一株表達(dá)角蛋白酶的重組畢赤酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株表達(dá)角蛋白酶的重組畢赤酵母及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國每年在養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)和紡織工業(yè)的生產(chǎn)過程中都產(chǎn)生數(shù)十萬噸的羽毛、羊 毛和動物角質(zhì)等廢物，這些廢物的主要成分是角蛋白，由于其結(jié)構(gòu)致密，因此很難被充分利 用，大多數(shù)成為垃圾，不僅對環(huán)境造成污染，而且也是一種資源的浪費(fèi)。
[0003] 角蛋白酶能夠特異性的降解角蛋白，且降解產(chǎn)物中含有動物生長所需要的必需氨 基酸，所以可以利用角蛋白來降解羽毛、羊毛和動物角質(zhì)等角蛋白廢物，來生產(chǎn)動物飼料及 有機(jī)肥料。然而，角蛋白酶來源的原始菌株通常對角蛋白酶的表達(dá)量很低，不能用于工業(yè)化 生產(chǎn)，所以利用生物技術(shù)的方法構(gòu)建一株高產(chǎn)角蛋白酶至關(guān)重要。
[0004] 針對野生菌產(chǎn)酶效率低的問題，通常是將目的基因克隆到常用的表達(dá)載體中，然 后利用已知的高效表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)目的產(chǎn)物。但由于宿主菌的自身修飾，表達(dá)的產(chǎn)物酶 活降低，且角蛋白酶對宿主菌本身有強(qiáng)烈的毒害作用，因此，產(chǎn)量一直很低，不能用于產(chǎn)業(yè) 化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題首先是提供一株表達(dá)角蛋白酶的重組畢赤酵母，是以畢 赤酵母SMD1168為宿主，以pPIC9k為載體，表達(dá)了角蛋白酶。
[0006] 所述角蛋白酶基因的序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是應(yīng)用所述重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶，是 將重組菌的種子培養(yǎng)液，按接種量12-13%接種到裝液量25-30%的3L全自動發(fā)酵罐中，以 50 %氨水和磷酸溶液控制pH 5. 5,溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通氣量維持在2vvm ; 當(dāng)甘油耗盡，開始以指數(shù)流加方式流加350mL的含12mL/L PTMl的50g/L的甘油，維持比生 長速率在0. 18h 1左右，并逐漸將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)到lOOOrpm，通氣量調(diào)節(jié)到4vvm ;待甘油再次 耗盡，繼續(xù)保持體系中基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih且D0>60 %后，開始流加100 %甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘 導(dǎo)產(chǎn)酶，以反饋流加的方式維持培養(yǎng)基中的甲醇濃度在I. 8% (v/v)。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式紅，種子液的獲得是將重組菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)H)平板上，挑 取單菌落接種到含有IOOmL的YH)培養(yǎng)基的IL搖瓶中，置于搖床中30°C，220rpm培養(yǎng)24h 作為種子液。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式紅，發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基：5 %磷酸26. 7ml/ L，K2S0418. 2g/L，CaSO4O. 93g/L，MgSO4 · 7H20 14. 9g/L，KOH 4. 13g/L，甘油 40.0 g/L， PTM14. 35mL/L。
[0010] 本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，168h時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到174. lg/L，胞外角蛋白 酶酶活達(dá)到1156U/mL，更適合工業(yè)化生產(chǎn)角蛋白酶。
【附圖說明】
[0011] 圖1 :重組質(zhì)粒pPIC9k-kerD的結(jié)構(gòu)圖。
[0012] 圖2 :重組菌株在3L發(fā)酵罐條件下，產(chǎn)角蛋白酶能力和生物量隨時(shí)間的變化趨勢。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 目的產(chǎn)物對角蛋白的降解活力的測定方法：取兩只I. 5mL的EP管，分為樣品組和 對照組，都分別加入150 μ L pH 9. 0的50mM甘氨酸-NaOH緩沖液、50 μ L的發(fā)酵上清液，對 照組再馬上加入200 μ L的4%的三氯乙酸溶液混勻，然后都分別再加入100 μ L的2. 5%的 角蛋白溶液，馬上置于50°C金屬浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)20min后再向樣品組中加入200 μ L的4% 的三氯乙酸溶液混勻。然后1000 Orpm下離心5分鐘。分別取200 μ L上清液與新的I. 5mL 的EP管中，再分別加入ImL的4M的NaCO3溶液、200uL的福林酚溶液，50°C金屬浴中準(zhǔn)確反 應(yīng)lOmin，冷卻至室溫后，利用分光光度計(jì)測定660nm處吸光值，以三氯乙酸使酶失活的對 照組作對照。（根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算酶活）酶活的定義：在50°C，pH 9.0條件下，角蛋 白酶催化角蛋白反應(yīng)過程中，Imin生成1 μ g的酪氨酸所需的酶量為一個(gè)角蛋白酶酶活力 單位，以U/mL表示。
