專利名稱：RANKL-HBsAg表達(dá)構(gòu)建物、酵母、制法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和免疫領(lǐng)域，具體而言涉及一種表達(dá)重組NF-K B受體激活因子配體(receptor activator of NF-κ B ligand, RANKL)-乙月干表0抗原(hepatitis Bsurface antigen,HBsAg)的酵母細(xì)胞、用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的構(gòu)建物、它們的構(gòu)建方法及用途。
背景技術(shù)：
骨骼是一個(gè)動(dòng)態(tài)組織，在生物的整個(gè)生命周期中不斷地進(jìn)行構(gòu)建、吸收、重建。成骨細(xì)胞不斷地形成新的骨細(xì)胞的同時(shí)，又誘生破骨細(xì)胞來(lái)不斷地溶解吸收骨質(zhì)。破骨細(xì)胞貼附于骨表面，通過(guò)釋放酸性介質(zhì)和蛋白酶來(lái)溶解骨質(zhì)，一方面，形成吸收陷窩供成骨細(xì)胞形成新的骨細(xì)胞，另一方面，維持髓腔體積不被骨質(zhì)占據(jù)。骨重建過(guò)程的意義在于防止骨組織疲勞損傷的積累從而保持生物力學(xué)特性的穩(wěn)定。NF-k B 受體激活因子(RANK，receptor activator of NF-κ B)、其配體 RANKL、 以及護(hù)骨素(0PG，osteoprotegerin)屬于腫瘤壞死因子及其受體超家族，RANK/RANKL 信號(hào)負(fù)責(zé)破骨細(xì)胞的分化和激活，OPG則是RANKL的假性受體，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，阻止 RANKL與RANK之間的結(jié)合，三者通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活化來(lái)影響骨吸收和重建的過(guò)程。RANK/RANKL/0PG組成的三角調(diào)節(jié)系統(tǒng)成為了骨重建調(diào)控的基礎(chǔ)(Rauner M等， Osteoimmunology. Int Arch Allergy Immunol. 2007,143 (1) :31-48)。RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)的失衡與多種骨代謝性疾病及免疫系統(tǒng)疾病引發(fā)的繼發(fā)性骨病和疾病密切相關(guān)，包括(但不限于)骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、部分骨腫瘤(如骨巨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、其它腫瘤(如乳腺癌、前列腺癌)、血管鈣化及其引起的相關(guān)疾病(如動(dòng)脈硬化、血管狹窄、腦栓塞、心肌梗死、腎鈣化)等(Arm EK等，Endocr Rev. 2008,29(2) :155 192.)。骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的代謝性骨病。目前全世界約2億人患有骨質(zhì)疏松，其發(fā)病率已躍居常見(jiàn)病、多發(fā)病的第七位，中國(guó)內(nèi)地總患病率為12.4%，老年人中患病比例超過(guò)一半以上，其中骨折發(fā)生率接近三分之一。骨質(zhì)疏松癥廣泛流行于世界各地，嚴(yán)重?fù)p害患者身體健康，影響其生活質(zhì)量，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展與RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)直接相關(guān)，而RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)受到來(lái)自免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及造血系統(tǒng)等多方面因素的調(diào)控。隨著年齡的增大，人體激素水平會(huì)日益下降，尤其是絕經(jīng)后婦女的雌激素下降水平最為明顯。激素水平的下降會(huì)導(dǎo)致RANKL表達(dá)的上調(diào)及OPG表達(dá)的下調(diào)，RANKL/0PG比率失衡。失去阻斷的RANKL激活破骨細(xì)胞，使骨組織過(guò)度吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)大量流失，引發(fā)骨質(zhì)疏松。因此，阻斷過(guò)量致病的 RANKL成為治療包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的系統(tǒng)失衡疾病的重要手段。例如，Denosumab, 一種高親和性高特異性RANKL單克隆抗體，作為抗RANKL治療的代表已經(jīng)進(jìn)入骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌等疾病的臨床研究，且其療效已通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)的論證獲得肯定(Edward MS,Arthritis Res Ther. 2007,9 Suppl 1 :S7)。然而，本領(lǐng)域中仍然迫切需要開(kāi)發(fā)出可用于有效治療與RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)相關(guān)的骨疾病或其它疾病的藥物。HBsAg是乙型肝炎病毒的包膜蛋白，其能自發(fā)組裝形成22nm病毒樣顆粒，具有強(qiáng)免疫原性，其作為蛋白載體已經(jīng)應(yīng)用于丙型肝炎病毒E2蛋白高變區(qū)和人乳頭瘤病毒E7蛋白等的表達(dá)。然而，本領(lǐng)域以HBsAg作為載體蛋白大多用于結(jié)合一些難以激發(fā)免疫反應(yīng)的病原生物蛋白，而并未嘗試用其結(jié)合自身蛋白以打破自身免疫耐受。