一種小激活rna及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種小激活RNA，所述小激活RNA由包含25～30個核苷酸的正義序列和包含25～30個核苷酸的反義序列組成，所述反義序列中至少有80％的序列與所述正義序列形成互補(bǔ)；所述正義序列或反義序列中包含具有19～25個核苷酸的匹配片段，所述匹配片段至少有80％的序列與靶基因調(diào)控序列的片段互補(bǔ)。本發(fā)明的作為Dicer底物的小激活RNA能在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平激活基因表達(dá)，有效地模仿內(nèi)源性雙鏈小RNA的自然成熟過程，并有效提高RNA激活的效率。
【專利說明】
_種小激活RNA及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及雙鏈小RNA在RNA激活技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1998年Fire和Mello在線蟲中發(fā)現(xiàn)了雙鏈小RNA分子（dsRNA)能觸發(fā)一種進(jìn)化 保守的基因表達(dá)沉默機(jī)制，該機(jī)制被稱為RNA干擾（RNAi)，這種小RNA分子被稱為小干擾 RNA(siRNA)。由于siRNA能夠特異性地沉默靶基因的表達(dá)，因而被認(rèn)為非常有希望開發(fā)成 新的治療疾病的基因靶向藥物。RNA干擾是通過內(nèi)源性dsRNA分子或者是外源性導(dǎo)入siRNA 而觸發(fā)的。內(nèi)源性的dsRNA是由更長的單鏈RNA在形成發(fā)卡型結(jié)構(gòu)后被細(xì)胞內(nèi)的一種稱為 Dicer的蛋白處理而成的。由細(xì)胞外將成熟的siRNA引入細(xì)胞也可以觸發(fā)RNA干擾。這些 成熟的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被一種稱為Argonaute (AGO)的蛋白裝載，然后dsRNA引導(dǎo)AGO與 細(xì)胞漿內(nèi)序列互補(bǔ)的mRNA序列結(jié)合，AGO進(jìn)而切割并降解mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。2006 年Li等發(fā)現(xiàn)針對于基因調(diào)控序列如啟動子的dsRNA能觸發(fā)與RNA干擾完全相反的作用， 即在基因轉(zhuǎn)錄及表觀遺傳水平增加基因表達(dá)，并命名該現(xiàn)象為RNA激活（RNAa)，將這種針 對基因啟動子的小RNA稱為小激活RNA (small activating RNA，saRNA)。saRNA為小的雙 鏈RNA，長度為21個核苷（nt)，并在3'末端含有2個核苷酸的脫氧核糖核酸（DNA)突出。 saRNA導(dǎo)入細(xì)胞后也需要AGO蛋白參與其作用，與AGO形成saRNA-AGO復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn) 入胞核后，結(jié)合到染色體上的靶位點，例如結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域，然后AGO蛋白募集其 他蛋白如RNA聚合酶II，組蛋白修飾因子等形成RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物（RNA-induced transcriptional activation, RITA)，最終觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄增加和表觀遺傳的活化。除 了從細(xì)胞外導(dǎo)入，saRNA也存在于細(xì)胞內(nèi)。典型的例子是長度為20-26個核苷酸的微小 RNA(miRNA)。miRNA由基因組轉(zhuǎn)錄生成長度為80多到幾千個核苷酸的原miRNA(primary miRNA)。在經(jīng)過Drosha/DGCR8復(fù)合物處理后，原miRNA成為長度為80核苷酸左右的miRNA 前體（precursor miRNA)。前體miRNA經(jīng)過Exportin5轉(zhuǎn)運到胞衆(zhòng)，經(jīng)過一種被稱為Dicer 的酶處理，而生成成熟的miRNA。這些miRNA也可以通過RNA激活機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控。 由于RNA激活能夠有目的地激活基因表達(dá)，因此RNA激活可以被用作一種分子工具來研究 基因功能，治療各種疾病如癌癥，及對細(xì)胞進(jìn)行重新編程。
[0003] 在申請?zhí)枮閁S 60/671，666、授權(quán)專利號為8, 877, 721的美國專利申請，以及申請 號為PCT/US2006/013559的專利申請中公開了一種將至少一種saRNA分子導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)來 激活目的基因表達(dá)的方法。該saRNA分子包含一條和基因的非編碼區(qū)互補(bǔ)的核糖核苷酸分 子。saRNA結(jié)合的區(qū)域被選擇用來激活基因的表達(dá)。在核糖核苷酸的3'端通常有兩個突出 堿基，且不和目的基因的非編碼區(qū)互補(bǔ)，比如兩個脫氧核糖核苷酸dTdT。核苷酸分子的互補(bǔ) 區(qū)域大于14個堿基，少于21個堿基。saRNA分子是一種雙鏈分子，它的第二條鏈和第一條 鏈互補(bǔ)形成雙鏈，在兩條鏈的3'端至少有2個突出堿基。saRNA分子也可以以單鏈分子的 形式存在，這種單鏈分子可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這種單鏈核酸分子的第一部分區(qū)域由核糖核 苷酸組成，并和目的基因的非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，第二部分區(qū)域和第一部分區(qū)域互補(bǔ)，形成雙 鏈結(jié)構(gòu)。在這種單鏈核酸分子的3'端至少有兩個突出堿基。但是，根據(jù)上述專利申請設(shè)計 的saRNA分子存在以下問題：1)設(shè)計效率不高，按照上述saRNA設(shè)計規(guī)則設(shè)計saRNA的成 功率僅為10%~20%;2)按照上述^1^4設(shè)計規(guī)則設(shè)計的^1^4對靶基因激活效果低下。
