專利名稱：：一種利用畢赤酵母高效表達dna聚合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是外源基因的誘導(dǎo)表達技術(shù)，特別是一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，是DNA聚合酶表達、生產(chǎn)的一種新思想、新途徑、新方法。
背景技術(shù)：
：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是現(xiàn)代分子生物學(xué)最重要的基本研究手段之一。此項技術(shù)因其操作簡單、快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的領(lǐng)域中。DNA聚合酶作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的重要工具之一，在PCR過程中起著至關(guān)重要的作用。直到1988年，Rand11KSaiki等(SaikiRK,GelfandDH,StoffelS,ScharfS,etal.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science,1988,239487-491)從Thermusaquatics中分離純化獲得了TaqDNA聚合酶，并成功地將其應(yīng)用于PCR技術(shù)，大大簡化了PCR流程，使PCR過程實現(xiàn)了自動連續(xù)循環(huán)，應(yīng)用領(lǐng)域逐漸拓寬。因此，如何進一步提高DNA聚合酶的產(chǎn)量及各項酶學(xué)性能，并利用它實現(xiàn)方便、快捷、高效的PCR，以滿足不同科學(xué)研究及實際應(yīng)用的需要，已經(jīng)成為目前廣大分子生物學(xué)學(xué)者關(guān)注的焦點。由于大部分用于PCR的DNA聚合酶來源于古細菌，因此，人們傾向于用原核表達系統(tǒng)，而不是真核表達系統(tǒng)來表達DNA聚合酶。因此，目前國內(nèi)外眾多研究將編碼極端酶的基因在異源普通宿主菌(如大腸桿菌)中進行表達，通過該方法表達的蛋白質(zhì)大多數(shù)都能維持原來的熱穩(wěn)定性，它們通常在低溫下折疊，并不被宿主的蛋白酶水解，因此可以通過熱變性的方法除去宿主蛋白而進行純化，酶產(chǎn)量亦有所提高，是相對經(jīng)濟的方法，從一定程度上促進了PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，并節(jié)約了PCR成本，但是在這個過程中仍然面臨著純化困難，成本較高等各禾中各樣的問題(FrancoisBaneyxRecombinantproteinexpressioninEscherichiacoliCurrentOpinioninBiotechnologyVolume10,Issue5,IOctober1999,Pages411-421)。例如，如果培養(yǎng)溫度過高，生長速度過快或生長過度，外源基因表達的目的蛋白大多數(shù)容易形成包涵體，這就需要將其轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白，這個步驟不但繁瑣而且會降低酶活性。人們不斷嘗試對接種量、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)前細胞生長時間和誘導(dǎo)后細胞密度等因素做進一步的優(yōu)化，以期待提高目的蛋白的表達量和比活性，甚至是某些酶學(xué)性能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，提供了除大腸桿菌表達DNA聚合酶以外的新方法。具體做法如下1)設(shè)計一對5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA堿基的引物，通過PCR的方法，將擴增下的產(chǎn)物，在dTTP的保護下經(jīng)T4DNA聚合酶12°C處理20min后得到帶有CopI和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，與經(jīng)過CopI和NotI依次酶切的畢赤酵母分泌型表達載體PHBM905A連接，獲得重組的畢赤酵母表達質(zhì)粒；2)將畢赤酵母重組表達質(zhì)粒用SalI酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細胞，涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD(1.34%YNB,2%葡萄糖，1%(NH4)2S04，4XIO-5Biotin,1.5%Agar)平板，25°C_30°C培養(yǎng)2-4天，獲得重組轉(zhuǎn)化子；3)提取轉(zhuǎn)化子基因組，通過PCR的方法鑒定已經(jīng)正確插入DNA聚合酶基因的陽性克??；4)接種鑒定驗證正確的重組轉(zhuǎn)化子于50mLBMGY(2%Tryptone，1%Yeastextract，0.34%YNB,1%(NH4)2SO4,1OOmmo1/L磷酸鉀緩沖液pH6·0，甘油)培養(yǎng)基中，250C-300C150-250r/min培養(yǎng)40_50h，至0D_為6-10，于室溫離心3000_6000r/min，5min,收集菌體；將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY(2%Tryptone，1%Yeastextract，0.34%YNB,1%(NH4)2S04，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0)培養(yǎng)基中，25°C_30°C，150_250r/min培養(yǎng)，每隔24h補加一次甲醇(加量為培養(yǎng)基體積的0.5%)；表達時間24h-96h5)取表達上清液分析表達水平，其中表達時間為72h時表達水平為最佳，所得上清液即為表達粗酶液。