專利名稱：重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的克隆，含有該基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建以及將該基因產(chǎn)物在含有表達(dá)質(zhì)粒的畢赤酵母中的可溶性分泌型蛋白的生產(chǎn)及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
自1997年，F(xiàn)olkman實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)了人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin)能通過抑制新生血管的形成、切斷腫瘤的血供、從而能抑制幾乎所有實(shí)體腫瘤的生長以來，世界各國科學(xué)家及制藥企業(yè)爭相采用各種表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素以滿足科研及臨床前期實(shí)驗(yàn)之需。目前報(bào)導(dǎo)最多的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖具有產(chǎn)量高、成本低的優(yōu)點(diǎn)，所表達(dá)的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素幾乎都屬不溶性的，雖在實(shí)驗(yàn)動物中具有抗腫瘤生長之活性，但在人體上的應(yīng)用將由于它的不溶性而受到限制。另一方面，已有的哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或昆蟲細(xì)胞煙草病毒表達(dá)系統(tǒng)雖然產(chǎn)生與天然類似的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，但由于產(chǎn)量低、成本高，亦不能滿足臨床前期實(shí)驗(yàn)所需，中國專利97107112.8和99116065.7描述了基本相同的兩種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的克隆方法和大腸桿菌表達(dá)體系，雖然后者也公開了使用不同的幾種酵母作為表達(dá)體系，但對其應(yīng)用未作詳細(xì)描述，也未能就其特點(diǎn)進(jìn)行說明。
本發(fā)明所采作的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與上述專利中描述的表達(dá)系統(tǒng)不同，既具備大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量高、易擴(kuò)大生產(chǎn)和成本低的優(yōu)點(diǎn)，又具有其他真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性，包括蛋白質(zhì)翻譯后的化學(xué)修飾及高級結(jié)構(gòu)的折疊形成。而且由于人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在本系統(tǒng)中是以一種與酵母α因子信號短肽形成的融合蛋白表達(dá)。這樣，人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在酵母中表達(dá)后被分泌到培養(yǎng)液中。這一分泌過程，不僅使人內(nèi)皮細(xì)胞抑制素進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的修飾，折疊使其在構(gòu)象上與天然重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素接近，而且大大地簡化了純化過程。
本發(fā)明的目的在于提供一個高級的酵母表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)可溶性的具有生物活性的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素，該產(chǎn)品可作為一種生物制品藥物應(yīng)用于人類腫瘤病的治療。
本發(fā)明的目的是通過以下措施來達(dá)到的1、克隆編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因本發(fā)明的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的編碼序列是用PCR法從人乳腺cDNA文庫中克隆得到的。它的序列相當(dāng)于人膠原蛋白ⅩⅧ cDNA第1501至2055核苷酸片斷(Genomics 19:494-499,1994)。全長555堿基對。其DNA序列及其編碼的氨基酸序列見序列1(SEQID NO.1)2、構(gòu)建含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒。
按常規(guī)分子克隆方法，將PCR擴(kuò)增的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素編碼基因片斷，經(jīng)一定的酶切之后，插入酵母表達(dá)載體，pPICZαA(Invitrogen)，使其與α-因子信號短肽表達(dá)成融合蛋白，所得表達(dá)質(zhì)粒稱為pPICZαA-Endo。其構(gòu)建過程見


圖1。3、用pPICZαA-Endo表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115并篩選高效表達(dá)株，CS115/pPICZαA-Endo。4、高效表達(dá)株GS115/pPICZαA-Endo的培養(yǎng)與甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
將單菌落接種于BMGH培養(yǎng)液，30℃振搖培養(yǎng)過夜。次日轉(zhuǎn)接種于較大體積的同種培養(yǎng)液，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至O.D600=16-20。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于BMMH誘導(dǎo)培養(yǎng)液，30℃，振蕩培養(yǎng)，每24小時加入甲醇，使其最終濃度為1％。4天后離心收集上清。5、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的純化上述收集的上清經(jīng)超濾濃縮至一定體積后，用肝素sepharose親和層析拴純化。用SDS-PAGE檢測其分子量大小及相對純度，凍干，-70℃保存。SDS-PAGE電泳圖譜見圖2。6、本發(fā)明所生產(chǎn)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC和HMEC生長的抑制作用。
