豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用及該豌豆活性肽的制備方法，該肽粉由分子量小于1000Da的肽組成，肽粉來自于豌豆蛋白水解產(chǎn)物；制備方法如下：(1)利用堿性蛋白酶對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)后將所得到的豌豆蛋白水解物進(jìn)行冷凍干燥；(2)利用超濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到活性最強(qiáng)的組分；(3)收集活性最高的組分，凍干成粉末即所得豌豆肽粉。(4)將干燥得到的粉末溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液，用于測定豌豆肽對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用。該豌豆活性肽在對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能達(dá)到61.92％。
【專利說明】
豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及豌豆活性肽的應(yīng)用，尤其是一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng) 用及其制備方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 肝癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別位居第5和第2位，全球每年大約有70萬人 死于肝癌，是嚴(yán)重威脅世界人民健康的惡性腫瘤之一。近年來治療肝癌的主要手段是以手 術(shù)切除為基礎(chǔ)、并輔助化療、熱療等綜合治療。盡管隨著外科治療技術(shù)的提高，其發(fā)病率和 死亡率都呈下降趨勢(shì)。然而由于大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者的病情隱匿、潛伏期長、腫瘤生長迅 速導(dǎo)致早期診斷困難，而且治療后的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為了肝癌患者死亡的主要原因。因 此，開發(fā)出一種適合癌癥病人日常食用及手術(shù)等治療后用于保健的功能性食品能在一定程 度上緩解癌癥病情。
[0003] 豌豆是一種優(yōu)良的植物蛋白資源，豌豆蛋白占干豌豆質(zhì)量的23%~25 %，豌豆蛋 白是一種較好的必需氨基酸源，其組成比較平衡，與FA0/WH0推薦模式較為接近。然而，由于 蛋白的可消化性差，因此豌豆蛋白的營養(yǎng)價(jià)值不能充分發(fā)揮。目前我國的豌豆蛋白一般被 用作飼料，沒有很好地利用豌豆蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，造成了資源的浪費(fèi)。據(jù)研究表明，目前全 球所面臨的問題是隨著蛋白質(zhì)需求量的增加，許多優(yōu)質(zhì)的蛋白資源卻不能被有效利用，因 此將這部分作為副產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源加工為高附加值產(chǎn)品的方法就有待改善，經(jīng)過 水解分離精制得到的多肽，具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高吸濕保濕性、抗凝膠性等特點(diǎn)，尤其 是小分子肽，人體吸收速度快，利用率高，同時(shí)具有多種生物活性，是一種能夠利用植物蛋 白資源的手段。
[0004] 現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。據(jù)報(bào) 導(dǎo)，肽的吸收機(jī)制優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸。當(dāng)前關(guān)于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌 和降血壓等發(fā)面。關(guān)于抗腫瘤多肽的研究，主要來源是海洋生物類，本專利開發(fā)了一種來源 于豆類植物蛋白的抗腫瘤多肽，成本更低，為抗腫瘤多肽的原料來源提供了更優(yōu)的資源。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備抑制肝癌細(xì)胞生長的活性多肽的方法，優(yōu)選出堿性 蛋白酶酶解豌豆蛋白的方案，得到抗腫瘤肽粗品。經(jīng)過中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾 裝置分級(jí)分離純化，得到純度較多的抗腫瘤肽。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的實(shí)施方式如下：
[0007] -種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用。
[0008] -種豌豆活性肽在抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用。
[0009] -種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。
[0010] -種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。
[0011] -種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。
[0012] 而且，所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。
[0013]而且，所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0014] ⑴用去離子水配制4%-6%(g/100ml)豌豆蛋白溶液，70°c-90°c下熱處理豌豆蛋 白10min-30min，調(diào)節(jié)pH值為7.5-9.0，加入堿性蛋白酶，在45 °C -60 °C水浴中反應(yīng)4h-6h后， 90°C_100°C 沸水浴滅酶 10min-15min;
[0015] ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0016] ⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0017]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0018]而且，所述的分級(jí)分離是采用中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾裝置聯(lián)合使用。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0020] 1、本發(fā)明采用堿性蛋白酶水解豌豆蛋白的方法制備出一種能抑制HepG2細(xì)胞生長 的活性肽，通過超濾膜得到純度較高的活性肽組分。該豌豆活性肽在對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能 達(dá)到61.92 %。
[0021] 2、本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，應(yīng)用范圍廣泛;對(duì)今后開發(fā)利用含有豌豆多肽的保 健品的生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。
[0022] 3、本發(fā)明為患癌病人開發(fā)一種安全性高的保健品，同時(shí)為研究和開發(fā)多肽的新功 效提供數(shù)據(jù)，有助于滿足人們?nèi)找嫣岣叩纳钏揭蟆?br>【附圖說明】：
[0023] 圖1是豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU對(duì)癌細(xì)胞生長抑制作用比較圖；
[0024] 圖2是倒置顯微鏡下觀察的豌豆多肽對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響；
[0025] 圖3是各級(jí)超濾組分對(duì)癌細(xì)胞生長抑制作用比較圖；
[0026]圖4為本發(fā)明方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 一種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。
[0029] 所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0030] (1)蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.5， 在55°C水浴鍋中反應(yīng)5h后，90°C沸水浴滅酶IOmin，測定水解度為18.18% ;
[0031] (2)將水解后得到的豌豆蛋白水解液進(jìn)行冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液用于測定對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用；
[0032] (3)將用堿性蛋白酶酶解得到的豌豆蛋白酶解液通過中空纖維膜超濾裝置和攪拌 式超濾裝置分離成分子量（>60KDa，6KDa-60KDa，lKDa-6KDa，〈IKDa)的各個(gè)組分，操作步驟 如下：
[0033] a.安裝超濾裝置
[0034] b.清洗超濾膜
