專利名稱：：用于hla-drb1基因分型檢測的試劑盒的制作方法用于HLA-DHM基因分綴檢剝的試擁盒所屬技術領壤本發(fā)明涉及一種基因檢測試劑盒，特別是涉及采用DNA微陣列和雙溫度雜交技術對人類白細胞抗原基因進行檢測和分型的試劑盒及其制備和使用方法。
背景技術：
：HLA(Humanleukocyteantigei^人類白細胞抗原)是人類主要組織相容性系統(tǒng)。組織相容性是指不同個體間進行組織或器官移植時，供者和受者雙方接受的程度。供受者組織不相容引起的反應，被證實是一種免疫反應，它是由細胞表面同種異型抗原誘導的，這個代表個體特異性的抗原稱移植抗原或組織相容性抗原，其中起主要作用的抗原稱主要組織相容性系統(tǒng),S),HLA(人類白細胞抗原)就是人類的主要組織相容性系統(tǒng)。HLA基因復合體位于人類第6號染色體621.3區(qū)域，具有高度單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。HLA存在多個基因座位,其中HLA-DRB1座位是影響移植排斥反應的主要作為之一。SNPs是決定組織相容性的本質因素，個體之間的SNPs差異程度決定著相容性程度。HLA-DRB1基因座位的SNPs主要集中在第二外顯子長度約300bp的片段上。根據(jù)SNPs的差異特點，可以進行基因分型，將HLA-DRB1基因座位分成不同的型別和亞型，型別和亞型相同者，SNPs差異較小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技術廣泛應用于itm干細胞移植、器官移植、疾病關聯(lián)研究。HLA-DRB1基因分型方法是從卯年代開始發(fā)展起來的，目前主要包括PCR-SSP(PCR-序列特異性弓l物法)、PCR-SSOP(PCR-序列特異性寡核苷酸探針法)、SBT(測序法)、FCM(流式法)方法。這些方法目前被西方國家的少數(shù)企業(yè)壟斷，我國處于空白狀態(tài)，完全依賴進口。同時，這些方法也存在一些技術問題，比如引物過多造成檢測錯誤、探針雜交單一溫度造成特異性降低、檢測通量過小等等。DNA微陣列法是近幾年發(fā)展起來的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、集約化、低成本、高準確性辦點，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業(yè)化前景。由于用該技術可以將極其大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序(Sequenciiigbyhybridization^SBH)等，為"后基因組計劃"時期基因功能研究及現(xiàn)代醫(yī)學科學、醫(yī)學診斷學的發(fā)展提供了強有力的工具，現(xiàn)有的DNA微陣列法都是采用皿度雜交法，單溫度雜交，成部分探針雜交特異性降低，這是方法學上自身畫有的缺點。本發(fā)明是采用雙溫雜交DNA微陣列的方法對HLA-DRB1進行基因分型檢測的試劑盒，不但解決了基因型的通量問題，也解決了單溫雜交的特異性問題。發(fā)明肉容本發(fā)明的一個目的是提供一種用于人類白細胞抗原基因進行檢測和分型的試劑盒，特征在于采用DNA微陣列和雙溫度雜交技術針對HLA-DRB1基因座位的第二外顯子，設計二套特異性寡核苷酸探針(表1)，采用自動點樣機器人，將二套探針印制在兩張玻片的特定區(qū)域，每張玻片印制16個微陣列矩陣，制成高密度DNA微陣列。如此制得的二張芯片可以檢測16個樣本，再配以本領域技術人員熟知其它必要的組份，即得到用于HLA-DKB1基因分型檢測的試劑盒。實際檢測時，取16份人基因組DNA溶液，采用CY3標記引物和不對稱PCR方法(PCR弓l物見表2)，擴增出人基因組HLA-DRB1基因的第二外顯子單鏈CY3標記片段。然后，取DNA微陣列玻片一對，在第一張玻片的16個雜交區(qū)域，分別加入16種PCR產物和雜交液在第二張玻片的對應區(qū)域，加入同樣的成分。再將一對玻片放在自動雜交洗滌儀的兩個雜交槽內，分別將第一、二張玻片的雜交溫度設定為521C和45X:(521C和451C是經(jīng)過實驗驗證適合所有HLA-DRB1分型探針的核實溫度)，雜交時間30分鐘后，自動洗滌吹干。然后取出玻片，放入掃描儀(Ge加Pix41加A)進行掃推，使用分析軟件對掃描圖像信號進行圖像數(shù)據(jù)轉換處理后，分析產生樣本基因型別結果，本發(fā)明的試劑盒采用高密度DNA微陣列技術進行人類白細胞抗原基因進行檢測和分型，可以大大提髙檢測通量，每二張玻片可以制備用于檢測16個樣本的DNA微陣列，一般是現(xiàn)有檢測技術的10倍以上同時，由于采用了雙片雙溫度雜交的特殊方法，避免了現(xiàn)有產品因為雜交溫度不適造成的探針雜交結果假陽性和假陰性問題，大大提高了產品的特異性。表lHLA-DRB1基因分型探針<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>D31CCTOATGCCGAGTACTO17D32GTTCCTGGAGAGATAC16D33GAGAGACACTTCCATAAC17表2PCR引物序列名稱序列(5'-3')堿基數(shù)特異性PI-1TTCTGGCAGCTTMGTTTGMT22特異性擴增HLA-D腿l柏l艱.Pl-2TCTCCCCACAGCACGTTTCC21特異性擴增HLA-DRB1*07,15，16SPl-3TCAGGAGGCCGCCTGTGTCACT22特異性擴增HLA-DRB1*03,08,11,12,13,14飛Pl-4TCTTCCCCGGAGGCCGCTTCTGTA23特異性擴增HLA-D腿l的4艱Pl-5CGTTOTTCMGCAGGATMGTT23特異性擴增HLA-DRB論刑Pl~6GTTTCTTGGAGGAGGTTMGTT22特異性擴增HLA-D肪W(wǎng)IO荊P2TCGCCGCTCCACTGTCAAG19擴增HLA-DRM所有艱以下結合本發(fā)明的具體實施方式.附闞說明附圖1HLA-DRB1基因分型DNA微陣列雜交區(qū)和探針微陣列示意圖本發(fā)明用下列實施例進行解釋，目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施樹1:HLA-DRB1基因分型DNA微陣列PCR引物和寡核苷酸探針的設計和合成為了采用特異性PCR擴增HLA-DRB1基因座位的第2外顯子，分別在第1內含子末端至第2外顯子的始端位置,設計特異性5'引物Pl-1,PI-2,PI-3,PI-4,PI-5和PI-6,以及在第2外顯子末端位置設計3'共用引物P2。(引物序列見
