專利名稱：非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，簡稱BSP)是細胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，其組織分布具有局限性，分布在礦化組織，包括骨、牙齒和鈣化的軟骨等，主要由成骨細胞、破骨細胞以及軟骨細胞表達和分泌。骨唾液酸蛋白參與組織礦化，與多種骨代謝性疾病有關(guān)，近年來又發(fā)現(xiàn)BSP與腫瘤的骨轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化及血管增生有關(guān)。為了深入研究BSP的生物活性，必須獲得穩(wěn)定的BSP?？蓮膭游锘蛉斯侵刑崛SP，但來源有限，且提純的方法繁瑣，因此，利用基因工程技術(shù)表達重組BSP對于研究BSP的結(jié)構(gòu)與功能有重要意義。
目前在原核表達系統(tǒng)中要表達全長BSP還存在問題，只能得到一些具有空間折疊的未修飾的BSP片段，功能也比天然BSP分子要弱。在真核細胞中已經(jīng)表達出全長BSP，但除了本申請人，應(yīng)用酵母表達系統(tǒng)來表達rBSP還未見報道。本申請人曾將人BSP基因克隆到畢赤酵母表達載體pPICZαA上，以融合蛋白的形式表達重組BSP。但是，融合蛋白上短肽尾巴的加入可能會改變蛋白的折疊形式，從而影響蛋白的生物活性和功能。其次，由于重組BSP糖基化程度較高，含有大約一半的碳水化合物，難于獲取結(jié)晶，不適于用X射線衍射和磁共振(NMR)分析其結(jié)構(gòu)。因此，亟需建立能獲得BSP非融合表達蛋白的基因工程方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非融合骨唾液酸蛋白的表達載體，研究結(jié)果可為進一步研究BSP的結(jié)構(gòu)和功能以及放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一目的在于提供非融合骨唾液酸蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的一種非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體pPICZαA-2×hbsp，通過以下步驟獲得1)根據(jù)GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列設(shè)計基因特異性引物
上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’以骨唾液酸蛋白(BSP)基因為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人股骨外膜組織的總RNA中擴增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pB-hbsp；2)根據(jù)畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒pPICZaA及hbsp序列設(shè)計PCR設(shè)計引物上游引物5’-CCG CTCGAG AAA AGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’以重組質(zhì)粒pB-hbsp為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與畢赤酵母表達載體pPICZaA重組，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp，再利用表達載體序列上的一對同尾酶BamH I和Bgl II構(gòu)建含有BSP基因兩個串連的表達盒的質(zhì)粒pPICZαA-2×hbsp。
本發(fā)明提供的非融合骨唾液酸蛋白的制備方法是將表達載體pPICZαA-2×hbsp線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過甲醇誘導(dǎo)表達，獲得重組人骨唾液酸蛋白。
本發(fā)明提供的非融合骨唾液酸蛋白可應(yīng)用在制備單克隆及多克隆抗體中，為深入研究BSP免疫學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)和探索其作為藥物治療靶點的可行性奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的技術(shù)方案細述如下(1)構(gòu)建BSP的克隆質(zhì)粒pB-hbsp根據(jù)GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列設(shè)計基因特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人股骨外膜組織的總RNA中擴增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pB-hbsp。
(2)骨唾液酸蛋白基因的亞克隆應(yīng)用PCR技術(shù)從pB-hbsp重組質(zhì)粒獲得人BSP基因，上游引物5’-CCGCTCGAG AAA AGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’，下游引物5’-GGGGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’。將其克隆到畢赤酵母表達載體pPICZαA上，獲得含人BSP基因的重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp，并對目的基因進行測序。
(3)多拷貝非融合BSP畢赤酵母表達載體的構(gòu)建利用表達載體序列上的一對同尾酶BamH I和Bgl II構(gòu)建含有BSP基因兩個串連表達盒的質(zhì)粒pPICZαA-2×hbsp。
(4)rhBSP畢赤酵母工程細胞的構(gòu)建將含人BSP基因的畢赤酵母表達載體pPICZαA-2×hbsp電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選能表達rhBSP的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，并對轉(zhuǎn)化子進行分析鑒定。
(5)rhBSP的分泌表達及其鑒定將轉(zhuǎn)化子進行搖瓶發(fā)酵，誘導(dǎo)表達rhBSP，并對其進行分析和鑒定。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。


圖1為重組表達載體pPICZαA-2×hbsp的構(gòu)建圖譜圖2為重組載體pPICZαA-2×hbsp的電泳分析(M.λ-Hind III digest DNA分子量標準，0.pPICZαA-hbsp重組質(zhì)粒，1，2.pPICZαA-2×hbsp重組質(zhì)粒)圖3為重組載體pPICZαA-2×hbsp的酶切鑒定(M.λ-EcoT14 I digest DNA分子量標準，1，2.圖2中所對應(yīng)的1，2兩個泳道上的重組質(zhì)粒Kpn I酶切后的電泳圖)具體實施方式