在重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域，要獲得高表達(dá)量的表達(dá)載體取決于眾多因素。例如所表達(dá)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、所采用的表達(dá)方式有關(guān)、所采用的表達(dá)盒中的各元件、表達(dá)盒中各元件的組合方式、高拷貝克隆中各拷貝的排列方式等。因此，本領(lǐng)域仍然需要開(kāi)發(fā)出成本更低廉、步驟更簡(jiǎn)便、表達(dá)量更高的重組蛋白生產(chǎn)方法。綜上所述，本領(lǐng)域中迫切需要開(kāi)發(fā)出可用于有效治療與RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)相關(guān)的骨疾病或其它疾病的藥物，并提供產(chǎn)生該藥物的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的正是提供一種穩(wěn)定高表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物、包含該構(gòu)建物的酵母細(xì)胞及其制備方法，以及用該重組蛋白治療或預(yù)防與RANK/RANKL/OPG 相關(guān)的疾病和癥狀的方法和用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種用于表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物， 所述構(gòu)建物含有1個(gè)表達(dá)盒或2-15個(gè)串聯(lián)排列的表達(dá)盒，每個(gè)所述表達(dá)盒包含以下元件 (a)起始信號(hào)元件AOX ； (b) RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列，所述RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列由以下部分組成⑴RANKL蛋白編碼序列，(ii)HBsAg編碼序列，和(iiii)任選的位于RANKL和HBsAg編碼序列之間的連接肽編碼序列；(c)終止信號(hào)元件AOX (TT)。在一個(gè)優(yōu)選例中，相應(yīng)的，所述RANKL-HBsAg重組蛋白由任選通過(guò)連接肽連接的 RANKL蛋白和HBsAg蛋白組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述RANKL-HBsAg重組蛋白的氨基酸序列如SEQID NO 8所示。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述RANKL編碼序列具有SEQ ID NO :3或5所示序列，或?yàn)樗鼈兊耐葱蛄校瑑?yōu)選為SEQ ID NO :5所示序列。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述HBsiVg蛋白編碼序列具有SEQ ID NO :1所示序列或?yàn)槠渫葱蛄?，?yōu)選SEQ ID NO :1所示序列。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述構(gòu)建物是以PPIC3. 5K質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞的染色體中整合有表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有1個(gè)表達(dá)盒或2-15個(gè)串聯(lián)排列的表達(dá)盒，每個(gè)所述表達(dá)盒包含以下元件(a)起始信號(hào)元件AOX ； (b) RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列，所述RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列由以下部分組成(i)RANKL蛋白編碼序列，(ii)HBsAg編碼序列，和(iiii)任選的位于 RANKL和HBsiVg編碼序列之間的連接肽編碼序列；(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)；其中，所述酵母細(xì)胞在誘導(dǎo)下表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白，并且所述的重組蛋白在所述酵母中自行裝配成病毒樣顆粒。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述誘導(dǎo)是用甲醇或甲醇與甘油混合補(bǔ)料誘導(dǎo)，優(yōu)選甲醇與甘油混合補(bǔ)料誘導(dǎo)(所謂混合補(bǔ)料是指同時(shí)流加兩種料液，兩種補(bǔ)料速度都會(huì)根據(jù)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)，而不是按一定比例混合之后進(jìn)行補(bǔ)料)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述酵母細(xì)胞為畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述酵母細(xì)胞優(yōu)選為GS115菌株、SMD1163菌株或KM71菌株，更優(yōu)選為GS115菌株。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述構(gòu)建物中含有3-12個(gè)，更優(yōu)選4-10個(gè)，最優(yōu)選5-8個(gè)串聯(lián)排列的乙肝表面抗原表達(dá)盒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒樣顆粒將RANKL展示于表面，且能刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗RANKL抗體。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種包含RANKL-HBsAg重組蛋白病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒是本發(fā)明的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述病毒樣顆粒將RANKL展示于表面，且能刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗RANKL抗體。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種制備RANKL-HBsAg重組蛋白的方法，其包括