發(fā)明內容的表2)針對HLA-D冊1第2外顯子基因序列的多態(tài)性，設計33種分型探針，探針分為兩組(見
發(fā)明內容的表1),第一組24種探針，雜交溫度為52t:;第二組9種探針，雜交溫度45"C。實施倒2:HLAH1RB1基因分型0NA像陣列的制備采用基因芯片自動點樣儀，將33種分型探針和兩種對照探針點制到玻片的特定區(qū)域，制成DNA微陣列。(1)點樣探針溶液將探針稀釋到5XSSC、0.05鄉(xiāng)DS溶液中，終濃度為30uM;(2)點樣矩陣(如圑l)將探針分成二組，第一組24種分型探針，2種對照探針。第一組探針點制在第一張玻片上，分成16個雜交區(qū)，雜交區(qū)按照2列8行排列。在每個雜交區(qū)內，探針的排列方式是每種探針重復3點，每行3種探針，9點，共9行，第9行只有2種對照，6點。第二組9種分型探針，2種對照探針。排列方式同上，共4行，其中第4行只有2種對照，6點。實簾倒3,采用HLA-鵬1基因分型糊及銷果分析取16份已知基因型別的DNA樣本，采用CY3標B的PCR引物，上下游引物1:30(分子數(shù)比)不對稱PCR方法，PCR循環(huán)參數(shù)為941C5，；94"30"，58"30，，,72*C30，，，40循環(huán)；721C5，。取一對微陣列玻片，分別取16種PCR產物各2ul加到第一片的16孔和第二片的16孔，再在各孔加入雜交液(5XSSC)8ul，玻片放到自動雜交洗滌儀的2個槽內，設定雜交溫度第一片的52C,第二片451C。雜交時間40騰。雜交后自動洗滌和風干。采用GnenPix4100A掃描儀，掃描雜交信號，得到雜交結果掃描圖，并將圖像轉換成數(shù)據(jù)。采用分析軟件，將以上數(shù)據(jù)自動分析轉換成為各個樣本的基因型別，檢測結果與樣本原基因型別完全相符。見表3。實施例說明了本發(fā)明產品在檢測通量方面的優(yōu)勢(一次檢測16個樣本)和檢測準確性方面的可靠性(檢測結果與原樣本結果完全相符)。表3使用本發(fā)明試劑盒的檢測結果與樣本真實基因型的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序判表<110>中山大學安達基閃股份有限公司<120>HLA-DRB1基因分型用微陣列芯片的制備及其用法<140><，41><,40<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作PCR擴增的引物,<400>1TO鵬CAfiCTTMGTTTGAAT<2!0>2<211>20<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCRT增的引物,<40O>2TGTCCCCACAGCACGTTTCC<210>3<2">22<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作PCR擴增的引物,<40O3TCAGGAGGCCGCOTTGTGACT<210>4<2，1>24<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCRT增的引物。<400>4TCTTOCCGGAGGCCGCTTCTGTA<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物,<400>5CGTTTCTTCMGCAGGATMGTT<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核普酸序判設計，以用作PCRT增的引物,<400>6GTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTT<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核哲酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400>7TCGCCGCTGCACTGTGMG<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡ftWS6探針。<400>gTGCTGGGGATOCCTC<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核奢酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>9TOGAGCAGGCOCGG<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核營酸探針。<400>10GCCTAAGAGGGAGTOTC<2">16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>11AGAAGCGGGGCCGGOT<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核普酸探針,<400>12GTACTCTACGTCTGAGT<211>17<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷,針。<400>13GAGCAGGTTAAACATGA<210>14<211>18<212>DNA<213>AXff'判<220><223>根據(jù)特定核ff酸序列設計，以用作寡核昔酸探針。<400>14CCTGATCCGGAGTACTOG<210>15<211>,7<212>DNA<2i3>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針,<400>15CTCmCGGOTGAGTCTT<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>16GTTCCTOGAGAGACACTT<210>17<2">16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>17GGAAGACGAGCGGGCC<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>18CCTGCGTCGGAGCACTG<210>19<211>16<212>DNA<213>人工序列<220<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針,<400>19GGAAGACGOGCGGGCC<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>《23>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>20GCAGGGTAAGTATAAGTG<210>21<211>16<2，2>DNA<213>人工序列<223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作寡核苷酸探針,<400>21GCGGGCCCTGGTGGAC<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根lg^定核苷酸序判設計，以用作寡核苷酸探針。