[0004] 盡管RNA激活具有巨大的潛在用途，但目前對于很多基因的RNA激活存在效率低 下的問題。一方面可能是因為saRNA需要進(jìn)入胞核發(fā)揮作用；另一方面，也可能是現(xiàn)有技術(shù) 設(shè)計的saRNA與內(nèi)源性自然發(fā)生的saRNA的序列組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面仍然有較大差別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對目前saRNA在設(shè)計和應(yīng)用中存在的saRNA設(shè)計成功率低以及RNA激活效 率低下的問題，本申請?zhí)峁┝艘环NdsaRNA的設(shè)計方法，以提高RNA激活的效率，擴(kuò)展RNA 激活的用途。根據(jù)本發(fā)明的saRNA實質(zhì)上為作為Dicer底物的saRNA (dicer substrate saRNA, dsaRNA)，為了與現(xiàn)有技術(shù)的saRNA相區(qū)分，本發(fā)明的發(fā)明人將其命名為Dicer底物 saRNA，如無特別指明，在本發(fā)明中作為Dicer底物的saRNA以dsaRNA表示 。
[0006] -種小激活RNA，其由包含25~30個核苷酸的正義序列和包含25~30個核苷酸 的反義序列組成，所述反義序列中至少有80%的序列與所述正義序列互補(bǔ)；所述正義序列 或反義序列包含具有19~25個核苷酸的匹配片段，所述匹配片段中至少有80%的序列與 靶基因調(diào)控序列的靶位點匹配。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明所述的靶基因調(diào)控序列是指位于細(xì)胞核 內(nèi)的DNA上，對于基因轉(zhuǎn)錄啟動或者延伸起增強(qiáng)作用，或者能通過表觀遺傳機(jī)制對基因轉(zhuǎn) 錄起正性調(diào)控作用的DNA序列。
[0007] 優(yōu)選地，所述正義序列和/或反義序列還含有1-5個脫氧核糖核苷酸；優(yōu)選地，所 述正義序列和/或反義序列中位于3'末端的2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸。發(fā)明人在研 究中發(fā)現(xiàn)在正義序列和/或反義序列中加入脫氧核糖核苷酸可以增加dsaRNA對細(xì)胞內(nèi)RNA 酶降解的抵抗，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。
[0008] 優(yōu)選地，所述靶基因調(diào)控序列片段是靶基因啟動子序列片段；優(yōu)選地，所述靶基因 啟動子序列片段選自自靶基因轉(zhuǎn)錄起始點起上游前5000個堿基到自靶基因轉(zhuǎn)錄起始點起 上游前一個堿基形成的啟動子區(qū)域。
【申請人】在研究中發(fā)現(xiàn)由于該區(qū)域含有基因轉(zhuǎn)錄所需的 特定序列，包括RNA聚合酶或者轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，從而使針對該區(qū)域設(shè)計的dsaRNA具有 更高的激活效率。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述dsaRNA的靶基因為人基因p21 ;優(yōu)選地，所述 靶基因的靶位點序列選自 SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:67、SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:69。
[0010] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述dsaRNA的正義序列和反義序列選自以下 組合之一：
[0011] 正義序列為3￡〇10勵:2，反義序列為3￡〇10勵:3;
[0012] 正義序列為3￡〇10勵:4，反義序列為3￡〇10勵:5;
[0013] 正義序列為3￡〇10勵:6，反義序列為3￡〇10勵:7;
[0014] 正義序列為3￡〇10勵:8，反義序列為3￡〇10勵:9;
[0015] 正義序列為SEQ ID N0:10,反義序列為SEQ ID N0:11 ;
[0016] 正義序列為SEQ ID NO: 12,反義序列為SEQ ID NO: 13。
[0017] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述靶基因為人胰-十二指腸同源盒基因 PDX1 ;優(yōu)選地，針對所述人胰-十二指腸同源盒基因roXl的dsaRNA的正義序列和反義序列 選自以下組合之一：
[0018] 正義序列為SEQ ID N0:54,反義序列為SEQ ID N0:55 ;
[0019] 正義序列為SEQ ID NO: 56,反義序列為SEQ ID NO: 57 ;
[0020] 正義序列為SEQ ID NO: 58,反義序列為SEQ ID NO: 59 ;
[0021] 正義序列為SEQ ID NO: 60,反義序列為SEQ ID NO: 61 ;
[0022] 正義序列為SEQ ID NO: 62,反義序列為SEQ ID NO: 63。
[0023] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述靶基因為人的基因NKX3. 1 ;優(yōu)選地，針對 所述基因NKX3. 1的小激活RNA的正義序列和反義序列選自以下組合之一：
[0024] 正義序列為SEQ ID N0:70,反義序列為SEQ ID N0:71 ;
[0025] 正義序列為SEQ ID NO: 72,反義序列為SEQ ID NO: 73 ;
[0026] 正義序列為SEQ ID NO: 74,反義序列為SEQ ID NO: 75 ;
[0027] 正義序列為SEQ ID NO: 76,反義序列為SEQ ID NO: 77 ;
[0028] 正義序列為SEQ ID NO: 78,反義序列為SEQ ID NO: 79。