(i)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明酵母細(xì)胞，從而使其表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白；和
(ii)從所述酵母細(xì)胞中分離純化RANKL-HBsAg重組蛋白。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(i)中的所述適合表達(dá)的條件包括采用甲醇、甘油、甲醇與甘油的混合物、或它們的組合進(jìn)行補(bǔ)料，優(yōu)選在發(fā)酵前期采用甘油補(bǔ)料，在發(fā)酵中后期用甲醇與甘油的混合物進(jìn)行補(bǔ)料。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(ii)包括菌體破碎、樣品前處理、 沉淀、離心、過(guò)濾、層析或它們的組合。優(yōu)選的，所述菌體破碎是高壓均質(zhì)破碎。優(yōu)選的，所述樣品前處理是在破碎的菌體中加入iTriton X-100、和/或DNase。優(yōu)選的，所述沉淀是采用硫酸銨進(jìn)行沉淀。優(yōu)選的，所述層析為疏水層析、離子交換層析或它們的組合。優(yōu)選的， 所述過(guò)濾為微濾、超濾或它們的組合。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括對(duì)步驟(ii)分離純化得到的重組蛋白進(jìn)行鑒定，優(yōu)選所述鑒定采用蛋白質(zhì)印跡法、N端測(cè)序鑒定、蛋白質(zhì)濃度BCA測(cè)定法等方法進(jìn)行。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種RANKL-HBsAg重組蛋白，所述重組蛋白是由本發(fā)明的構(gòu)建物表達(dá)產(chǎn)生的、由本發(fā)明的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的，或是通過(guò)本發(fā)明的方法制備的。在本發(fā)明的第六方面中，提供了本發(fā)明的酵母細(xì)胞、病毒樣顆粒或RANKL-HBsAg 重組蛋白的用途，其用于制備預(yù)防或治療RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)相關(guān)疾病或癥狀的疫苗。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)相關(guān)疾病或癥狀選自骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、血管鈣化或血管鈣化引起的疾病和癥狀。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述骨腫瘤選自骨巨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、或多發(fā)性骨髓瘤。在另一優(yōu)選例中，所述血管鈣化引起的相關(guān)疾病和癥狀選自動(dòng)脈硬化、血管狹窄、腦栓塞、心肌梗死、或腎鈣化。在本發(fā)明的第七方面中，提供了一種疫苗組合物，其包含(a)本發(fā)明的
6RANKL-HBsiVg重組蛋白；以及(b)免疫學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述疫苗組合物還包含硫柳汞、甲醛或生理鹽水。在本發(fā)明的第八方面中，提供了構(gòu)建本發(fā)明構(gòu)建物的方法，所述方法包括(1)將 RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列定點(diǎn)插入包含起始信號(hào)元件AOX和終止信號(hào)元件AOX(TT) 的質(zhì)粒中，以獲得單拷貝表達(dá)質(zhì)粒；( 對(duì)所述單拷貝表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造以獲得完整的表達(dá)盒；(3)將所述表達(dá)盒重復(fù)插入所述質(zhì)粒中，從而獲得含有2-15個(gè)串聯(lián)排列的所述表達(dá)盒的構(gòu)建物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒選自pPIC3. 5(K)質(zhì)粒、ρΑ0815或pHIL_D2。在另一優(yōu)選例中，步驟( 中對(duì)所述單拷貝表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造通過(guò)PCR進(jìn)行。在另一優(yōu)選例中，步驟 (3)中將所述表達(dá)盒重復(fù)插入所述質(zhì)粒中是通過(guò)同尾酶定點(diǎn)插入進(jìn)行的。在另一優(yōu)選例中， 所述方法還包括用大腸桿菌擴(kuò)增所得的構(gòu)建物。在本發(fā)明的第九方面中，提供了本發(fā)明表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的酵母細(xì)胞的制備方法，所述方法包括步驟用本發(fā)明的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，使所述的構(gòu)建物整合入酵母染色體中，從而獲得本發(fā)明的酵母細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述轉(zhuǎn)化是通過(guò)電轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進(jìn)行的。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