將所純化的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素加入含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC或HMEC的培養(yǎng)液中，三天后，用3H-胸腺嘧啶摻入法或用磺酰羅丹明B(SRB)蛋白染色法，測量人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制活性。如圖3所示，本發(fā)明所生產(chǎn)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對HUV-EC(圖3A)和HMEC(圖3B)呈劑量依賴性抑制，其IC50分別為1μg/ml(HUV-EC)和10μg/ml(HMEC)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果十分相似(cancerRes.60:2190-2196,2000)；cancer Res.59:189-197,1999)7、本發(fā)明所純化的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對小鼠S-180肉瘤的生長具有明顯的抑制作用(表1)。
如表1所示，此重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素以6mg/kg體重注射于S-180肉瘤小鼠，三天后，腫瘤生長被抑制48％。以12mg/kg體重注射三天，腫瘤生長抑制率為53％。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)結(jié)果相當(dāng)(cancer Res.59:189-197,1999)。
以下為圖表說明
圖1本發(fā)明克隆的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的DAN序列及由它所編碼的氨基酸序列。
圖2酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖。
圖3本發(fā)明表達(dá)純化的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的聚丙烯酰胺電泳圖。
圖4A、圖4B本發(fā)明生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用。
表1本發(fā)明生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對小鼠S-180肉瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用。
CAG-3＇3＇端引物5＇-GCC AGC GGC CGC CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAAGCT-3＇在5＇端引物上的同源序列之前加上EcoR1酶切位點(diǎn)，在3＇端引物的同源序列和終止密碼之后加上Not1酶切位點(diǎn)。b．PCR反應(yīng)以人乳腺cDNA文庫為模板，用上述兩個引物經(jīng)PCR反應(yīng)從文庫中擴(kuò)增出555堿基對長的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素cDNA片斷。PCR反應(yīng)的條件為人乳腺cDNA文庫，2微克，上述兩種引物各0.5微克，10mmdNTPS 2微升，10×PCR緩沖液，10微升，TaqDNA聚合酶1微升，加水至最終體積100微升。PCR反應(yīng)在PCR儀上按以下溫度循環(huán)條件第一循環(huán)95℃2分鐘，第二至第29循環(huán)94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，最后一個循環(huán)94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 8分鐘。將經(jīng)Qiaqen PCR純化試劑盒所純化的PCR產(chǎn)物先次級克隆至TA克隆載體PCR2.1(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，經(jīng)酶切和測序篩選后得到的含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素正確序列的克隆命名為PCR2.1/Endo。本發(fā)明所克隆得到的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的DNA序列及其編碼的氨基酸序列見序列表1(SEQID NO.1)2、人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素酵母表達(dá)載體的構(gòu)建如
圖1所示，用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Not1將人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素cDNA從PCR2.1/Endo中切出，經(jīng)凝膠電泳分離純化后，再與經(jīng)EcoR1和Not1消化后的酵母表達(dá)載體，pPICZαA(Invitrogen)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選具有Zeocin耐藥性的轉(zhuǎn)化株，從這些耐藥株中提取質(zhì)粒，用酶切和測序分析篩選得到含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素正確序列并與α-因子在同一閱讀框內(nèi)的質(zhì)粒。將這種質(zhì)粒命名為pPICZαA/Endo。3、高效表達(dá)人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的畢赤酵母重組株(GS115/pPICZαA/Endo的構(gòu)建與篩選用限制性核酸內(nèi)切酶Sac1切開環(huán)形表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/Endo使之線型化。將線型化了的pPICZαA/Endo表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母株GS115，篩選具有Zeoein耐藥性的轉(zhuǎn)化體。將所有的耐Zeoein轉(zhuǎn)化體分別接種于少量培養(yǎng)液并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)(具體方法詳見實(shí)例4)。離心收集上清，用SDS-PAGE電泳檢測上清中所表達(dá)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的量，從中篩選高表達(dá)株。4、人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的表達(dá)與純化a．菌種的培養(yǎng)與甲醇誘導(dǎo)將單個新鮮的畢赤酵母工程菌GS115(pPICZαA/Endo)接種于BMGH培養(yǎng)液，36℃，繼續(xù)培養(yǎng)至0.D600 16-20。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于1/5原體體積的BMMH誘導(dǎo)液中，30℃，振蕩培養(yǎng)，每24小時加入甲醇使甲醇最終濃度為1％，四天后離心收集上清。取少量上清用15％SDS-PAGE電泳分析。如圖2中的“crude”即粗制品中所出，未經(jīng)純化的上清中有明顯的分子量為20KDa左右的蛋白帶，此為酵母表達(dá)后分泌至上清中的可溶性人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。