[0029] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述的小激活RNA的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0030] 1)由靶基因的啟動子序列片段選取長度為19~25nt的序列作為靶位點；
[0031] 2)合成與步驟1)所述的靶位點對應(yīng)的核苷酸序列作為基礎(chǔ)序列，在所述基礎(chǔ)序 列的兩側(cè)添加核苷酸至長度為25~30nt，得到正義序列；
[0032] 3)合成長度為25~30nt的反義序列，并使所述反義序列中至少有80 %的序列與 步驟2)得到的正義序列互補(bǔ)；
[0033] 4)將步驟2)得到的正義序列與步驟3)得到的反義序列以相同的摩爾數(shù)在RNA退 火緩沖液中混合，加熱至97°C，然后自然冷卻至室溫，即得到雙鏈的小激活RNA。
[0034] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟2)中，合成所述正義序列和/或反義序 列時加入1~5個脫氧核糖核苷酸；優(yōu)選地，所述正義序列和/或反義序列中位于3'末端 的2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸。
[0035] 另一方面，根據(jù)本發(fā)明的小激活RNA可應(yīng)用于制備增加靶基因表達(dá)的藥物，優(yōu)選 為應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
[0036] 再一方面，本發(fā)明還提供一種增加靶基因表達(dá)的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明 的作為Dicer底物的小激活RNA引入受試者的細(xì)胞。
[0037] 又一方面，本發(fā)明還提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的方法，該方法包括將根據(jù)本 發(fā)明的作為Dicer底物的小激活RNA引入具有患有腫瘤風(fēng)險和/或患有腫瘤的受試者的細(xì) 胞；優(yōu)選地，所述腫瘤選自膀胱癌、前列腺癌及肝癌。
[0038] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性的雙鏈小RNA，它們是從更長的 單鏈RNA經(jīng)過多步處理而生成的。這些處理過程需要多個RNA酶的參與。最后一步處理是 包含27-70個核苷酸左右的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA被一種稱為Dicer酶的蛋白處理生成成熟 的、包含21~22個核苷酸的雙鏈小RNA。因此，本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)通過設(shè)計并合成比 現(xiàn)有技術(shù)中的21個核苷酸的saRNA更長的dsaRNA，當(dāng)dsaRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，
【申請人】發(fā)現(xiàn)它們 會被Dicer酶處理，生成了更自然saRNA，因而可以更有效地模仿內(nèi)源性雙鏈小RNA的自然 成熟過程，并有效地提高了 RNA激活的效率。
【附圖說明】
[0039] 圖la~b是根據(jù)本發(fā)明制備的dsaP21在p21基因啟動子上的位置以及序列信息。 其中，圖la顯示dsaP21在人p21啟動子區(qū)域的分布。圖lb顯示設(shè)計的dsaP21核酸雙鏈 序列信息（黑色加粗的堿基表示脫氧核糖核苷酸）。
[0040] 圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明制備的dsaRNA激活p2ImRNA表達(dá)效果的條形圖。
[0041 ] 圖3是顯示根據(jù)本發(fā)明制備的dsaRNA激活p2ImRNA表達(dá)效果的條形圖。
[0042] 圖4是將根據(jù)本發(fā)明制備的dsaP21應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果的條形圖，表 明dsaRNA能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。
[0043] 圖5是將本發(fā)明制備的dsaP21轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后抑制腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞形態(tài) 圖，表明dsaRNA能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
[0044] 圖6是顯示本發(fā)明制備的長度為23個核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表達(dá)效果 的條形圖。
[0045] 圖7是顯示本發(fā)明制備的長度為35個核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表達(dá)效果 的條形圖。
[0046] 圖8是顯示本發(fā)明制備的dsaPDXl激活非腫瘤相關(guān)基因roXlmRNA表達(dá)效果的條 形圖。
[0047] 圖9是顯示本發(fā)明制備的dsaNKX3. 1激活前列腺癌細(xì)胞PC_3mRNA表達(dá)的效果條 形圖。
[0048] 圖10是將本發(fā)明制備的dsaNKX3. 1轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后抑制腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞形 態(tài)圖，表明dsaRNA能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
【具體實施方式】
