專利名稱：一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽g13的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽Gl3的方法。
背景技術(shù)：
目前，由于抗生素在臨床中被大量使用，所以產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性問題。人類急需一種新型的藥物來代替抗生素，抗菌肽是一類小分子兩親性多肽，長(zhǎng)度一般小于50個(gè)氨基酸。來源于自然界中的各種細(xì)菌、植物和動(dòng)物，分布廣泛。因其抗菌機(jī)理的獨(dú)特性，所以不易產(chǎn)生耐藥性，并且具有水溶性好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，有望成為傳統(tǒng)抗生素的替代品。顆粒裂解肽(Granulysin)是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL和天然殺傷細(xì)胞NK的顆粒中含有的一種陽離子抗菌肽，G13的結(jié)構(gòu)域是其中含有一個(gè)a-螺旋和loop結(jié)構(gòu)的肽段，由19 個(gè)氨基酸殘基組成，能夠抑制細(xì)菌的活性，而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞沒有影響，因此在醫(yī)療，畜牧，食品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景?？咕牡谋磉_(dá)體系目前有以下幾個(gè)來源，天然抗菌肽雖然來源廣泛，但是在生物體內(nèi)產(chǎn)量小，難于分離純化，成本高?；瘜W(xué)合成抗菌肽雖然周期短、工程量小、能隨意組合氨基酸殘基，但存在消旋化問題，并且生產(chǎn)成本昂貴?；蚬こ碳夹g(shù)主要通過原核表達(dá)和真核表達(dá)途徑，具有操作簡(jiǎn)單，易于分離和純化，且生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，使其具有規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的潛力，成為近些年來的研究熱點(diǎn)。原核表達(dá)體系以大腸桿菌表達(dá)體系為主，是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是生長(zhǎng)周期短，表達(dá)產(chǎn)量較高，成本相對(duì)低廉。但表達(dá)抗菌肽具有以下缺點(diǎn)原核表達(dá)需破碎細(xì)胞釋放抗菌肽，增加了生產(chǎn)成本和分離純化的難度；其持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，添加融合頭融合表達(dá)雖然能夠減少毒性，但需切割融合頭，步驟繁瑣；原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法， 其包括以下步驟a、提供抗菌肽G13基因和a信號(hào)肽基因，所述抗菌肽G13的基因序列為CAAAGAT CTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGAACTGGTAGATCTAGATGGTAA,利用 PCR 的方法獲得合成G13序列的|吳版和引物所述a信號(hào)妝基因序列是以質(zhì)粒pPICZ a A中的a fg 號(hào)肽為模版，利用PCR的方法獲得a信號(hào)肽片段；b、構(gòu)建酵母細(xì)胞中表達(dá)抗菌肽Gl3的重組質(zhì)粒pYES2- a -Gl3 ;C、用重組質(zhì)粒pYES2_a -G13轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSCl細(xì)胞，所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法，采用Bio-red公司電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)PIC程序；
d、篩選轉(zhuǎn)化菌，并進(jìn)行鑒定，所述篩選轉(zhuǎn)化菌的方法為利用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培養(yǎng)基平板培養(yǎng)；e、在30°C,200rpm/min的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌7 9天,獲得抗菌肽G13,所述抗菌肽G13存在于培養(yǎng)酵母菌INVSCl的菌液上清中；f、對(duì)抗菌肽G13進(jìn)行鑒定，所述抗菌肽G13采用Tricine-SDS-PAGE作為鑒定方法。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過釀酒酵母分泌表達(dá)獲得抗菌肽G13，表達(dá)的抗菌肽對(duì)大腸桿菌DH5ci有明顯的抑菌效果。采用酵母表達(dá)系統(tǒng)既有原核生物生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，又有真核生物對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)，釀酒酵母遺傳背景清楚，易操作；釀酒酵母與日常生活密切，安全無毒素，對(duì)生物和環(huán)境都不會(huì)構(gòu)成威脅；可進(jìn)行蛋白翻譯后加工；可進(jìn)行分泌表達(dá)，具有易于純化、工藝簡(jiǎn)單和成本較低等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的方法對(duì)抗菌肽的真核表達(dá)研究具有重要意義。