本發(fā)明表達的DNA聚合酶基因，包括DNA依賴性DNA聚合酶基因和RNA依賴性DNA聚合酶基因。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)DNA聚合酶基因表達的載體是所有畢赤酵母表達載體，包括胞內(nèi)表達載體和胞外表達載體。本發(fā)明與現(xiàn)有的通過大腸桿菌表達聚合酶的方法相比具有的優(yōu)勢一、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達方法，操作簡單、成本低廉。相比大腸桿菌表達系統(tǒng)而言，畢赤酵母菌營養(yǎng)需求水平低、生長速度快、培養(yǎng)基價格低廉，進一步節(jié)約了成本。二、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達方法，純化步驟簡單。畢赤酵母表達載體的啟動子為醇氧化酶(AOXl)基因啟動子，能夠?qū)ν庠吹鞍椎谋磉_進行嚴(yán)格調(diào)控，本發(fā)明通過該系統(tǒng)表達的外源蛋白可以分泌到胞外，內(nèi)源蛋白分泌量極少，避免了支原體污染，利于外源蛋白的分離與純化，而大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的蛋白，背景高，分離純化耗費時間長，操作步驟繁瑣。三、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達方法，所表達的DNA聚合酶酶學(xué)性能表現(xiàn)更加優(yōu)異。經(jīng)過驗證，與大腸桿菌表達系統(tǒng)比較，通過該方法表達的聚合酶PCR產(chǎn)量、熱穩(wěn)定性有明顯的提高，聚合酶的保真性有了小幅度提高。四、本發(fā)明提出的DNA聚合酶表達方法，便于進行規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)過多年的不斷發(fā)展與完善，畢赤酵母表達系統(tǒng)的高密度發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的比較成熟，利于DNA聚合酶規(guī)?；a(chǎn)，極大程度上滿足不斷增長的研究及應(yīng)用需求。圖1為本發(fā)明畢赤酵母重組表達載體構(gòu)建過程。首先，通過引物設(shè)計使用高保真酶擴增目的基因片段后(①)，回收，然后在dTTP存在的條件下，用T4DNA聚合酶于12°C處理該片段20min(②)，生成粘性末端，同時將pHBM905A質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶CopI和NotI依次酶切，產(chǎn)生兩個帶有固定堿基的單鏈粘性末端(③)，瓊脂糖膠回收目的片段。最后，將雙酶切后的載體和T4DNA聚合酶處理后片段經(jīng)SolutionI連接酶16°C連接2h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOii菌株，氨芐青霉素抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對、PCR鑒定以及酶切鑒定獲得完整的重組質(zhì)粒。圖2為畢赤酵母表達RKOD酶SDS-PAGE檢測。泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，泳道1為GS-905A空載體誘導(dǎo)后樣品，泳道2-5分別為酵母重組菌株GS-RKOD誘導(dǎo)24h、48h、72h、96h的樣品。圖3大腸桿菌表達RKOD酶與酵母表達RKOD酶的SDS-PAGE檢測對比。泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，泳道1為酵母重組菌株GS-RKOD誘導(dǎo)72h樣品，泳道2為30a_RK0D誘導(dǎo)破菌后上清樣品，泳道3為30a-RK0D誘導(dǎo)后鎳珠純化后樣品。圖4為酵母RKOD酶DNAse活性分析。泳道Ml為λDNA-EcoT14marker,泳道M2為λDNA-HindIIImarker；泳道3為pET30a質(zhì)粒；泳道1、2、4分別為IOU的粗酶液與λDNA-EcoT14,λDNA-HindIII、SupercoiledpET30aDNA37°C孵育24小時后樣品。圖5為大腸桿菌表達RKOD酶與酵母表達RKOD酶的PCR擴增效率分析。a)圖中，泳道M為AEcoT14DNAMarker，泳道1_4分別為大腸桿菌表達RKOD酶、酵母表達RKOD酶、TaqDNA聚合酶和primerstarDNA聚合酶的擴增樣品(目的片段大小1.8kb)；b)圖中，泳道M為λEcoT14DNAMarker,泳道1_2為大腸桿菌表達RKOD酶的擴增樣品，泳道3_5為酵母表達RKOD酶的擴增樣品(目的片段大小2.5kb)。圖6為大腸桿菌表達RKOD酶與酵母表達RKOD酶的熱穩(wěn)定性對比研究。泳道M為λEcoT14DNAMarker,泳道1_3為大腸桿菌表達RKOD酶100°C熱處理Ih后三個片段的PCR產(chǎn)物，泳道4-6為畢赤酵母表達RKOD酶100°C熱處理Ih后三個片段的PCR產(chǎn)物，泳道7_9為畢赤酵母表達RKOD酶1處理100°C熱處理2h后三個片段的PCR產(chǎn)物，泳道10-12為大腸桿菌表達RKOD酶100°C熱處理2h后三個片段的PCR產(chǎn)物，泳道13-15為畢赤酵母表達RKOD酶處理100°C熱處理3h后三個片段的PCR產(chǎn)物，泳道16-18為大腸桿菌表達RKOD酶100°C熱處理3h后三個片段的PCR產(chǎn)物。具體實施例方式下面以實例對本發(fā)明進一步說明實施例1利用本發(fā)明方法在酵母中表達本實驗室合成的來源于Thermococcuskodakarensis菌種的DNA聚合酶基因，以后統(tǒng)稱為RK0D。