[0014] 實(shí)施例1重組菌株的構(gòu)建
[0015] 從Stenotrophomonas maltophilia BBEll-I克隆得到編碼角蛋白酶的基因，優(yōu)化 后得到核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的編碼角蛋白酶的基因，然后將其克隆到表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9k上，獲得重組質(zhì)粒pPIC9k-kerD。之后將重組質(zhì)粒線性化整合到畢赤酵母SMD1168 感受態(tài)細(xì)胞中。
[0016] 具體如下：
[0017] 根據(jù)kerD的基因序列，設(shè)計(jì)如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示的引物EcoRI-F、 Notl-R，通過PCR分別在基因兩端添加 EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物和載體pPIC9k 分別用EcoRI和NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌GM109 感受態(tài)細(xì)胞，利用含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段 大小正確后再進(jìn)行測序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質(zhì)粒pPIC9k-kerD (重組質(zhì)粒 結(jié)構(gòu)如圖1所示）。然后從重組GM109中提取重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒用SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化 畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，MD平板篩選His+型（組氨酸缺陷回復(fù)突變型）重組菌株， 再將得到的陽性克隆轉(zhuǎn)接到MM平板上篩選Mut+型（甲醇利用快速型）的重組菌株。將篩 選到的Mut+型的重組菌株分別轉(zhuǎn)接到含有l(wèi)mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml濃度的 G418的YH)平板上，篩選到含有不同拷貝數(shù)的目的基因的重組菌株，最后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn) 證，篩選得到 P. pastoris SMD1168-pPIC9k_kerD〇
[0018] 電轉(zhuǎn)化條件為：15 μ 1質(zhì)粒（500ng/ml)加入到85 μ 1的SMDl 168感受態(tài)細(xì)胞中，混 合后移入預(yù)冷的2mm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置10分鐘。電壓1500ν，電容25 μ F，電阻200 Ω。 電擊后加 Iml預(yù)冷的IM的山梨醇溶液至電轉(zhuǎn)杯，混勻后將溶液轉(zhuǎn)移至I. 5ml的EP管中， 3000rpm離心2min，去上清。加入100 μ 1預(yù)冷的IM的山梨醇溶液，涂布MD平板。
[0019] 表1引物
[0020]
[0021] 實(shí)施例2keratinase的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測
[0022] 將重組菌株用250ml搖瓶進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，同時(shí)檢測不同時(shí)間發(fā)酵液上清的角蛋白 酶活性，并對發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0023] 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)具體如下：
[0024] 1)將重組菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD平板上，然后挑選單菌落接種到裝有25mL BMGY培養(yǎng)基 的 250ml 搖瓶中，于 28-30°C /250-300rpm 培養(yǎng)至 0D_= 2-6(16-18h);
[0025] 2)室溫下1500-3000g離心5min，收集菌體，用50mL的BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使 〇D6。。= I. 0 左右；
[0026] 3)將步驟2所得的（約100-200mL)菌液置于500mL的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉 布封口，放置于28-30°C /250-300rpm的搖床上繼續(xù)生長；
[0027] 4)每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0. 5~1. 0% ;
[0028] 5)按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為lmL，置于I. 5mLEP管中，最大轉(zhuǎn)速離心 2~3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般 取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和9611。