圖I為重組質(zhì)粒pYES2_ a -G13的構(gòu)建過程示意圖；圖2為a -factor基因的PCR產(chǎn)物的電泳圖；圖3為抗菌肽G13基因的PCR產(chǎn)物的電泳圖；圖4為工程菌誘導(dǎo)上清Tricine-SDS-PAGE電泳圖；圖5為工程菌誘導(dǎo)上清對(duì)大腸桿菌活性檢測(cè)圖；在圖2 中，泳道 M 為 DNA Marker D (2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)， 泳道I為a -factor的PCR產(chǎn)物。在圖3 中，泳道 M 為 DNA Marker D (2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)， 泳道I為抗菌肽G13的PCR產(chǎn)物。在圖 4 中，泳道M為 Protein Marker (66kDa, 45kDa, 35kDa, 27kDa, 20kDa, 14. 4kDa,
9.5kDa，6. 5kDa，4. IkDa)，泳道I為誘導(dǎo)上清65ul，泳道2為未誘導(dǎo)上清IOOul，泳道3為誘導(dǎo)上清35ul。在圖5中，I為工程菌誘導(dǎo)216h 200ul上清，2為無菌水200ul，3為IOug氨芐青霉素，4. 5為工程菌誘導(dǎo)96h 200ul上清，6為工程菌未誘導(dǎo)216h 200ul上清。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。如圖I所示，一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其包括以下步驟a、提供抗菌肽G13基因和 a信號(hào)肽基因，抗菌肽G13的基因序列為CAAAGATCTGT TTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGAACTGGTAGATCTAGATGGTAA,利用 PCR 的方法獲得合成G13序列的模版和引物a信號(hào)肽基因序列是以質(zhì)粒pPICZ a A中的a信號(hào)肽為模版，利用PCR的方法獲得a信號(hào)肽片段；b、構(gòu)建酵母細(xì)胞中表達(dá)抗菌肽Gl3的重組質(zhì)粒pYES2- a -Gl3 ;C、用重組質(zhì)粒pYES2_a -G13轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSCl細(xì)胞，所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法，采用Bio-red公司電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)PIC程序；
d、篩選轉(zhuǎn)化菌，并進(jìn)行鑒定，所述篩選轉(zhuǎn)化菌的方法為利用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培養(yǎng)基平板培養(yǎng)；e、在30°C,200rpm/min的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌7 9天,獲得抗菌肽G13,所述抗菌肽G13存在于培養(yǎng)酵母菌INVSCl的菌液上清中；f、對(duì)抗菌肽G13進(jìn)行鑒定，所述抗菌肽G13采用Tricine-SDS-PAGE作為鑒定方法。本發(fā)明一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法的具體操作過程為(一 )、抗菌肽Gl3序列的獲得抗菌肽G13氨基酸序列為QRSVSNAATRVCRTGRSRW，依照釀酒酵母密碼子偏好，優(yōu)化后的喊基序列為CAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGATCTAGATGG，設(shè)計(jì)模板和上下游引物。引物和模板序列如下Gl3 Fl :5，CCGCTCGAGAAAAGACAAAGATCTGT3’G13 Rl :3’ GGAATTCTTACCATCTAGATCTACCAGTTCTACAAAC5’Gl3 模板5，AAAAGACAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAG3，上游引入Xho I限制性酶切位點(diǎn)，下游引入EcoR I限制性酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增抗菌肽G13基因，PCR反應(yīng)條件94°C 5min，94°C 30s_60°C 30s_72°C lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后_20°C 保存?zhèn)溆谩?二)、a信號(hào)肽序列的獲得以本實(shí)驗(yàn)室保存的pPICZa A質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)上下游引物；F2:5' CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3'R2:5' GCTCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3'上游引入Hind III限制性酶切位點(diǎn)，下游部分引入Xba I和EcoR I限制性酶切位點(diǎn)，同時(shí)為了避免信號(hào)肽切割不完全的現(xiàn)象出現(xiàn)，去除了 Stel3切割位點(diǎn)，僅保留Kex2切割位點(diǎn)。