--累述。本發(fā)明其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1所示為重疊延伸PCR點(diǎn)突變示意圖(IA)和突變改造結(jié)構(gòu)圖(IB)。圖2所示為重疊延伸PCR基因片段融合示意圖OA)及電泳圖QB)。圖3所示為單拷貝質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定的電泳圖(3A)及其結(jié)構(gòu)示意圖(3B)。圖4所示為高拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意圖(4A)及酶切鑒定圖GB)。圖5所示為畢赤酵母RANKL-HBsAg重組表達(dá)組的重組方式示意圖(5A)、RH和RH8C 表達(dá)量的ELISA比較(5B)及RANKL-HBsAg病毒樣顆粒的電鏡觀察結(jié)果(5C)。圖6所示為15L發(fā)酵罐中試規(guī)模發(fā)酵中甲醇補(bǔ)料與混合補(bǔ)料的比較。圖7所示為優(yōu)選的RANKL-HBsAg純化流程(7A)以及樣品純化前后的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果(7B :1、純化前樣品；2、純化后樣品；3、陰性對(duì)照)。圖8所示為RANKL重組質(zhì)粒的圖譜。圖9所示為RANKL的純化流程(9A)以及樣品純化前后的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果(9B :1、陰性對(duì)照；2、純化前樣品；3、純化后樣品)。圖10所示為不同RANKL-HBsAg免疫劑量組對(duì)抗RANKL抗體的誘生情況(IOA)以及混合免疫血清的抗體滴度測(cè)定(IOB)。圖11所示為MTT法測(cè)定的免疫血清阻斷RANKL抑制7細(xì)胞增殖作用 (IlA)、免疫血清阻斷RANKL誘導(dǎo)的7細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的TRAP染色觀察結(jié)果(IlB)以及破骨細(xì)胞及時(shí)結(jié)果(IlC)。圖12所示為RANKL-HBsAg對(duì)OPG基因敲除小鼠體內(nèi)作用的研究結(jié)果，其中包括用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗RANKL抗體生產(chǎn)情況的結(jié)果(12A)；小鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果(12B禾Π 12C)；以及小鼠脛骨包埋切片的顯微GO倍)結(jié)構(gòu)觀察(圖12D)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，篩選了大量由不同元件構(gòu)成的表達(dá)盒， 構(gòu)建了可用于高效表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的表達(dá)盒，并獲得包含單拷貝或多拷貝該表達(dá)盒的酵母細(xì)胞，使其高表達(dá)具有免疫活性的RANKL-HBsiVg蛋白。發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 本發(fā)明的RANKL-HBsAg蛋白可誘導(dǎo)對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)RANKL的中和抗體，從而可用于治療RANK/ RANKL/0PG系統(tǒng)相關(guān)的疾病和癥狀。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，發(fā)明人從BMP-2誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成的成骨細(xì)胞中提取mRNA 進(jìn)行RT-PCR，獲得RANKL的cDNA。通過(guò)重疊延伸PCR將RANKL基因片段融合于HBsAg基因片段的N端，中間以連接肽基因序列相連。將RANKL-HBsAg片段插入質(zhì)粒pPIC3. 5K改中， 并通過(guò)反復(fù)插入RANKL-HBsAg表達(dá)盒的方式獲得高拷貝數(shù)表達(dá)質(zhì)粒。然后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115菌株中，獲得高拷貝數(shù)表達(dá)菌株。使用15L發(fā)酵罐對(duì)工程菌甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵。 發(fā)明人通過(guò)SDS-PAGE、ELISA、Western Blot電鏡和N端測(cè)序等手段證實(shí)了 RANKL-HBsAg得到正確表達(dá)并能自發(fā)形成病毒樣顆粒。隨后，發(fā)明人對(duì)收獲的菌體樣品進(jìn)行破碎、離心、硫酸銨沉淀、微濾、超濾、疏水層析和離子交換層析等純化步驟考察，總結(jié)得出優(yōu)化的純化方法，獲得了純化的 RANKL-HBsAg。發(fā)明人采用用純化后樣品混合鋁佐劑對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，檢測(cè)其免疫血清中抗RANKL抗體生成情況，證實(shí)RANKL-HBsAg能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RANKL的抗體。