[0029] 結(jié)果表明重組菌株的產(chǎn)酶效果較好，而通過SDS-PAGE分析，重組菌株發(fā)酵液上清 中的蛋白跟轉(zhuǎn)了空載的對照菌株和未用甲醇誘導(dǎo)的出發(fā)菌株相比，均多出了一條大小約 40kD的條帶。之后對蛋白條帶進(jìn)行MALDI-T0F-MS/MS分析，結(jié)果表明，該條帶的蛋白即為目 的蛋白。
[0030] 實(shí)施例3重組菌株在3L發(fā)酵罐上的產(chǎn)酶性能的上的驗(yàn)證
[0031 ] 將重組菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD平板上，挑取單菌落接種到含有IOOmL的YH)培養(yǎng)基的IL 搖瓶中，置于搖床中30°C，220rpm培養(yǎng)24h作為種子液。然后將其接種到含有800mL的BSM 培養(yǎng)基的3L全自動發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTR0N，Korea)中。以50%氨水和磷酸溶液控制 ρΗ5· 5,溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通氣量維持在2vvm ;當(dāng)甘油耗盡（D0迅速上升， 且D0>60 %時(shí)），開始以指數(shù)流加方式流加350mL的50 % (W/V)甘油（含12mL/L PTMl)，維 持比生長速率在〇· 18h 1左右，并逐漸將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)到lOOOrpm，通氣量調(diào)節(jié)到4vvm。待 甘油再次耗盡，繼續(xù)保持體系中基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih且D0>60%后，開始流加100%甲醇，以 反饋流加的方式維持培養(yǎng)基中的甲醇濃度在1.8% (v/v)。從發(fā)酵開始每隔12h取一次樣， 7000rpm下離心I. 5min，分別取上清和菌體，測定菌體干重和上清酶活。
[0032] 重組菌株在3L灌上產(chǎn)酶效果如圖所示，結(jié)果表明，重組菌株在3L灌上發(fā)酵168h 時(shí)干重達(dá)到174. lg/L，酶活達(dá)到1156U/mL。
[0033] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株表達(dá)角蛋白酶的重組畢赤酵母，其特征在于，是以畢赤酵母SMD1168為宿主，以 pPIC9k為載體，表達(dá)了角蛋白酶；編碼所述角蛋白酶的基因的序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母在生產(chǎn)角蛋白酶中的應(yīng)用。3. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的方法，其特征在于，是 將重組菌的種子培養(yǎng)液，按接種量12-13%接種到裝液量25-30%的3L全自動發(fā)酵罐中，以 50 %氨水和磷酸溶液控制pH 5. 5,溫度30°C，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通氣量維持在2vvm ; 當(dāng)甘油耗盡，開始以指數(shù)流加方式流加350mL的含12mL/L PTMl的50g/L的甘油，維持比生 長速率在0. 18h 1左右，并逐漸將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)到lOOOrpm，通氣量調(diào)節(jié)到4vvm ;待甘油再次 耗盡，繼續(xù)保持體系中基質(zhì)匱乏狀態(tài)約Ih且D0>60%后，開始流加100%甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，以 反饋流加的方式維持培養(yǎng)基中的甲醇的體積濃度在1. 8%。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)液的獲得是將重組菌株轉(zhuǎn)接到 YPD平板上，挑取單菌落接種到含有IOOmL的YH)培養(yǎng)基的IL搖瓶中，置于搖床中30°C， 220rpm培養(yǎng)24h作為種子液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基：5%磷酸 26. 7ml/L，K2SO4 18. 2g/L，CaSO4 0? 93g/L，MgSO4 ? 7H20 14. 9g/L，KOH 4. 13g/L，甘油 40.0 g/ L，PTMl 4.35mL/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株表達(dá)角蛋白酶的重組畢赤酵母及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明以畢赤酵母SMD1168為宿主，以pPIC9k為載體，表達(dá)了角蛋白酶。本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，168h時(shí)細(xì)胞干重達(dá)到174.1g/L，胞外角蛋白酶酶活達(dá)到1156U/mL，更適合工業(yè)化生產(chǎn)角蛋白酶。
【IPC分類】C12N1/19, C12N9/60, C12R1/84
【公開號】CN105018365
【申請?zhí)枴緾N201510432148
【發(fā)明人】張娟, 陳堅(jiān), 李光磊, 堵國成, 方真
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月21日