首先，將pHBM905A質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶CopI和NotI依次酶切，產(chǎn)生帶有兩個固定堿基單鏈粘性末端的載體，瓊脂糖膠回收該載體。其次，根據(jù)已知基因序列，采用GeneTool軟件設(shè)計RK0D_905aF:5‘GTCAATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG3'和RK0D_905aR5'GGCCATATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC3'兩條引物，使用primerstarDNA聚合酶進行PCR擴增，得到RKOD(2.5kb)基因片段，將該片段瓊脂糖膠回收后，在dTTP存在的條件下，用T4DNA聚合酶12°C處理20min，生成與PHBM905A載體相配對的粘性末端，回收片段。然后將載體和片段經(jīng)SolutionI酶16°C連接2個小時后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOβ感受態(tài)細胞，氨芐青霉素LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對、PCR鑒定及酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒(見圖1)。隨機挑選重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒分別命名為905A-RK0D。接著，將重組質(zhì)粒905A-RK0D用SalI酶切線性化，將回收后的酶切產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細胞，然后涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，28°C培養(yǎng)3天，獲得重組轉(zhuǎn)化子。隨機提取轉(zhuǎn)化子基因組，以其為模板，RK0D-905AF/RK0D-905AR為引物進行PCR鑒定，故擴增得到2.5kb產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子即為陽性克隆，將驗證正確的重組克隆命名為GS-RK0D。最后，將鑒定驗證正確的重組轉(zhuǎn)化子GS-RKOD接種于50mLBMGY培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)48h，至OD6tltl為6_9，于室溫離心5000r/min，5min,收集菌體，隨后，將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY培養(yǎng)基中，28°C、200r/min培養(yǎng)，每隔24h補加一次甲醇(加量為培養(yǎng)基體積的0.5%)，GS-RKOD陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)誘導(dǎo)表達后，分別取24h，48h，72h，96h表達上清液進行SDS-PAGE電泳，分析不同時段的蛋白質(zhì)表達水平，(見圖2)。實施例2通過大腸桿菌表達體系表達本實驗室合成的來源于Thermococcuskodakarensis菌種的DNA聚合酶基因(RK0D基因)，作為實施例1的對比，以驗證通過酵母表達DNA聚合酶這種方法的優(yōu)越性。首先，根據(jù)已知基因序列，通過GENET00L軟件，設(shè)計引物(正向引物5'ATGATCCTCGACACTGACTACATAACCG3'；反向引物5，TTATTTTTTCTGTTTTTCCAGCATCTGC3’)擴增RKOD基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測有清晰條帶后，瓊脂糖膠回收該片段。然后將pET-30a質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRV37°C酶切2小時，形成線性平末端載體。然后將載體和片段經(jīng)SolutionI酶16°C連接2個小時后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOβ感受態(tài)細胞，卡那霉素LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒大小比對、PCR鑒定及酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒。隨機挑選重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒分別命名為30a-RK0D。然后將測序正確的重組質(zhì)粒30a_RK0D轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，挑單菌落接種于卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12小時，轉(zhuǎn)接入IOOmL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm培養(yǎng)至OD6tltl為0.5-0.6時，加入IMIPTG50μL，16°C、200rpm誘導(dǎo)12小時。然后于4°C、6000rpm離心收集菌體5min，加入5mLPBS，混勻，超聲波破菌，4°C、12000rpm離心2min取上清，鎳珠純化，進行SDS-PAGE電泳，分析表達水平(見圖3)。實施例1與實施例2的結(jié)果分析經(jīng)過對初酶液蛋白濃度測定試劑盒測定，通過酵母分泌表達的RKOD酶最佳誘導(dǎo)時間為48h-72h，表達量在誘導(dǎo)至72h時可達到181mg/L，活性濃度為15U/mL，比活力為63.5U/mg；DNase活性分析表明，酵母初酶液DNase活性較低(見圖4)。