一種高效表達(dá)羅氏沼蝦超氧化物歧化酶的釀酒酵母工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)羅氏沼蝦超氧化物歧化酶的釀酒酵母工程菌，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國經(jīng)濟(jì)出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)之一，漁業(yè)在我國已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的 增長點(diǎn)。近年來甲殼類動物病害日趨嚴(yán)重，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 甲殼類動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非特 異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。甲殼類動物的非特異性免疫機(jī)制 包括甲殼和粘液的屏障作用、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬作用以及非特異性體液分子。除此之外， 甲殼類動物中先天免疫系統(tǒng)也進(jìn)行細(xì)胞吞噬作用以消除入侵的微生物。在此過程中，包括 超氧陰離子（〇 2?，過氧化氫（H202)，氫氧根離子（0H)，和單線態(tài)氧（W)和活性氧中間體 (R0I)在內(nèi)的殺菌活性氧（R0S)在體內(nèi)大量產(chǎn)生。因此，甲殼類動物則需要及時合成抗氧化 酶來清除這些活性氧。其中最重要的抗氧化酶是超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase， SOD)，它可有效清除氧自由基，避免其對自身細(xì)胞造成損害。
[0004] 目前，羅氏沼蝦S0D蛋白表達(dá)及蛋白功能研究還未見報道。然而，基因的異源表達(dá) 受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的影響。因此，如何實現(xiàn)甲殼類動物來源的超氧化物 歧化酶S0D的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)是目前亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明利用釀酒酵母實現(xiàn)了羅氏沼奸（Macrobrachium rosenbergii)重要免疫因子-超氧化物歧化酶SOD的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)，對 增強(qiáng)甲殼類動物對各種主要疾病和環(huán)境變化的抵抗力、有效促進(jìn)其健康生長發(fā)揮了重要作 用。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼蝦超氧化物歧化酶的釀酒酵母 工程菌，所述工程菌的構(gòu)建方法是將羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSOD的cDNA克隆至表達(dá)質(zhì) 粒PHAC181上得到測序驗證正確的重組質(zhì)粒pHAC181-MrS0D，然后設(shè)計同源重組引物，利用 同源重組技術(shù)將目的基因MrSOD整合至釀酒酵母宿主菌株的GAL1啟動子下游。該工程菌 在半乳糖的誘導(dǎo)下，可高效表達(dá)目的蛋白。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述MrSOD的cDNA的⑶S區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述MrSOD的cDNA的⑶S區(qū)域（codingsequence) 翻譯后的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達(dá)質(zhì)粒PHAC181是在商業(yè)化質(zhì)粒YCplacl81 的SphI和EcoRV位點(diǎn)插入3個組氨酸標(biāo)簽得到的，詳見文獻(xiàn)：Analyses ofthe effects of Rck2p mutants on Pbs2pDD-induced toxicity in Saccharomyces cervisiae identify a MAP kinase docking motif, and unexpected functional inactivation due to acidic substitution ofT379,Mol Gen Genomics，2004, 271:208 - 219.
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GALl-ScRCHl，是將釀酒酵 母BY4741(Sc04153268_sl)菌株里的ScRCHl基因的啟動子替換成GAL1啟動子。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構(gòu)建得到的： (1)以羅氏沼蝦的cDNA為模板PCR擴(kuò)增或者直接化學(xué)合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示的MrSOD基因片段；（2)將MrSOD基因片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒pHACISl上，得到重組表達(dá) 質(zhì)粒pHAC181-MrS0D; (3)設(shè)計同源重組引物，對質(zhì)粒pHAC181-MrS0D進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有 MrSOD基因的核苷酸片段，使用同源重組的方法，將該核苷酸片段整合至釀酒酵母菌株中 GAL1啟動子下游。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟（3)，還包括將菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培 養(yǎng)6h后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT檢測，目的蛋白表達(dá)的菌株則為構(gòu)建成功的 酵母工程菌。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSOD的方 法，所述方法是使用所述釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)菌株。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG 培養(yǎng)基中，在半乳糖的誘導(dǎo)下培養(yǎng)6h;所述YPG培養(yǎng)基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/ L、酵母提取物10g/L。