檢測(cè)免疫血清對(duì)RANKL誘導(dǎo)7細(xì)胞分化和增殖抑制作用的影響，以考察抗RANKL抗體的體外中和活性，證實(shí)了免疫產(chǎn)生的抗RANKL抗體能夠阻斷RANKL誘導(dǎo)的7細(xì)胞分化和增殖抑制現(xiàn)象。用RANKL-HBsAg免疫OPG基因敲除小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，通過(guò)測(cè)定和觀察骨密度、骨力學(xué)參數(shù)和骨微結(jié)構(gòu)等確定了 RANKL-HBsAg對(duì)骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)治療效果。在上述研究的基礎(chǔ)上，發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明重組表達(dá)的RANKL-HBsAg能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗RANKL抗體，所產(chǎn)生的抗體具有針對(duì)RANKL的中和活性，能夠阻斷RANK/RANKL通路， 從而可用于預(yù)防和/或治療與該通路相關(guān)的疾病或癥狀，例如骨質(zhì)疏松癥等。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成” 屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。乙肝表面抗原(HBsAg)和NF-κ B受體激活因子配體(RANKL)如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乙肝表面抗原”或“HBsAg”可互換使用，均指包含本領(lǐng)域中已知的乙肝表面抗原氨基酸序列(例如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列)、其保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段、或其中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-20個(gè)(優(yōu)選1-10個(gè)，更優(yōu)選1-5個(gè))氨基
8酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，以預(yù)防HBV感染的抗原。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“NF- κ B受體激活因子配體”或“ RANKL”可互換使用，均指包含本領(lǐng)域中已知的RANKL氨基酸序列(例如SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列)、其保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段、或其中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-20個(gè)(優(yōu)選1-10個(gè)， 更優(yōu)選1-5個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有與RANK結(jié)合的能力的抗原。應(yīng)理解經(jīng)保守取代的上文所述的序列也可用于本發(fā)明，優(yōu)選的活性衍生物指與原氨基酸序列相比，有至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)，最佳地1個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乙肝表面抗原基因/編碼序列”、"HBsAg基因”可互換使用，均指包含本發(fā)明SEQ ID NO :1所示的序列或其經(jīng)基因工程改造且可表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的乙肝表面抗原的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“RANKL基因”、"RANKL編碼序列，，可互換使用，均指包含本發(fā)明SEQ ID NO 3所示的序列或其經(jīng)基因工程改造(如SEQ ID NO 5),且可表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的RANKL蛋白的核苷酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)方法獲得所述的編碼序列， 所述方法可按照常規(guī)條件如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。RANKL-HBsAg重組蛋白及其編碼序列如本文所用，術(shù)語(yǔ)"RANKL-HBsAg重組蛋白，，或“RH重組蛋白，，是指通過(guò)基因工程手段獲得的，由RANKL基因或其片段融合于HBsiVg基因或其片段的N端，且其間任選由連接肽編碼序列相連所形成的重組蛋白，所示重組蛋白具有誘導(dǎo)抗RANKL抗體的活性。優(yōu)選本發(fā)明的重組蛋白由SEQ ID NO :7的核苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。本發(fā)明的重組蛋白可具有或不具有連接肽。當(dāng)連接肽存在時(shí)，其通常包含 1-25個(gè)氨基酸，優(yōu)選5-20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選8-15個(gè)氨基酸，優(yōu)選所述連接肽序列為 GGGGSGGGGGS(SEQ ID NO 8 的 180_190aa 處)。在本發(fā)明的體系中，RANKL-HBsAg重組蛋白的編碼序列可得以高效表達(dá)，以產(chǎn)生所需的RANKL-HBsAg重組蛋白。該編碼序列中的RANKL和HBsAg序列可經(jīng)過(guò)基因工程改造 (如點(diǎn)突變)以更適于表達(dá)盒的構(gòu)建和表達(dá)但仍保持其應(yīng)有的活性?；蚱蔚娜诤峡刹捎帽绢I(lǐng)域中已知的常規(guī)方式進(jìn)行。