[0049] 為了更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例進(jìn)一 步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的具體實施例僅是用于說明目的，而非對本發(fā)明的限制。
[0050] 實施例1
[0051] 材料和方法
[0052] 1. Dicer 底物 saRNA (dsaRNA)的設(shè)計：
[0053] 本發(fā)明的dsaRNA的靶位點的選擇基于以下的原則：1.選取的靶序列為基因的正 義序列；2.指導(dǎo)RNA鏈（guide RNA strand)的5'端和祀序列的3'端結(jié)合；3.革E序列的 GC含量為40-65%;4.避免靶序列包含有4個及以上連續(xù)重復(fù)的堿基序列；5.靶序列的3' 比5'端的熱動力學(xué)穩(wěn)定性低。6.選取的靶位點應(yīng)該避免CpG島以及高GC的區(qū)域。
[0054] 在基因啟動子區(qū)域，設(shè)計的靶位點的序列長度為19個到25個堿基。選取的基因 啟動子區(qū)域為轉(zhuǎn)錄起始位點上游5000個堿基到基因轉(zhuǎn)錄起始位點前一個堿基。
[0055] 以p21基因為例，從ENSEMBL基因組數(shù)據(jù)庫下載人P21(CDKN1A)啟動子序列片段 (SEQ ID N0:1)，從-1000位點到轉(zhuǎn)錄起始位點共1000堿基對（bp)。以該序列片段為模板， 設(shè)計6個saRNA靶位點（如圖la所示），每個靶位點的序列長度為25個堿基，具體命名如 下：
[0056] dsaP21-l 靶序列：SEQ ID N0:645' -GCTCCAGGTGCTTCTGGGAGAGGTG-3'
[0057] dsaP21-2 靶序列：SEQ ID N0:655' -GTATTAATGTCATCCTCCTGATCTT-3'
[0058] dsaP21-3 靶序列：SEQ ID N0:665' -CCTGGAGAGTGCCAACTCATTCTCC-3'
[0059] dsaP21-4 靶序列：SEQ ID N0:675' -GGATCAGTGGGAATAGAGGTGATAT-3'
[0060] dsaP21-5 靶序列：SEQ ID N0:685' -CCAGATTTGTGGCTCACTTCGTGGG-3'
[0061] dsaP21-6 靶序列：SEQ ID N0:695' -TGCCAACTCATTCTCCAAGTAAAAA-3'。
[0062] 根據(jù)上述靶位點合成dsaRNA正義序列和反義序列，正義序列前23個為核糖 核苷酸，最后兩個為脫氧核糖核苷酸，反義序列長度為27個核苷酸，全部為核糖核苷 酸。靶位點的位置以及合成的dsaRNA正義序列和反義序列如圖la-圖lb所示。設(shè)計 的 6 條 dsaRNA 具體如下：dsaP21-l (正義序列：SEQ ID N0:2GCUCCAGGUG CUUCUGGGAG AGGtg ;反義序列：SEQ ID NO: 3CACGAGGUCC ACGAAGACCC UCUCCAC)，dsaP21-2 (正義序 列：SEQ ID N0:4GUAUUAAUGU CAUCCUCCUG AUCtt ;反義序列：SEQ ID N0:5UACAUAAUUA 反義序列：SEQ ID N0:7GAGGACCUCUCACGGUUGAG UAAGAGG)，dsaP21-4(正義序列：SEQ ID N0:8GGAUCAGUGG GAAUAGAGGU GAUat;反義序列：SEQ ID N0:9UCCCUAGUCA CCCUUAUCUC CACUAUA)，dsaP21-5(正義序列：SEQ ID N0:10CCAGAUUUGU GGCUCACUUCGUGgg;反義 序列：SEQ ID N0:11UCGGUCUAAA CACCGAGUGA AGCACCC)，dsaP21-6(正義序列：SEQ ID N0:12UGCCAACUCA UUCUCCAAGUAAAaa;反義序列：SEQ ID N0:13UCACGGUUGA GUAAGAGGUU CAUUUUU);dsaControl:(正義序列：SEQ ID N0:14AGTCACUACU GAGUGACAGUAGAat;反義序 列：SEQ ID N0:15AUUCUACUGU CACUCAGUAG UGACUGC)。
[0063] 2.根據(jù)本發(fā)明的dsaRNA與常規(guī)設(shè)計的saRNA的RNA激活效率的比較
[0064] 本申請的發(fā)明人同時設(shè)計了 6個與上述dsaRNA相對應(yīng)的長度為21個核苷酸的標(biāo) 準(zhǔn)saRNA，其中正義序列和反義序列的末端兩位均為脫氧核糖核苷酸，具體序列為：
[0065] saP21-l (正義序列：SEQ ID NO: 16GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAdTdT ; 反義序列：SEQ ID NO: 17UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCdTdT)。saP2卜2 (正 義序列：SEQ ID NO : 18GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGAdTdT ；反義序 列：SEQ ID N0:19UCAGGAGGAUGACAUUAAUACdTdT)〇saP21-3(正 義序列：SEQ ID NO : 20CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUdTdT ；反義序 列：SEQ ID N0:21AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGdTdT)〇saP21-4(正 義序列：SEQ ID N0:22GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGdTdT;反義序列： SEQ ID NO:23CACCUCUAUUCCCACUGAUCCdTdT)〇 saP21_5(正義序 列：SEQ ID N0:24CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGdTdT;反義序列：SEQ ID NO:25CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGdTdT) 〇 saP2 1-6 (正義序列：SEQ ID NO: 26UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAdTdT ;反義序列：SEQ ID NO: 27UACUUGGAGAAUGAGUUGGCAdT dT) 〇