下面列舉具體實施例對本發(fā)明進行說明，有必要在此指出的是以下具體實施例只用于對本發(fā)明作進一步說明，不代表對本發(fā)明保護范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
1.重組載體pB-hbsp的構(gòu)建與鑒定(1)設(shè)計擴增hbsp基因的引物上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’(2)以提取的人股骨外膜組織總RNA為材料，使用Invitrogen公司生產(chǎn)的Superscript One-Step RT-PCR試劑盒，進行RT-PCR擴增第一步，50℃逆轉(zhuǎn)錄30min；第二步，94℃變性2min；第三步，進入PCR循環(huán)，94℃變性20s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重復(fù)35個循環(huán)；第四步，72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物取樣電泳，置于-20℃保存?zhèn)溆?。EcoR I酶切RT-PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系總體積20μl，含ddH2O 7μl，10×buffer H 2μl，EcoR I 1μl，DNA 10μl。將目的基因與質(zhì)粒載體pBluescript II RI(Stratagene公司產(chǎn)品)同時進行瓊脂糖凝膠電泳，大致判斷二者的質(zhì)量比及物質(zhì)的量比，按目的基因與載體之間物質(zhì)的量比3∶1比例混合，進行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積20μl，含T4DNA連接酶1μl，16℃水浴12～16h。重組子轉(zhuǎn)化E.coli-CDH(Invitrogen公司產(chǎn)品)感受態(tài)細胞，從轉(zhuǎn)化板上隨機挑幾個轉(zhuǎn)化子菌落，接種到3ml LB液體培養(yǎng)基中擴增，小量提質(zhì)粒進行電泳和酶切鑒定重組子。以Sph I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。正向連接產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后得到819bp的片段，為pB-hbsp目的質(zhì)粒，而反向連接產(chǎn)物只能切下209bp的小片段。
2.酵母表達載體pPICZαA-hbsp的構(gòu)建與鑒定(1)以pB-hbsp克隆質(zhì)粒為模板，進行人BSP基因的PCR擴增。
設(shè)計的引物序列如下上游引物5’-CCG CTCGAG AAA AGA TTC TCAATG AAAAAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’總反應(yīng)體積50μl，包括PCR緩沖液(含Mg2+)5μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，dNTP 2μl(終濃度為100μmol/L)，擴增模板3μl(約60pg)，ddH2O 34μl，Taq DNA聚合酶1.0μl。PCR反應(yīng)程序94℃變性5min，循環(huán)開始時，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)之后72℃延伸5min，最后冷至4℃。
(2)PCR產(chǎn)物的純化 采用酚氯仿抽提和乙醇沉淀的方法。
(3)純化后的PCR產(chǎn)物雙酶切 先用KpnI單酶切，并對KpnI單酶切后的產(chǎn)物進行純化除鹽，再用XhoI單酶切純化后的產(chǎn)物。經(jīng)過連續(xù)兩次酶切后的產(chǎn)物采用凝膠回收的方法進行回收。
(4)表達載體pPICZαA的雙酶切及其純化 方法同上。
(5)體外連接 反應(yīng)體系總體積25μl，包括目的基因7.5μl，載體片斷5.5μl，10×T4DNA連接酶buffer 2.5μl，T4 DNA連接酶1μl，ddH2O 8.5μl。體系中目的基因與載體之間摩爾比約為8∶1。16℃水浴16h。
(6)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 取-70℃保存的感受態(tài)細胞200μl，冰浴中解凍。加入15μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30min。將管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，放置90s。冰浴冷卻1-2min。加入800μl不含Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，100r/min溫育45min。取200μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞到含有25g/ml Zeocin的低鹽LB固體培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平板，于37℃培養(yǎng)12-16h。從Zeocin(25μg/ml)抗性篩選平板上隨機挑取4個較大的菌落接種至2ml的低鹽LB液體培養(yǎng)基中擴增，提取質(zhì)粒。
(7)電泳與酶切鑒定 以pPICZαA質(zhì)粒作為對照、與重組的pPICZαA-hbsp質(zhì)粒一起進行瓊脂糖凝膠電泳，然后將重組pPICZαA-hbsp質(zhì)粒分別用XhoI、KpnI酶切鑒定。
(8)測序 將重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp交由大連寶生物工程公司測序，發(fā)現(xiàn)與Genebank登陸號NM_004967上的序列比較有99.4％的同源性，而不同的堿基引起的氨基酸改變不在已知的蛋白質(zhì)活性區(qū)域，也不屬于糖基化位點，鑒于可能有測序誤差，認為重組表達載體pPICZαA-hbsp的構(gòu)建成功。
3.含人BSP基因串聯(lián)表達盒的pPICZαA-2×hbsp表達載體的構(gòu)建與鑒定(1)表達盒片斷的獲得用BamH I對重組pPICZαA-hbsp質(zhì)粒單酶切，再用Bgl II單酶切純化后的產(chǎn)物，將酶切后的反應(yīng)體系中的溶液進行電泳，電泳的結(jié)果會出現(xiàn)一大一小的兩片斷，長度分別為1917bp和2537bp。用切膠回收的方法對長度為2537bp的表達盒片斷進行純化。