b．重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的純化將離心收集的上清經(jīng)centracon plus 80(Millpore)超濾濃縮至一定體積后，加樣于肝素-sepharose親和層析柱，用含50mm Nacl的50mm磷酸鹽緩沖液洗柱后，先后用含0.2M Nacl,0.5M Nacl和1M Nacl的50mm磷酸鹽緩沖液洗脫，分別收集洗脫樣品，從各收集管中取出少許樣品進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見圖2。絕大部分重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素可被1M Nacl洗脫。經(jīng)一步柱層析法所得到的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素在SDS-PAGE上呈單一的分子量為20kd的蛋白帶(圖2)。將柱層析所收集的含人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的蛋白溶液經(jīng)PBS透析脫鹽后，凍干，干燥，-70℃保存。此為純化的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。
為測定用本系統(tǒng)重組生產(chǎn)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的生物活性，采用3H-胸腺嘧啶摻入法和SRB染色結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)分別檢測重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對兩種人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUV-EC和HMEC生長的抑制作用。將不同濃度的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素加入含HUV-EC或HMEC細(xì)胞的培養(yǎng)液中，共同培養(yǎng)三天后，檢測3H-胸腺嘧啶摻入量或SRB染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖3。如圖3所示，重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對HUV-EC(圖3A)和HMEC(圖3B)均呈劑量依賴性抑制，其IC50分別為1μg/ml(HUV-EC)和10μg/ml(HMEC)，此結(jié)果與文獻(xiàn)的結(jié)果十分類似(cancer Res,60:2190-2196,2000及cancerRes,59:189-197,1999)
測定結(jié)果還進(jìn)一步證明，重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制是特異的，它對其他細(xì)胞及各種癌細(xì)胞包括P388小鼠白血病細(xì)胞、A-549人肺癌細(xì)胞、HL-60人白血病血液細(xì)胞以及BEL-7402人肺癌細(xì)胞的生長無效或僅呈極弱的抑制作用，重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素對血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的特異與天然的或其他表達(dá)系統(tǒng)所生產(chǎn)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的作用特點(diǎn)相同。
權(quán)利要求
1．一種酵母表達(dá)載體pPICZαA-Endo。
2．權(quán)利要求1的酵母表達(dá)載體，其特征是該載體含有人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素基因并且該基因與α因子信號序列融合。
3．由權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的能表達(dá)人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的畢赤酵母菌株GS115/pPICZαA-Endo。
4．用權(quán)利要求3所述的畢赤酵母菌株GS115/pPICZαA-Endo生產(chǎn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的方法步驟為(1)菌種培養(yǎng)將單個新鮮菌落接種于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜，接種于較大體積培養(yǎng)液，連續(xù)振蕩培養(yǎng)直至O.D600=16-20；(2)甲醇誘導(dǎo)離心收集上述菌種，將其懸浮于一定體積的誘導(dǎo)液中，振蕩培養(yǎng)3-4天，每日加入新鮮甲醇使其最終濃度為1％；(3)表達(dá)產(chǎn)物純化離心收集上清，濃縮至一定體積后，進(jìn)行親和層析純化。
5．權(quán)利要求4的方法，其中的培養(yǎng)液是BMGH培養(yǎng)液。
6．權(quán)利要求4的方法，其中的培養(yǎng)溫度為25-35℃。
7．權(quán)利要求4的方法，其中純化層析柱采用肝素sepharose 4B進(jìn)行親和層析。
全文摘要
本發(fā)明用PCR法從人乳腺cDNA庫中克隆得到人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素的基因,構(gòu)建了含有該基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA—Endo及其轉(zhuǎn)化的畢赤酵母工程菌株GS115/pPICZaA—Endo。并利用此重組菌株表達(dá)生產(chǎn)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素。本表達(dá)系統(tǒng)既具有E.coli表達(dá)水平高、易擴(kuò)大生產(chǎn)和成本低的特點(diǎn),又具有真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性如:蛋白質(zhì)成熟過程、折疊和翻譯后修飾機(jī)制。由本發(fā)明所生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)證明具有與天然重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制素類似的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制腫瘤生長的生物活性,可以作為一種抗癌藥用于實(shí)體腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/62GK1305004SQ0110222
公開日2001年7月25日 申請日期2001年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月18日
發(fā)明者周益群 申請人:重慶康爾威科技開發(fā)有限公司