[0066] 3. dsaRNA 及 saRNA 合成：
[0067] 分別化學(xué)合成上述dsaRNA的單鏈，進(jìn)行去鹽純化，然后分別將相同摩爾數(shù)的含有 互補(bǔ)區(qū)域的兩條單鏈（即正義序列和反義序列）加入同一 RNA退火緩沖液中，加熱到97°C， 然后使溶液自然冷卻到室溫，即得到雙鏈的dsaRNA。
[0068] 4?細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：
[0069] 取指數(shù)生長期人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3,用胰酶消化，然后懸浮在含有10%胎牛血 清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)，以4x 105細(xì)胞/孔的密度種入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，其中培養(yǎng)基為 2ml。取 6. 25 y 1 濃度為 20 y M 的 dsaRNA,與 243. 5 y 1 Opti-MEM 培養(yǎng)基（購自 Lifetech 公司）混合，同時，用 245yl Opti-MEM稀釋 5yl Lipofectamine RNAiMax(購自 Lifetech 公司），將稀釋后的dsaRNA與RNAiMax混合，室溫放置20分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合液（500 y 1) 加入6孔板的細(xì)胞中。混合均勻后，將細(xì)胞放入C02培養(yǎng)箱，在37 °C的5 % C0 2濃度下培養(yǎng) 72-96小時。
[0070] 5.細(xì)胞總RNA提?。?br>[0071] 細(xì)胞總mRNA提取采用Qiagen公司RNeasy試劑盒進(jìn)行。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染72-96小時 后，移去培養(yǎng)基，加入lml PBS緩沖液清洗細(xì)胞，然后加入350 y 1 RTL緩沖液，收集細(xì)胞裂 解液，加入等量70 %乙醇，最后加入50 y 1 DEPC處理水，離心收集RNA。所得RNA溶液采用 Nanodrop儀測定其濃度。
[0072] 6. cDNA 合成：
[0073] 取 lyg RNA，加入DEPC處理水至 10yl，加入 lyl(0.5yg)01ig〇-dT 引物，70攝 氏度孵育10分鐘，轉(zhuǎn)移至冰上，然后加入2. 5 y 1 RT反應(yīng)緩沖液，1. 0 y 1 25mM dNTP，0. 5 y 1 RNA酶抑制劑，加水至25 y 1。反應(yīng)在45攝氏度進(jìn)行1小時，然后70攝氏度10分鐘。最后 用去RNA酶水將所得cDNA溶解稀釋至100 y 1。
[0074] 7. mRNA 表達(dá)分析：
[0075] mRNA 表達(dá)分析用 Power Sybrgreen qPCR 混合液（購自 Lifetech 公司）及 ABI 7500快速實時定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行。取1 y 1 cDNA產(chǎn)物，加入1 y 10. 67 yM引物，3 y 1水， 5yl Sybrgreen試劑。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。同時擴(kuò)增GAPDH基因作為內(nèi) 部對照。正義引物為：3￡0 10勵:285'-六!1^〇^1'(：11'〇^66六606六-3'，反義引物為：5￡0 10 N0:295' -TTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3'。
[0076] 8.細(xì)胞增殖分析：
[0077] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染在96孔板進(jìn)行。細(xì)胞增殖的檢測采用Promega公司提供的 CellTiter96 K AQuecius One Solution Cell Proliferation Assay 試劑盒完成。在細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后0-6天，每天進(jìn)行一次細(xì)胞增殖分析，共6個時間點。分析前在培養(yǎng)基中加入20 y 1 solution one試劑，然后在37攝氏度繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘，用酶標(biāo)儀在490nm波長測量吸 光值。
[0078] 9.細(xì)胞形態(tài)分析：
[0079] 將PC-3腫瘤細(xì)胞均勻接種在6孔板種，次日轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后72小時在相差顯 微鏡下觀察并拍照記錄。
[0080] 結(jié)果
[0081] 1. dsaRNA 觸發(fā) RNAa
[0082] 為了評價 dsaRNA 的 RNAa 活性，用 dsaRNA 轉(zhuǎn)染 PC-3 細(xì)胞，Mock 和 dsaControl 作 為對照，dsaControl的作為非特異性dsaRNA的對照，為一段不和細(xì)胞內(nèi)任何基因序列互補(bǔ) 的分子。。轉(zhuǎn)染后72小時收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，用cDNA為 模板，用人P21基因引物實時定量PCR擴(kuò)增p21mRNA，同時擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)部對照。如圖2 所示，在設(shè)計的 6 個 dsaRNA 中，其中 3 個（dsaP21-4、dsaP21-5、dsaP21-6)能激活 p21mRNA 表達(dá)達(dá)到3倍以上。