表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物及其構(gòu)建如本文所用，術(shù)語(yǔ)“RANKL-HBsAg表達(dá)盒”或“RH表達(dá)盒”是指通過(guò)本發(fā)明方法獲得的具有以下元件的表達(dá)盒(a)起始信號(hào)元件AOX ;(b) RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列； (c)終止信號(hào)元件AOX (TT)。本發(fā)明表達(dá)盒的制備方法包括如下步驟(1)將RANKL-HBsAg重組蛋白的編碼序列定點(diǎn)插入包含起始信號(hào)元件AOX和終止信號(hào)元件AOX(TT)的質(zhì)粒中，以獲得單拷貝表達(dá)質(zhì)粒；(2)對(duì)所述單拷貝表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行改造以獲得完整的RANKL-HBsAg重組蛋白表達(dá)盒。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所采用的質(zhì)粒可為pPIC3. 5(K)、pA0815或pHIL-D2 等，只要其含有起始信號(hào)元件AOX和終止信號(hào)元件AOX (TT)；優(yōu)選pPIC3.5(K)質(zhì)粒?？蓪ANKL-HBsAg重組蛋白的編碼序列定點(diǎn)插入質(zhì)粒的5A0X1和3A0X (TT)之間，優(yōu)選插入EcoRI酶切位點(diǎn)與NotI酶切位點(diǎn)之間?？刹捎肞CR方法等常規(guī)方法從已構(gòu)建的單拷貝表達(dá)質(zhì)粒中擴(kuò)增帶有終止信號(hào)元件3A0X (TT)的表達(dá)盒，并改變兩端的酶切位點(diǎn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選片段5端為BglII位點(diǎn)，3端為BamHI位點(diǎn)，將該片段插入 BamHI位點(diǎn)，獲得在3A0X(TT)的3端帶有BamHI位點(diǎn)的單拷貝表達(dá)質(zhì)粒。如需使用EcoRI/ MunI等其它同尾酶，則需對(duì)質(zhì)粒及片段進(jìn)行進(jìn)一步改造。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建物”、“本發(fā)明的構(gòu)建物”和“表達(dá)RANKL-HBsAg蛋白的構(gòu)建物”可互換使用，均指通過(guò)分子生物學(xué)方法構(gòu)建的含有1個(gè)或2-15個(gè)串聯(lián)排列的本發(fā)明的RANKL-HBsAg蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述構(gòu)建物中優(yōu)選含有 3-12個(gè)，更優(yōu)選4-10個(gè)，最優(yōu)選5-8個(gè)串聯(lián)排列的本發(fā)明表達(dá)盒。可通過(guò)將上文所述的表達(dá)盒重復(fù)插入質(zhì)粒中來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的RANKL-HBsAg蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用同尾酶、平末端連接等方法將所述表達(dá)盒重復(fù)插入所述質(zhì)粒中，優(yōu)選采用同尾酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法還包括用大腸桿菌擴(kuò)增所得的構(gòu)建物。高表汰RANKL-HBsAg重鉬蛋白的酵母細(xì)胞H制各如本文所用，術(shù)語(yǔ)“RANKL-HBsAg表達(dá)酵母細(xì)胞”或“本發(fā)明的酵母細(xì)胞”可互換使用，均指具有如下特征的表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的酵母細(xì)胞所述酵母細(xì)胞中整合有表達(dá)RANKL-HBsAg的本發(fā)明的構(gòu)建物，并且所述酵母細(xì)胞在適當(dāng)誘導(dǎo)下表達(dá)RANKL-HBsAg， 并形成病毒樣顆粒。本發(fā)明RANKL-HBsAg表達(dá)酵母細(xì)胞的制備方法包括步驟用本發(fā)明的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，以獲得表達(dá)RANKL-HBsAg的酵母細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化可采用電轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等本發(fā)明常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。由本發(fā)明酵母細(xì)胞產(chǎn)生的病毒樣顆粒具有與天然RANKL相近的抗原表位，且能刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可采用選自下組的酵母細(xì)胞畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母，優(yōu)選采用畢赤酵母，例如GS115菌株、SMDl 163菌株、KM71菌株(優(yōu)選GS115菌株)。本發(fā)明酵母細(xì)胞的RANKL-HBsAg表達(dá)量可達(dá)20_1000mg/L發(fā)酵液，優(yōu)選50_300mg/L 發(fā)酵液。疫苗組合物本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，它含有有效量(如0.00000l-50Wt% ；較佳的 0. 00001-20wt% ；更佳的，0. 