[0035] c.將豌豆蛋白酶解液用蒸餾水稀釋至固形物含量為2%后，用蠕動(dòng)栗輸送進(jìn)中空 纖維中，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)栗的轉(zhuǎn)速和出液口的流速，使裝置的壓力維持在一個(gè)安全范圍內(nèi)，待進(jìn)豌 豆蛋白酶解液全部進(jìn)入中空纖維后，將濃液口的截留液進(jìn)行稀釋重新超濾，重復(fù)多次，直至 濃液口截留液的固形物含量基本保持不變，在此期間收集截留液和濾過液，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀濃縮后凍干成肽粉用于檢測對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用。
[0036] (4)將所得大活性最強(qiáng)的超濾組分收集，凍干成粉末，即所得豌豆肽粉；
[0037] (5)用MTT法檢測豌豆蛋白酶解液對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用
[0038] 將豌豆肽粉以一定濃度加到細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，用于檢測豌豆肽對(duì)癌細(xì)胞體外生 長的抑制作用，操作步驟如下：
[0039] a.將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 104個(gè)/mL，以每孔IOOmL接種到96孔板中，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0040] b.向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞中每孔加200uL相應(yīng)的豌豆肽細(xì)胞培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加200uL完 全培養(yǎng)液，以含相同濃度豌豆蛋白粉的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照和含相同濃度5-FU的培養(yǎng)液為陽 性對(duì)照，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
[00411 c.吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20uL和細(xì)胞培養(yǎng)液180uL，37攝氏度再 培養(yǎng)4小時(shí)后，小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入150uLDMS0，震蕩15分鐘，使紫色潔凈物充分 溶解；
[0042] d.用酶標(biāo)儀在570nm處測定每孔的吸光度值(A值），以空白孔調(diào)零，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0043] f.按照以下公式計(jì)算對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率:抑制率
[0044] 圖1為豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU對(duì)癌細(xì)胞生長抑制作用比較圖，從圖中可以 看出豌豆蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞影響較小，但經(jīng)蛋白酶作用后生成的酶解產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞生 長的抑制率大大提高，在濃度為lmg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率相當(dāng)于5-氟尿嘧啶的 68.13%〇
[0045] 圖2為倒置顯微鏡下觀察豌豆蛋白酶解液對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)的影響 [0046] a: 100%DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)；
[0047] b:含lmg/mL豌豆蛋白酶解液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)；
[0048] c:含lmg/mL5-FU的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)。
[0049] 從圖中可以看出，用100 %DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞呈紡錘狀，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞貼壁 較好;經(jīng)藥物作用后大多數(shù)細(xì)胞變圓，皺縮，邊界不清，即死細(xì)胞較多。
[0050] 圖3為各級(jí)超濾組分(濃度為lmg/mL)對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制作用，從圖中可以看出 分子量在IKDa以下的肽段對(duì)HepG2細(xì)胞生長的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)分離后，活性組分純度較 高，相比分離前，分子量在IKDa以下的肽粉活性增強(qiáng)。對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能達(dá)到61.92%。 [0051 ] 實(shí)施例2
[0052] 一種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。
[0053]所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0054] ⑴蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取Sg豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.5， 在55°C水浴鍋中反應(yīng)4h后，90°C沸水浴滅酶15min，測定水解度為16.39% ;
[0055] ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0056] ⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0057]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0058] 實(shí)施例3
[0059] 一種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。
[0060]所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[00611 ⑴蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.0， 在50°C水浴鍋中反應(yīng)4h后，90°C沸水浴滅酶15min，測定水解度為17.10% ;
[0062]⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0063]⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0064]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0065]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用。2. -種豌豆活性肽在抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用。3. -種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。4. 一種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。5. -種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下： ⑴用去離子水配制4%-6%，g/100ml豌豆蛋白溶液，70-90°C下熱處理豌豆蛋白10-30min，調(diào)節(jié)pH值為7.5-9.0，加入堿性蛋白酶，在45-60 °C水浴中反應(yīng)4-6h后，90-100 °C沸水 浴滅酶l〇_15min; ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，制 備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液； (3)利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 lOOOKDa的超濾組分； ⑷將分子量小于l〇〇〇KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長中的應(yīng)用，其特征在于:所述的 分級(jí)分離是采用中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾裝置聯(lián)合使用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106075384SQ201610445484
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】王艷萍, 潘芬
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)