[0083] 為了比較dsaRNA與常規(guī)設(shè)計的saRNA的RNA激活功效，用saRNA轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞， Mock和dsaControl作為對照。轉(zhuǎn)染后72小時收集細(xì)胞，按上述方法分析p21mRNA表達(dá)。 如圖3所示，在設(shè)計的6個saRNA中，只有2個（saP21-4)能激活p21mRNA表達(dá)，激活倍數(shù) 為1. 5~2. 2倍。
[0084] 2. dsaRNA抑制腫瘤細(xì)胞增殖
[0085] p21基因是重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控基因，因此具有腫瘤抑制作用。為了評價 p21dsaRNA對腫瘤細(xì)胞生長的影響，用p21dsaRNA轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后72小時采用 Promega 公司 CellTiter :9.6:*AQ_US One Solution Cell Proliferation Assay 試劑盒分 析細(xì)胞活性。如圖4所示，dsaP21_4, dsaP21_5, dsaP21_6能夠顯著降低PC-3細(xì)胞的存活 率。而且這種效應(yīng)是隨著dsaRNA對p21基因的促進(jìn)表達(dá)的能力相關(guān)聯(lián)。
[0086] 3. dsaRNA抑制腫瘤細(xì)胞生長
[0087] 將PC-3細(xì)胞均勻地培養(yǎng)在6孔板中，將設(shè)計的靶向p21啟動子不同位點的dsaRNA 分別轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，設(shè)置空白Mock對照組和dsaControl對照組，72小時后采用相差顯微 鏡觀察細(xì)胞。如圖5所示，轉(zhuǎn)染了 dsaP21_4, dsaP21_5, dsaP21_6的實驗組PC-3生長速度 放緩，數(shù)目顯著比對照組數(shù)目少。轉(zhuǎn)染了 dsaP21_4的實驗組細(xì)胞數(shù)比轉(zhuǎn)染了 dsaP21_5的 實驗組細(xì)胞多，而比轉(zhuǎn)染了 dsaP21_6的實驗組細(xì)胞數(shù)目少。說明dsaP21的抑制細(xì)胞生長 的效應(yīng)與dsaP21促進(jìn)p21基因表達(dá)的能力緊密相關(guān)。dsaP21促進(jìn)p21基因表達(dá)的能力越 強(qiáng)，其抑制細(xì)胞生長的能力就越強(qiáng)。這些說明這種dsaP21是一種有效的抑制腫瘤細(xì)胞生長 的抑制劑。
[0088] 相比現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明證實了在Dicer酶的剪切的作用下，從活性saRNA得到的 Dicer酶的底物saRNA分子（dsaRNA)可以顯著提高靶基因的激活效率。現(xiàn)有的saRNA方法 的方法是模擬dicer酶的產(chǎn)物，從而繞過了其與Dicer酶的相互作用。本專利設(shè)計出來的 dsaRNAs能夠提高RNA激活的效能，使靶DNA分子可以更容易和dsaRNA作用，從而更容易， 更高效激活目的基因的表達(dá)。
[0089] 實施例2
[0090] (一）短于25個核苷酸的saRNA的激活效率
[0091] 針對p21基因啟動子6個位點設(shè)計23個核苷酸長度的dsRNA。分別 命名為：dsP21_la， dsP21_2a， dsP21_3a， dsP21_4a， dsP21_5a， dsP21_6a。 其序 列為：dsP21-la(正義序列：SEQ ID N0:30GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAGG，反義序 列為：SEQ ID N0:31UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCAC) ;dsP21-2a(正義序列：SEQ ID N0:32GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGATC，反義序列為：SEQ ID N0:33UCAGGAGGAUGACAUUAAUACAU); dsP21-3a(正義序列：SEQ ID N0:34CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCU，反義序列為： SEQ ID N0:35AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGAG);dsP21-4a(正義序列為：SEQ ID N0:36GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGAT，反義序列為：SEQ ID N0:37CACCUCUAUUCCCACUGAUCCCT); dsP21-5a(正義序列為：SEQ ID N0:38CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGTG，反義序列 為：SEQ ID N0:39CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCT);dsP21-6a(正義序列為：SEQ ID N0:40UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAA，反義序列為：SEQ ID N0:41UACUUGGAGAAUGAGUUGGCACT)， 其中正義序列的最后兩個堿基為脫氧核糖核苷酸。結(jié)果表明，如圖6所示，dsP21-3a， dsP21_5a，dsP21_6a雖然可以激活p21基因的表達(dá)，但其激活的效率明顯較低。
[0092] (二）長于30個核苷酸的激活效率的效果