通過對兩種分別在大腸桿菌和酵母里面表達的聚合酶的擴增性能分析發(fā)現(xiàn)，酵母表達的聚合酶PCR產(chǎn)量與商品化的高保真聚合酶PCR的產(chǎn)量相當(dāng)(見圖5a)，但是明顯高于大腸桿菌表達聚合酶的PCR產(chǎn)量(見圖5b)，；SDS-PAGE檢測表明，與大腸桿菌表達的聚合酶相比，雜蛋白少，純度高(見圖3)；與大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的聚合酶酶相比，酵母表達的聚合酶的熱穩(wěn)定性明顯提高(見圖6)；通過DNA聚合酶保真性分析表明，與大腸桿菌表達的聚合酶相比，酵母表達的聚合酶擴增忠實性略微提高(大腸桿菌表達的聚合酶錯配率約為1.38X10_6，酵母表達的聚合酶錯賠率約為1.lX10"6,TaqDNA聚合酶錯配率約為1X1(T5，primerstarDNA聚合酶錯配率約為1X10-6)。本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DHlOβ購置于Invitrogen公司，PichiapastorisGS115感受態(tài)細胞和ρΗΒΜ905Α質(zhì)粒均由本實驗室保存，限制性內(nèi)切酶(CopI、EcoRV、NotI、SalI等)購自Promega公司，primerstarDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、6T4DNA聚合酶、SolutionI酶、鎳珠均購于TaKaRa公司，所有引物均由上海捷瑞生物公司合成。權(quán)利要求一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，其特征在于1)設(shè)計一對5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA堿基的引物，通過PCR的方法，將擴增下的產(chǎn)物，在dTTP的保護下經(jīng)T4DNA聚合酶12℃處理20min后得到帶有CopI和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，與經(jīng)過CopI和NotI依次酶切的畢赤酵母分泌型表達載體pHBM905A連接，獲得重組的畢赤酵母表達質(zhì)粒；2)將畢赤酵母重組表達質(zhì)粒用SalI酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至PichiapastorisGS115酵母感受態(tài)細胞，涂布組氨酸缺陷培養(yǎng)基MD平板，25℃-30℃培養(yǎng)2-4天，獲得重組轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)基MD組成為1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，4×10-5％Biotin，1.5％Agar；3)提取轉(zhuǎn)化子基因組，通過PCR的方法鑒定獲得已經(jīng)正確插入DNA聚合酶基因的陽性克隆；4)接種鑒定驗證正確的重組轉(zhuǎn)化子于50mLBMGY培養(yǎng)基中，25℃-30℃150-250r/min培養(yǎng)40-50h，至OD600為6-10，于室溫離心3000-6000r/min，5min，收集菌體；將菌體轉(zhuǎn)移至25mLBMMY培養(yǎng)基中，25℃-30℃，150-250r/min培養(yǎng)，，每隔24h補加一次為培養(yǎng)基體積0.5％的甲醇，表達時間24h-96h；BMGY培養(yǎng)基為2％Tryptone，1％Yeastextract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0，1％甘油；BMMY培養(yǎng)基為2％Tryptone，1％Yeastextract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸鉀緩沖液pH6.0；5)取表達上清液分析表達水平，其中表達時間為72h時表達水平為最佳。2.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，其特征是表達DNA聚合酶基因，包括DNA依賴性DNA聚合酶基因和RNA依賴性DNA聚合酶基因。3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法，其特征在于用于實現(xiàn)DNA聚合酶基因表達的載體是所有畢赤酵母表達載體，包括胞內(nèi)表達載體和胞外表達載體。全文摘要本發(fā)明提出了一種利用畢赤酵母高效表達DNA聚合酶的方法。表達步驟為1)將DNA聚合酶基因克隆至巴斯德畢赤酵母分泌型表達載體中，獲得畢赤酵母重組表達質(zhì)粒；2)將此重組表達質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母宿主菌GS115，經(jīng)MD平板和PCR鑒定篩選陽性克隆；3)挑取陽性克隆利用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達。本發(fā)明能夠用于表達DNA聚合酶基因。通過驗證，與大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，該方法能夠明顯提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性等性能，且能夠降低生產(chǎn)成本，縮短工藝流程，簡化純化步驟。文檔編號C12N15/54GK101886087SQ201010229160公開日2010年11月17日申請日期2010年7月13日優(yōu)先權(quán)日2010年7月13日發(fā)明者余曉嵐,卞璐,趙慧,馬立新申請人:湖北大學(xué)