之間即可,水分含量3%_5%，然后用低溫粉碎機(jī)粉碎，細(xì)度60-80目，然后將收集粉碎好的凍干酶粉用塑料袋密封好，放入4°C冰箱中保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103805577SQ201310353000
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】張起凡 申請(qǐng)人:濟(jì)南環(huán)億生物科技有限公司