[0093] 針對p21基因啟動子6個位點設(shè)計35個核苷酸長度的dsRNA，分別命名 為：dsP21-lb，dsP21-2b，dsP21-3b，dsP21-4b，dsP21-5b，dsP21-6b。其序列為： (^&?21-113(正義序列 ：5￡〇10勵:42?]〇^661^〇]〇^661^〇]1]〇^66464661^4(：，反義 序列為：SEQ ID N0:43CACCUCUCCCAGAAGCACCUGGAGCACCUAGACAC) ;dsaP21-2b(正義序 列為：SEQ ID N0:44AUUUUUAUGUAUUAAUGUCA UCCUCCUGAUCUUIT，反義序列為：SEQ ID NO: 45AAGAUCAGGAGGAUGACAUU AAUACAUAAAAAUTC) ;dsaP2l-3b (正義序列為：SEQ ID NO: 4 6UGUGUCCUCCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAA，反義序列為：SEQ ID NO: 47GGAGAAUGAGUUGGCA CUCUCCAGGAGGACACAGC) ;dsaP2l-4b (正義序列為：SEQ ID NO: 48CUAGUGAGGGAUCAGUGGGAA UAGAGGUGAUAUTG，反義序列為：SEQ ID N0:49AUAUCACCUCUAUUCCCACUGAUCCCUCACUAGGT); dsaP21-5b (正義序列為：SEQ ID N0:50AAAAAAAGCCAGAUUUGUGGCUCACUUCGUGGGGA，反義序列 為：SEQ ID N0:51CCCACGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCUUUUUUUAC) ;dsaP21-6b (正義序列為：SEQ ID N0:52CUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAAAAAA，反義序列為：SEQ ID N0:53UUUUUACUUG GAGAAUGAGUUGGCACUCUCCAGGA)，其中正義序列最后兩個為脫氧核糖核苷酸。
[0094] 結(jié)果表明，如圖7所示，dsP21-3b，dsP21-5b，dsP21-6b雖然可以激活p21基因的 表達(dá)，但其激活的效率明顯較低。
[0095] 實施例3
[0096] 根據(jù)本發(fā)明專利設(shè)計的dsaRNA具有高效激活胰-十二指腸同源盒基因（PDX1) 的表達(dá)。roxi基因是調(diào)節(jié)胰島功能的重要基因，同時roxi還可以促使非e細(xì)胞如肝細(xì) 胞中的胰島素基因表達(dá)，對治療糖尿病具有重要的應(yīng)用價值。我們在roxi基因啟動子區(qū) 域設(shè)計了針對不同位點的dsaRNA。如下所示的序列中以小寫黑體表示dsaRNA序列中的 脫氧核糖核苷酸。dsaPDXl-1 (正義序列為：SEQ ID N0:54CACACUAUGUCCAUUAUCAAAUA ta， 反義序列為：SEQ ID N0:55UAUAUUUGAUAAUGGACAUAGUGUGUU) ;dsaPDXl-2(正義序列為：SEQ ID N0:56CCGACAUCUUUGUGGCUGUGAACaa，反義序列為：SEQ ID N0:57UUGUUCACAGCCACAAAG AUGUCGGUU) ;dsaPDXl-3(正義序列為：SEQ ID N0:58GACCUAGAGAGCUGGGUCUGCAAac，反義 序列為：SEQ ID N0:59GUUUGCAGACCCAGCUCUCUAGGUCAG);dsaPDXl-4(正義序列為：SEQ ID NO: 60ACAACGAAUGCCAGAGUUUCGUGtg，反義序列為：SEQ ID NO: 61CACACGAAACUCUGGCAUUCG UUGUGU) ;dsaPDXl-5(正義序列為：SEQ ID N0:62GUACUUGCAGCACAUCCACAAGUaa，反義序列 為：SEQ ID N0:63UUACUUGUGGAUGUGCUGCAAGUACUU)，其中正義序列最后兩個堿基為脫氧核 糖核苷酸。將設(shè)計的dsaPDXl分別轉(zhuǎn)染IfepG2細(xì)胞，使用的dsaPDXIRNA濃度為50nM，轉(zhuǎn)染 96小時后收集細(xì)胞，提取總RNA，然后檢測H)X1基因的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，dsaPDXl-1， dsaPDXl-3, dsaPDXl-4可以高效的激活I(lǐng)fepG2細(xì)胞中H)X1基因的表達(dá)（圖8)。
[0097] 實施例4
[0098] 根據(jù)本發(fā)明專利設(shè)計的dsaRNA具有高效激活NKX3. 1基因的表達(dá)。NKX3. 1是 前列腺特異性和雄激素調(diào)芐基因。在人前列腺組織高度表達(dá)，是一種前列腺特異性腫瘤 抑制因子，對前列腺癌的治療具有重要的作用。本發(fā)明在NKX3.1啟動子設(shè)計了針對不 同位點的dsaRNA。如下所示的序列中以小寫黑體表示dsaRNA序列中的脫氧核糖核苷 酸。其中 dsaNKX-1 (正義序列為：SEQ ID NO: 70GAGGAGAGCUGGAGAAGGAGAGGaa，反義序 列為：SEQ ID N0:71UUCCUCUCCUUCUCCAGCUCUCCUCCC) ;dsaPDXl-2(正義序列為：SEQ ID N0:72AGAGCUAACUGGACUGUUU⑶CUtg，反義序列為：SEQ ID N0:73CAAGACAAACAGUCCAGUUA GCUCUUC) ;dsaPDXl-3(正義序列為：SEQ ID N0:74CUGUAAUUGGCUCUGACGGUCCUga，反義序 列為：SEQ ID N0:75UCAGGACC⑶CAGAGCCAAUUACAGGG) ;dsaPDXl-4(正義序列為：SEQ ID NO: 76AGAGCACCCAGAACUCUCACGGUac，反義序列為：SEQ ID NO: 77GUACCGUGAGAGUUCUGGGUGCU CUCU) ;dsaPDXl-5(正義序列為：SEQ ID N0:78AGAUAUUGCAGAUCUGAGUUUGCac，反義序列為： SEQ ID NO: 79GUGCAAACUCAGAUCUGCAAUAUCUAC)，其中正義序列最后兩個堿基為脫氧核糖核 苷酸。將設(shè)計的dsaNKX分別轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，使用的dsaNKX RNA濃度為50nM，轉(zhuǎn)染 96小時后收集細(xì)胞，提取總RNA，然后檢測NKX3. 1基因的表達(dá)。實驗結(jié)果表明，dsaNKX-1， dsaNKX-2, dsaNKX-3, dsaNKX-4, dsaNKX-5都可以高效的激活PC-3細(xì)胞中NKX3. 1基因的表 達(dá)，其中dsaNKX-1和dsaNKX-5激活的效果更明顯（圖9)，其能有效抑制PC-3細(xì)胞的增值 (圖 10)。