0001-10wt% )的本發(fā)明的RANKL-HBsAg重組蛋白(優(yōu)選經(jīng)純化)，以及免疫學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的疫苗組合物可用于通過(guò)對(duì)RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)的影響來(lái)治療、緩解或改善與該途徑相關(guān)的疾病或癥狀。此外，本發(fā)明的疫苗組合物還可同時(shí)與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。如本文所用，“免疫學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)上可接受的載體”指用于免疫活性劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常疫苗制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的疫苗組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的疫苗組合物宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療或預(yù)防有效量。本發(fā)明的制劑還可制成緩釋制劑。
本發(fā)明組合物中免疫活性劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于免疫活性劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療或預(yù)防狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。本發(fā)明組合物中的pH或載體等可如上文所述，并可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)需要和常識(shí)進(jìn)行選擇。本發(fā)明疫苗組合物的給藥方式?jīng)]有特別的限制，可以是全身的或局部的。優(yōu)選的，本發(fā)明的疫苗組合物可通過(guò)肌肉注射的方式給予對(duì)象，通常，當(dāng)本發(fā)明免疫活性劑以約 0. 00001-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0. OOOl-lOmg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。也可采用基因治療的手段進(jìn)行給藥，比如可直接將免疫活性劑通過(guò)諸如注射等方法給藥于受試者；或者可通過(guò)一定的途徑將攜帶免疫活性劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)本發(fā)明的RANKL-HBsAg蛋白?？蓪⑺龅腞ANKL-HBsAg蛋白直接給予哺乳動(dòng)物(比如人)，或者，可將編碼 RANKL-HBsAg蛋白的基因通過(guò)常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體(如常規(guī)原核或真核表達(dá)載體、或病毒載體如皰疹病毒載體或腺病毒載體)中，將所述的載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述蛋白或多肽的細(xì)胞中，使所述的細(xì)胞表達(dá)RANKL-HBsAg蛋白?？赏ㄟ^(guò)將適量的所述細(xì)胞引入到哺乳動(dòng)物身體的適當(dāng)部位，實(shí)現(xiàn)RANKL-HBsAg蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.通過(guò)重組技術(shù)插入單或高拷貝數(shù)本發(fā)明的RANKL-HBsAg表達(dá)盒而獲得的酵母細(xì)胞，出乎意料地獲得了高表達(dá)量、且表達(dá)產(chǎn)物具有高活性，由此適于工業(yè)化生產(chǎn)；2.本發(fā)明的酵母細(xì)胞生產(chǎn)RANKL-HBsAg重組蛋白能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗RANKL 抗體，從而用于改善和治療因RANKL/0PG比例上調(diào)失衡造成的疾病或癥狀。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(例如可參考通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(同上)中所述的條件、或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.單拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建人間充質(zhì)干細(xì)胞、BMP-2重組腺病毒、質(zhì)粒PPIC3.漲改(在invitrogen公司的 PPIC3. 5K質(zhì)粒的基礎(chǔ)上改造而得)購(gòu)自上海生物制品研究所；大腸桿菌T0P10株、畢赤酵母GS115株購(gòu)自invitrogen公司。L RANKL cDNA 的制備按常規(guī)方法培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(購(gòu)自上海生物制品研究所)，在傳代后第2天，向培養(yǎng)液中加入500 μ 1 ΒΜΡ-2重組腺病毒誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，3天后換液1/3，7天后消化收獲。抽提細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法獲得RANKLcDNA。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定所得cDNA確為RANKL cDNA。2. RANKL的點(diǎn)突變改造使用重疊延伸PCR，對(duì)RANKL進(jìn)行改造，使得影響后續(xù)酶切操作的位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變(如圖IA和IB所示)，所用引物如表1所示表 1.