<400>22TGCGGTATCTGCACAGA<210>23<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作寡核苷酸探針。<400>23AGACGCGTCCATAACC<210>24，>16<212>DNA<2!3>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核香酸探針。<400>24AGACGCATCCATAACC<210>25<2">16<212>DNA<213>人工序列<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>25GCGGGCCCTOGTGGAC<210>26<211>18<212>DNA<213>人IL序列<220<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針,<400>26GCGGTATCTGCACAGAGG<2，0>27<211>18<212>DNA<213>人工序判<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>27GAAAGACGCGTCCATAAC<210>28<211>19<212>DNA<2，3>AX序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷,針。<400>28GCCTCCTGGAAGACAGGCGO<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<4,29CAGAAGGACCTCCTOGA<210>30<2">17<212>DNA<213>人Xff判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<4,30CCAGGAGGAGTTCGTGC<2">18<213>人XIT'列<223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作寡核苷酸探針。<400>31ATAACCAGGAGGAGAACG<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>3215GCCTAGCGCCGAGTACTO<2，0>33<2">16<212>DNA<2，3>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>33CTACGGOOCTOTGGAG<210>34<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序判設計，以用作寡核苷酸探針。<400>34GACATCCTGGAGGACA<210>35<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核，序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>35CTACGGGGCTGTGOAG<210>36<2">17<212>DNA<213>人工序列<220><223>極據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>36GACATCCTOGAGGACAG<210>37<211>17々12>DNA<2!3>人x/r'判<2》<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡^t酸探針,<400>37GTGCGGTACCTOGACAG<210>38<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>38CCTGATGCCGAGTACTO<210>39<211>16<212>ONA<213>人工序判<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針,<400>39GTTCCTGGAGAGATAC<21C>40<211>18<212>DNA<213>人工序判<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作寡核苷酸探針。<400>40GAGAGACACTTCCATAAC權利要求1、一種用于HLA-DRB1基因分型檢測的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括由載有寡核苷酸探針的在兩張玻片構成的DNA微陣列芯片，并且雜交過程是在兩個不同的溫度下進行的。2、基于權利要求1所述的試擁盒，其特征還在于對同一樣本的檢測在兩張DNA微陣列玻片上的兩個雜交區(qū)進行。3、基于權利耍求1所述的試劑盒，其特征還在于所^是擴增HLA-DRB1第二外顯+得到的7個特異性引物(Pl-l-Pl-7)和一個公用引物(P2):IM4TTGTGOCAGCTTAAGTTTGAATPl-2TGTCCCCACAGCACGTTTCCPl-3TCAGGAGGCCGCCTGTGTGACTP14TCTTCCCCGGAGGCCGCTTCTOTAPl-5CGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTPl_6GTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTTP2TCGCCGCTGCACTGTGAAO。4、根據(jù)權利耍求1所述的試劑盒，其特征還在于該試劑盒用于臨床移植配型和造血干細胞庫HLA-DRB1基因分型檢測，全文摘要本發(fā)明涉及一種臨床檢測用途的基因檢測試劑盒，尤其是涉及采用DNA微陣列芯片以及雙溫度雜交探針，能夠高通量、高效率、高特異性對人類白細胞抗原基因進行檢測分型的試劑盒及其用法。文檔編號C12Q1/68GK101314790SQ20071002828公開日2008年12月3日申請日期2007年5月30日優(yōu)先權日2007年5月30日發(fā)明者何蘊韶,帆張,鋼程,胡守旺,順胥申請人:中山大學達安基因股份有限公司