[0099] 盡管已經(jīng)對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行了詳細(xì)說明和描述，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，本發(fā) 明不受所述【具體實施方式】的限制。在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做 出各種改進(jìn)、修飾和變化，而這些改進(jìn)、修飾和變化均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種小激活RNA，其特征在于，所述的小激活RNA由包含25~30個核苷酸的正義序 列和包含25~30核苷酸的反義序列組成，所述反義序列中至少有80%的序列與所述正義 序列形成互補(bǔ)；所述正義序列或反義序列中包含具有19~25個核苷酸的靶基因調(diào)控序列 匹配片段，所述匹配片段至少有80%的序列與靶基因調(diào)控序列的靶位點匹配。2. 如權(quán)利要求1所述的小激活RNA，其特征在于，所述正義序列和/或反義序列中還含 有1-5個脫氧核糖核苷酸；優(yōu)選地，所述正義序列和/或反義序列中位于3'末端的2個核 苷酸為脫氧核糖核苷酸。3. 如權(quán)利要求1或2所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因調(diào)控序列片段是靶基 因啟動子序列片段；優(yōu)選地，所述靶基因啟動子序列片段為靶基因轉(zhuǎn)錄起始點上游5000個 堿基到革E基因轉(zhuǎn)錄起始點前一個堿基形成的啟動子區(qū)域。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因為人基因 P21;優(yōu)選地，所述靶基因調(diào)控序列的靶位點序列選自SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:69 中的一個。5. 如權(quán)利要求4所述的小激活RNA，其特征在于，所述小激活RNA的正義序列和反義序 列選自以下組合之一： 正義序列為SEQ ID NO: 2,反義序列為SEQ ID NO: 3; 正義序列為SEQ ID NO: 4,反義序列為SEQ ID NO: 5; 正義序列為SEQ ID NO: 6,反義序列為SEQ ID NO: 7; 正義序列為SEQ ID NO: 8,反義序列為SEQ ID NO: 9; 正義序列為SEQ ID NO: 10,反義序列為SEQ ID NO: 11 ;或者， 正義序列為SEQ ID NO: 12,反義序列為SEQ ID NO: 13。6. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因為人胰-十二 指腸同源盒基因 roxi;優(yōu)選地，針對所述人胰-十二指腸同源盒基因 roxi的小激活RNA的 正義序列和反義序列選自以下組合之一： 正義序列為SEQ ID NO: 54,反義序列為SEQ ID NO: 55; 正義序列為SEQ ID NO: 56,反義序列為SEQ ID NO: 57; 正義序列為SEQ ID NO: 58,反義序列為SEQ ID NO: 59; 正義序列為SEQ ID NO: 60,反義序列為SEQ ID NO:61 ; 正義序列為SEQ ID NO: 62,反義序列為SEQ ID NO: 63。7. 如權(quán)利要求1-3中任一項所述的小激活RNA，其特征在于，所述靶基因為人的基因 NKX3. 1 ;優(yōu)選地，針對所述基因 NKX3. 1的小激活RNA的正義序列和反義序列選自以下組合 之一： 正義序列為SEQ ID NO: 70,反義序列為SEQ ID NO: 71 ; 正義序列為SEQ ID NO: 72,反義序列為SEQ ID NO: 73; 正義序列為SEQ ID NO: 74,反義序列為SEQ ID NO: 75; 正義序列為SEQ ID NO: 76,反義序列為SEQ ID NO: 77; 正義序列為SEQ ID NO: 78,反義序列為SEQ ID NO: 79。8. 如權(quán)利要求1-7中任一項所述的小激活RNA的制備方法，其特征在于，所述方法包括 以下步驟： 1) 在靶基因的啟動子序列片段選取包含19~25個堿基的序列作為靶位點； 2) 合成與步驟1)所述的靶位點對應(yīng)的RNA序列作為基礎(chǔ)序列，在所述基礎(chǔ)序列的一側(cè) 或兩側(cè)添加核苷酸至長度為25~30個核苷酸，得到正義序列； 3) 合成長度為25~30nt的反義序列，并使所述反義序列至少有80%的序列與步驟2) 得到的正義序列互補(bǔ)； 4) 將步驟2)得到的正義序列與步驟3)得到的反義序列以相同的摩爾數(shù)在RNA退火緩 沖液中混合，加熱至97°C，然后自然冷卻至室溫，即得到雙鏈的小激活RNA。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，合成所述正義序列和/或反義 序列時加入至少一個脫氧核糖核苷酸，優(yōu)選地，合成所述正義序列和/或反義序列時3'末 端兩個核苷酸為脫氧核糖核苷酸。10. 如權(quán)利要求1~6所述的小激活RNA在制備增加靶基因表達(dá)的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選 為在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述腫瘤選自膀胱癌、前列腺癌、及肝癌。
【文檔編號】A61P35/00GK106032532SQ201510115335
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發(fā)明人】李龍承, 龍波, 郭丹
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院