PCR 擴(kuò)增 a 信號(hào)肽PCR 反應(yīng)條件94°C 5min，94°C 30s_60°C 30s_72°C lmin, 30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin。I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后_20°C 保存?zhèn)溆谩?三)、分泌表達(dá)載體pYES2_a的構(gòu)建將pYES2質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增后回收的a信號(hào)肽進(jìn)行Hind III和Xba I雙酶切反應(yīng)， 產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，T4連接酶，16°C Ih進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)菌液PCR鑒定后測(cè)序。(四)、分泌表達(dá)型重組質(zhì)粒pYES2-a -G13的構(gòu)建將抗菌肽G13PCR回收產(chǎn)物與pYES2- a表達(dá)載體進(jìn)行Xho I和EcoR I雙酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，T4連接酶，16°C Ih進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)菌液PCR鑒定后測(cè)序。
(五)、重組質(zhì)粒pYES2-a -G13轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl I、制備釀酒酵母INVScl感受態(tài)細(xì)胞①接種30iU釀酒酵母INVScl凍存甘油菌至3ml YTO液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm，過夜震蕩活化。②轉(zhuǎn)接500 u I過夜活化的釀酒酵母INVScl菌液到50mlYPD液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm，震蕩培養(yǎng)至0D600為I. I左右。③4°C、1500g、5min，離心收集細(xì)胞，用50ml預(yù)冷的無菌水輕輕吹吸懸浮細(xì)胞。④4°C、1500g、5min,離心,用25ml預(yù)冷的無菌水懸浮細(xì)胞。⑤4°C、1500g、5min，離心，用25ml預(yù)冷的山梨醇輕輕吹吸懸浮細(xì)胞。⑥4°C、1500g、5min,離心,用2ml預(yù)冷的山梨醇懸浮細(xì)胞。⑦4°C、1500g、5min，離心，用200 預(yù)冷的山梨醇懸浮細(xì)胞，分裝到兩管2ml的EP管中，每管IOOu I02、轉(zhuǎn)化pYES2_a -G13質(zhì)粒質(zhì)粒到釀酒酵母INVScl感受態(tài)細(xì)胞中①吸取10 U I pYES2- a -G13質(zhì)粒加入到100 U I釀酒酵母INVScl感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻，加至預(yù)冷的電擊杯中。②冰上放置5min。③根據(jù)電擊儀推薦的釀酒酵母參數(shù)設(shè)置，進(jìn)行點(diǎn)擊。④立即向電擊杯中加入500 U I預(yù)冷的山梨醇溶液，混合均勻。⑤全部吸出均勻涂于SC-U平板。⑥置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，直至長(zhǎng)出單克隆。3、菌落PCR反應(yīng)篩選陽性菌落。從SC-U平板上選5個(gè)單菌落做編號(hào)標(biāo)記，用槍頭挑取少量菌體加到PCR體系中，PCR反應(yīng)條件94°C 5min，94°C 30s_60°C 30s_72°C lmin,30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選出陽性菌落。(六)、抗菌肽G13釀酒酵母工程菌的表達(dá)I、誘導(dǎo)工程菌表達(dá)重組G13結(jié)構(gòu)域，具體步驟如下①轉(zhuǎn)接200 ill抗菌肽G13釀酒酵母工程菌至20ml SC-U液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm,過夜活化。②測(cè)量菌液的0D600值(Y)，按公式X = (Y*20) /0. 4，計(jì)算將菌液的0D600稀釋到0. 4所需的SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基量(X)。③4°C、1500 X g、離心5min，棄上清，按第二步中計(jì)算出的X值加入SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基，吹吸懸浮，混合均勻。④30°C, 200rpm,振蕩培養(yǎng) 7-9 天。取 Iml 菌液,4°C、1500 X g、離心 5min,留上清。2、丙酮沉淀濃縮重組G13結(jié)構(gòu)域，具體步驟如下①取Iml上清加入5ml-20°C預(yù)冷的丙酮。②靜置_20°C冰箱中2h。③4°C, 12000rpm,離心IOmin,輕輕棄去上清。④沉淀置于通風(fēng)處自然風(fēng)干。3、Tricine-SDS-PAGE 電泳檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。(七)、抗菌肽G13結(jié)構(gòu)域的活性檢測(cè)