(2)載體片斷的獲得用BamH I單酶切重組載體pPICZαA-hbsp，得到長度為4454bp的大片斷，用切膠回收的方法進行純化(3)載體片斷的去磷酸化用來源于小牛腸(Calf intestine)的堿性磷酸酶(CIAP)對純化后的載體片斷進行去磷酸化處理。去磷酸化反應(yīng)體系為無菌ddH2O 26μl，10×CIAP buffer 5μl，CIAP(25U/μl)4μl，底物15μl，總反應(yīng)體積50μl。50℃反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后用酚氯仿抽提1次，然后乙醇沉淀。
(4)體外連接目的片斷10μl，載體片斷3.5μl，10×T4DNA連接酶buffer 2.5μl，T4 DNA連接酶1μl，ddH2O 3μl，總體積20μl。16℃水浴16h。
(5)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的提取、電泳及酶切鑒定以pPICZαA質(zhì)粒做對照、pPICZαA-hbsp以及pPICZαA-2×hbsp一起進行瓊脂糖凝膠電泳，然后將重組pPICZαA-2×hbsp質(zhì)粒用KpnI酶切鑒定，結(jié)果見圖2。
4.重組人骨唾液酸蛋白畢赤酵母工程細胞的構(gòu)建及表達鑒定(1)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115以Sac I酶切，使pPICZαA和pPICZαA-2×hbsp質(zhì)粒線性化。制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化，設(shè)定電脈沖條件電壓1500V，電阻200Ω，電容25μF。
(2)轉(zhuǎn)化子表型的PCR鑒定上游引物(5′AOX1引物)5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′下游引物(3′AOX1引物)5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′分別提取GS115、GS115/pPICZαA、GS115/pPICZαA-2×hbsp三種酵母基因組作為PCR分析的模板。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
(3)rhBSP的誘導(dǎo)表達、SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定 將GS115/pPICZαA作為對照菌，從抗性平板上挑取經(jīng)過PCR鑒定過的單菌落轉(zhuǎn)化子接種到含有25ml的BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中。30℃300r/min下振蕩培養(yǎng)直到OD600達到2-6。離心，室溫3000g×5min，收集細胞，棄上清，將細胞沉淀重懸于100ml的BMMY培養(yǎng)基中，30℃300r/min下振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)蛋白表達。每隔24h在搖瓶中加入100％甲醇至終濃度為1％。96h后，3000g室溫離心5min收集上清。對上清進行超濾濃縮，超濾膜為PM10(截留分子量≥10KDa的蛋白)，工作壓強為0.35Mpa，泵轉(zhuǎn)速為60r/min。將濃縮好的樣品馬上進行SDS-PAGE分析和Western blotting鑒定，或置-80℃貯存。
結(jié)果重組表達載體pPICZαA-2×hbsp濃縮至較高濃度后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，在Zeocin平板上篩選出有抗性的轉(zhuǎn)化子。表達rhBSP的畢赤酵母工程細胞經(jīng)過PCR鑒定，表明表達載體已整合至宿主染色體上。發(fā)酵液中目的蛋白的分子量介于43KDa與66.2Kda之間。
權(quán)利要求
1.一種非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體pPICZαA-2×hbsp，其特征在于是通過以下步驟獲得的1)根據(jù)GenBank中人骨唾液酸蛋白基因hbsp序列設(shè)計基因特異性引物上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’以骨唾液酸蛋白BSP基因為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人股骨外膜組織的總RNA中擴增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pB-hbsp；2)根據(jù)畢赤酵母分泌型表達質(zhì)粒pPICZaA及hbsp序列設(shè)計PCR設(shè)計引物上游引物5’-CCG CTCGAGAAAAGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’以重組質(zhì)粒pB-hbsp為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與畢赤酵母表達載體pPICZaA重組，構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒pPICZαA-hbsp，再利用表達載體序列上的一對同尾酶BamH I和Bgl II構(gòu)建含有BSP基因兩個串連的表達盒的質(zhì)粒pPICZαA-2×hbsp。
2.權(quán)利要求1所述的非融合骨唾液酸蛋白的制備方法，其特征在于將表達載體pPICZαA-2×hbsp線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，通過甲醇誘導(dǎo)表達，獲得重組人骨唾液酸蛋白。
3.權(quán)利要求1所述的非融合骨唾液酸蛋白在制備單克隆及多克隆抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非融合骨唾液酸蛋白的酵母表達載體及其應(yīng)用，屬于基因工程和微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在構(gòu)建的含人BSP全長cDNA的pB－h(huán)bsp質(zhì)?；A(chǔ)上，由人BSP基因的擴增、含有串聯(lián)的兩個表達盒的重組酵母表達載體pPICZαA－2×hBSP的構(gòu)建與鑒定、重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115、GS115/pPICZαA－2×hBSP工程菌的甲醇誘導(dǎo)表達和目的蛋白的鑒定等步驟組成。本發(fā)明首次成功構(gòu)建串聯(lián)的非融合的重組人骨唾液酸蛋白基因(rhBSP)表達盒并在畢赤酵母GS115成功進行rhBSP的表達，為rhBSP的制備提供了一條簡捷途徑。
文檔編號C12N1/19GK101063147SQ20071002779
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者王捷, 夏冰 申請人:王捷, 夏冰