權(quán)利要求
1.一種用于表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有1個(gè)表達(dá)盒或2_15 個(gè)串聯(lián)排列的表達(dá)盒，每個(gè)所述表達(dá)盒包含以下元件(a)起始信號(hào)元件Α0Χ;(b)RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列，所述RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列由以下部分組成(i)RANKL蛋白編碼序列，(ii)HBsAg編碼序列，禾口(iiii)任選的位于RANKL和HBsAg編碼序列之間的連接肽編碼序列；(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述RANKL-HBsAg重組蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO 8 所示。
3.—種表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞的染色體中整合有表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有1個(gè)表達(dá)盒或2_15個(gè)串聯(lián)排列的表達(dá)盒，每個(gè)所述表達(dá)盒包含以下元件(a)起始信號(hào)元件Α0Χ;(b)RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列，所述RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列由以下部分組成(i)RANKL蛋白編碼序列，(ii)HBsAg編碼序列，禾口(iiii)任選的位于RANKL和HBsAg編碼序列之間的連接肽編碼序列；(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)；其中，所述酵母細(xì)胞在誘導(dǎo)下表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白，并且所述的重組蛋白在所述酵母中自行裝配成病毒樣顆粒。
4.如權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述酵母細(xì)胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母。
5.如權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞，其特征在于，所述病毒樣顆粒將RANKL展示于表面， 且能刺激哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗RANKL抗體。
6.一種包含RANKL-HBsAg重組蛋白病毒樣顆粒，其特征在于，所述病毒樣顆粒是由權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的。
7.一種制備RANKL-HBsAg重組蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(i)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞，從而使其表達(dá) RANKL-HBsAg重組蛋白；和(ii)從所述酵母細(xì)胞中分離純化RANKL-HBsAg重組蛋白。
8.一種RANKL-HBsAg重組蛋白，其特征在于，所述重組蛋白是由權(quán)利要求1中所述的構(gòu)建物表達(dá)產(chǎn)生的、由權(quán)利要求3中所述的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的，或是通過(guò)權(quán)利要求7所述的方法制備的。
9.權(quán)利要求3所述的酵母細(xì)胞、權(quán)利要求6所述的病毒樣顆?；驒?quán)利要求8所述的 RANKL-HBsAg重組蛋白的用途，其特征在于，其用于制備預(yù)防或治療RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)相關(guān)疾病或癥狀的疫苗。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述RANK/RANKL/0PG系統(tǒng)相關(guān)疾病或癥狀選自骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、血管鈣化或血管鈣化引起的疾病和癥狀。
11.一種疫苗組合物，其包含(a)權(quán)利要求8所述的RANKL-HBsAg重組蛋白；以及(b)免疫學(xué)上可接受的載體和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)RANKL-HBsAg重組蛋白的構(gòu)建物及其制備方法，所述構(gòu)建物含有1-15個(gè)表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒包含(a)起始信號(hào)元件AOX；(b)RANKL-HBsAg重組蛋白編碼序列；和(c)終止信號(hào)元件AOX(TT)。本發(fā)明中還提供了包含該構(gòu)建物的酵母細(xì)胞、由該酵母細(xì)胞產(chǎn)生的包含RANKL-HBsAg重組蛋白的病毒樣顆粒及其用途。本發(fā)明所構(gòu)建的酵母細(xì)胞可用于大量產(chǎn)生RANKL-HBsAg重組蛋白，從而用于治療或預(yù)防RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)相關(guān)疾病或癥狀，如骨質(zhì)疏松癥等。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102443594SQ201010507578
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者何成, 樓覺(jué)人 申請(qǐng)人:上海生物制品研究所有限責(zé)任公司