E. coli DH5 a于37°C，180rpm，過夜培養(yǎng)。測(cè)菌液的0D600值，將其稀釋到0. 5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?I. 5X108CFU/ml)。 吸取200 U I菌液，均勻涂布于沒有抗生素的LB平板上，輕輕放置牛津杯。吸取誘導(dǎo)上清200ul加入牛津杯中，對(duì)照為無菌水、SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基、未誘導(dǎo)上清、AMP，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日觀察抑菌效果。其中釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) INVScl 購自 Invitrogen 公司；pYES2表達(dá)載體購自Invitrogen公司；pPICZ a A表達(dá)載體購自Invitrogen公司；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 a在市面上可容易買到。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上內(nèi)容僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的簡(jiǎn)單修改或者等同替換，均不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a、提供抗菌肽G13基因和a信號(hào)肽基因；b、構(gòu)建酵母細(xì)胞中表達(dá)抗菌肽G13的重組質(zhì)粒pYES2_a-G13 ；C、用重組質(zhì)粒pYES2- a -G13轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSCl細(xì)胞；d、篩選轉(zhuǎn)化菌，并進(jìn)行鑒定；e、在30°C,200rpm/min的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌7 9天,獲得抗菌肽G13；f、對(duì)抗菌肽G13進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在所述步驟a中所述抗菌肽G13的基因序列為CAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGAACTGGTAGATCTAGATGGTAA,利用PCR的方法獲得合成G13序列的模版和引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在步驟a中所述a信號(hào)肽基因序列是以質(zhì)粒pPICZ a A中的a信號(hào)肽為模版，利用PCR的方法獲得a信號(hào)肽片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在步驟c中所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法，采用Bio-red公司電轉(zhuǎn)化儀預(yù)設(shè)PIC程序。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在步驟d中所述篩選轉(zhuǎn)化菌的方法為利用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培養(yǎng)基平板培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在步驟e中所述抗菌肽G13存在于培養(yǎng)酵母菌INVSCl的菌液上清中。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，其特征在于在步驟f中所述抗菌肽G13采用Tricine-SDS-PAGE作為鑒定方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用釀酒酵母表達(dá)抗菌肽G13的方法，該方法包括以下步驟a、提供抗菌肽G13基因和α信號(hào)肽基因；b、構(gòu)建酵母細(xì)胞中表達(dá)抗菌肽G13的重組質(zhì)粒pYES2-α-G13；c、用重組質(zhì)粒pYES2-α-G13轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSC1細(xì)胞；d、篩選轉(zhuǎn)化菌，并進(jìn)行鑒定；e、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌，獲得抗菌肽G13；f、對(duì)抗菌肽G13進(jìn)行鑒定。本發(fā)明通過釀酒酵母分泌表達(dá)獲得抗菌肽G13，表達(dá)的抗菌肽對(duì)大腸桿菌DH5α有明顯的抑菌效果。采用酵母表達(dá)系統(tǒng)既有原核生物生長(zhǎng)快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，又有真核生物對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾的優(yōu)點(diǎn)，釀酒酵母遺傳背景清楚，本發(fā)明的方法對(duì)抗菌肽的真核表達(dá)研究具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102618551SQ20121007306
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者余忠麗, 盧穎虎, 吳敵, 惲輝, 李偉霞, 查向東, 梁琳, 程林春, 耿玉靜, 趙大偉, 車媛媛, 馬麗娟 申請(qǐng)人:安徽希普生物科技有限公司