[0015] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)得到的羅氏沼蝦超氧化物歧化酶 MrSOD，以及所述釀酒酵母工程菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖或者水產(chǎn)動物免疫飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，可以實現(xiàn)羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSOD的 高效表達(dá)、活性表達(dá)；本發(fā)明工程菌發(fā)酵得到的MrSOD具有活力，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后每mL發(fā)酵 液可得到〇· 〇72mg蛋白。
[0018] (2)本發(fā)明的工程菌為釀酒酵母工程菌，表達(dá)真核來源的MrSOD，可以分泌經(jīng)正確 折疊和加工的蛋白質(zhì)；而且釀酒酵母具有在簡單培養(yǎng)基中快速生長；安全，可用于食品生 廣等優(yōu)點(diǎn)；
[0019] (3)本發(fā)明以pHAC181為載體、GALl-ScRCHl為宿主構(gòu)建釀酒酵母工程菌，實現(xiàn)了 超氧化物歧化酶MrSOD的高效表達(dá)，以期增強(qiáng)甲殼類動物對各種主要疾病和環(huán)境變化的抵 抗力，有效促進(jìn)其健康生長。目前新型飼料蛋白源與飼料添加劑的研制與開發(fā)己成為促進(jìn) 現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)，本發(fā)明的酵母工程菌不僅可以更進(jìn)一步對甲殼類動 物重要免疫基因的蛋白功能進(jìn)行研究，也將為開發(fā)新型免疫增強(qiáng)型飼料添加劑提供科學(xué)依 據(jù)及新方法。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSOD cDNA擴(kuò)增條帶^03bp);
[0021] 圖2 :將羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSODcDNA克隆至載體pHAC181上時，菌落PCR 驗證陽性轉(zhuǎn)化子（Line1，3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 22, 23 為正確的轉(zhuǎn) 化子）；
[0022] 圖3 :將羅氏沼蝦超氧化物歧化酶MrSOD克隆至載體pHAC181上時，陽性轉(zhuǎn)化子的 酶切驗證（Line1，2,3,4,5,6,7,9為正確的轉(zhuǎn)化子）；
[0023] 圖4 :高保真酶PrimeSTARGXL酶對重組質(zhì)粒pHAC181-MrS0D進(jìn)行擴(kuò)增（4985bp);
[0024] 圖5 :檢測引物檢測pHAC181-MrS0D與含GAL1啟動子的菌株同源重組（同源重組 成功的條帶為886bp，Line 1，8，12為正確的轉(zhuǎn)化子）；
[0025] 圖 6 :WESTERNBL0T檢測到Gal-pHAC181-MrS0D蛋白表達(dá)，目的蛋白為 30KD。
【具體實施方式】
[0026] 在本發(fā)明中，首先采用基因克隆技術(shù)，具體為：將羅氏沼蝦RNA提取后，用反轉(zhuǎn)錄 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真PCR酶將目的基因片段MrSOD進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增 得到的基因片段與載體PHAC181連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞transTl中，涂布于LA平 板上37°C過夜培養(yǎng)。LA平板上得到的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗證及測序驗證。其次，利用 同源重組技術(shù)將帶有目的基因MrSOD的質(zhì)粒pHAC181整合至釀酒酵母菌株GALl-ScRCHl 菌株中GAL1啟動子下游，整合成功的菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，提取蛋白，用于 WESTERNBL0T檢測。目的蛋白表達(dá)成功的菌株則為構(gòu)建成功的酵母工程菌。
[0027]LA培養(yǎng)基的組成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、瓊脂12g/L，調(diào)PH 為 7. 0,Amp抗生素 100mg/ml(120°C，20min)。
[0028]SD-Leu培養(yǎng)基的組成：含有酵母氮源（無AA) 1. 7g/L、硫酸銨5g/L、葡萄糖20g/ L、10xAAmix(-ura，-leu，_his)100ml，100xUra10ml，100xHis10ml，瓊脂 20g/L(12CTC， 20min)〇
[0029]YPG培養(yǎng)基的組成：D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L(115°C， 20min)〇
[0030] 實施例1 :釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（基因克?。?br>[0031] 通過構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒pHAC181-MrS0D，具體方法為提取羅氏沼蝦組織RNA，反轉(zhuǎn)錄 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真酶將目的基因片段MrSOD進(jìn)行PCR擴(kuò)增，MrSOD 基因片段（CDS區(qū)域，不包含終止密碼子，共603bp)，然后將這個片段克隆到高表達(dá)質(zhì)粒 PHAC181多克隆位點(diǎn)上，最后對正確的重組子進(jìn)行DNA測序，驗證序列沒有發(fā)生突變，得到 重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAC181-MrS0D。
[0032] 實施例2 :釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（同源重組）
[0033] 根據(jù)構(gòu)建好的重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAC181-MrS0D設(shè)計同源重組引物，利用高保真 PrimeSTARGXL酶對質(zhì)粒pHAC181-MrS0D進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的長片段整合至釀酒酵母菌 株中GAL1啟動子下游。
[0034] 同源重組引物為Fl、R1，序列如SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4所示：
[0039] 基因同源重組（整合）的具體步驟為：
[0040] 1.挑活化的GALl-ScRCHl菌株單菌落，接種到3mlYPD培養(yǎng)基，30°C220rpm培養(yǎng) 過夜。
[0041] 2.取300ul過夜培養(yǎng)物接種到4. 7ml2*YPD中，30°C培養(yǎng)4~5h(達(dá)到0D600 = 0. 6-1. 0)；
[0042] 3.將5ml菌液分3管，室溫離心4000rpm，lmin，棄上清，再用1ml水重懸合并到1 個EP管中，3000rpm離心lmin，棄上清。
[0043] 4.加100ul的0· 1MLiAc溶液，吹吸混勻，12000rpm離心10s，棄上清。
[0044] 5.重復(fù)步驟4。
[0045] 6.依次加入