一種植酸酶突變體及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植酸酶突變體及其制備方法和應用，植酸酶突變體的序列SEQ ID No：1，該突變體由編碼無花果曲霉植酸酶氨基酸序列發(fā)生改變而獲得；本發(fā)明使用煙曲霉植酸酶的部分氨基酸序列來替代無花果曲霉植酸酶氨基酸序列，使其成為耐熱性高的植酸酶；以無花果曲霉植酸酶基因序列作為模版，通過基因點突變技術(shù)使無花果植酸酶基因發(fā)生突變，獲得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID NO：2，該植酸酶基因的突變體與質(zhì)粒PPIC9K等相連構(gòu)建重復質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主GS115等獲得基因工程菌株，通過基因工程菌株發(fā)酵，獲得新的植酸酶突變體；能有較寬的pH作用范圍和較理想耐熱特性，適合耐高溫制粒，較好地滿足飼料工業(yè)的要求。
【專利說明】
-種植酸酶突變體及其制備方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種植酸酶突變體及其制備方法和應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植酸廣泛存在于玉米、米慷、各種餅巧等飼料原料中，一方面它具有很強的抗營養(yǎng) 作用，與飼料中金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合，影響運些營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收;另一方面植酸分 子含有大量有機憐，動物胃腸道由于缺少相應的酶，因而不能利用，運些有機憐隨糞便排放 到環(huán)境中，造成環(huán)境污染。植酸酶可使植酸發(fā)生水解反應，生成肌醇衍生物和正憐酸，作為 單胃動物的飼料添加劑，可W促進動物對憐元素的利用，有助于畜禽生長，提高畜牧業(yè)效 益，同時它還能降低植酸憐對環(huán)境的污染，并且可W提高飼料中能量與蛋白質(zhì)的消化率?，F(xiàn) 在已成為飼料行業(yè)公認的有效飼料添加劑。植酸酶作為飼料添加劑在實際應用過程中需要 耐受飼料高溫制粒過程，因此飼用植酸酶必須耐熱，而目前大多數(shù)植酸酶耐熱性能較差。
[0003] 無花果植酸酶（黑曲霉植酸酶)雖然酶比活相對高，也具有一定的耐熱作用，但在 實際應用上還不理想，如果能夠?qū)⑵淠蜔嵝栽龈?，無花果植酸酶將具有更大的應用價值。相 比之下，煙曲霉植酸酶有著更好的耐熱性，但比活相對較低。因此，本發(fā)明根據(jù)煙曲霉植酸 酶的序列中與其耐熱性相關(guān)的氨基酸序列來改造無花果曲霉植酸酶，使其成為耐熱性高的 植酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種植酸酶突變體及其應用，旨在解決無花果植酸酶的耐 熱性較差，在實際應用上不理想的問題。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種植酸酶突變體，所述植酸酶突變 體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0006] 進一步的，所述植酸酶突變體由編碼無花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3 中第43位鄉(xiāng)氨酸變成絲氨酸、第46位脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、第169位谷氨酷胺變?yōu)樘K氨酸、第 170位脯氨酸變?yōu)樘於岚?、?71位甘氨酸變?yōu)榫彼?、?52位蘇氨酸變?yōu)榫彼?、?55 位鄉(xiāng)氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天冬氨酸變?yōu)楸彼?、?58位賴氨酸變?yōu)楣劝笨岚范@ 得。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是提供一種植酸酶突變體的編碼基因，其核巧酸序列如SEQ ID No: 2所示。
[000引本發(fā)明還提供一種替代權(quán)利要求1中植酸酶的無花果曲霉植酸酶序列，其特征在 于，所述無花果曲霉植酸酶序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0009] 本發(fā)明的第=目的是提供一種植酸酶突變體的制備方法，步驟包括：
[0010] (1)、無花果植酸酶基因連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物進行 突變PCR擴增;產(chǎn)物電泳檢測，條帶正確后加化1 DMT酶于PCR產(chǎn)物中，混勻，37°C解育化;進 而進行突變片段組裝，配制lOyl組裝體系與50°C反應15min;
[0011] (2)、加入lOiil突變組裝后的產(chǎn)物于50iil DMT感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴30min;42 °(：準確熱激45s，立即置于冰上lOmin;加500山LB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)、37 °C培養(yǎng)化;7000rpm離屯、 3min，棄上清，保留100-15化1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜；
[0012] (3)、每個位點的陽性克隆送出測序，測序結(jié)果與原序列比對，找出突變正確的重 組質(zhì)粒，再W突變一次質(zhì)粒作為模板，進行第二位點突變至止突變位點全部突變掉；
[0013] (4)設(shè)計連接引物，將突變后的植酸酶序列連接到酵母菌表達載體ppic9k上，突變 后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中進行表達，發(fā)酵測酶活，研究酶 學及應用特性。
[0014] 進一步的，步驟（1)中，所述突變PCR條件為:94°C預變性5min;94°C變性30s、66°C 退火30s、72°C延伸2.5min，共28個循環(huán);94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸2.5min，共7 個循環(huán);72°C擴增后延伸1 Omin;其中從66°C到52°C每個循環(huán)溫度下降0.5°C。
[0015] 進一步的，步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)換載體PCR反應參數(shù)為:94°C預變性5min; 94°C變性 30s，55°C退火30s，72°C延伸1.5min，共30個循環(huán);72°C擴增后延伸lOmin;
[0016] 本發(fā)明的第四目的是提供一種植酸酶突變體在飼料添加劑中的應用，特別適用水 產(chǎn)飼料。
[0017] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明提供的植酸酶突變體及其應用，通過分析具有 更好的耐熱性煙曲霉植酸酶分子結(jié)構(gòu)特征，使用煙曲霉植酸酶的部分序列來替代無花果曲 霉植酸酶氨基酸序列，無花果曲霉(黑曲霉)植酸酶氨基酸序列SEQ ID NO: 3中的氨基酸發(fā) 生如下改變 乂435，？465,91691'，？17(^，61711?，12521?，￥2550,02564，1(2589。具體方案為^無 花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)作為模版，使無花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因發(fā)生突變，獲 得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID N0:2,該突變后的基因除與PPIC9K構(gòu)建重組質(zhì)粒外， 還可W與??1〔9、？?1〔234\8\(：、？?1〔24\8\(：、？64?234\8\(：等表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化相 應宿主菌(畢赤酵母GS115或村33、5101168、？1邸14?1服），通過在平板上加入植酸巧或在平 板中加入G418、Zeocin等抗生素，篩選獲得植酸酶突變體基因工程菌，然后通過發(fā)酵獲得新 的植酸酶突變體。使其成為耐熱性高的植酸酶，該植酸酶突變體在高溫下，植酸酶的溫度耐 受情況如圖5-7所示，無論在任何溫度和時間下，突變后的相對酶活都高于突變前的，在70 °(：耐受化突變植酸酶相對酶活大約還有65%，而突變之前無花果植酸酶僅僅剩余35%，突 變植酸酶耐受化才降到半衰期W下。在80°C時突變后植酸酶相對酶活剩余一半時的時間大 約為60min，而突變前耐受15min就達到半衰期了。高溫90°C時耐受30min突變后植酸酶相對 酶活還剩余接近55%，突變前僅僅剩余25%，總之突變后與突變前相比溫度耐受相對提高 了30%;同時植酸酶突變體較原無花果曲霉植酸酶具有更寬的作用抑，相對突變前無花果 植酸酶，突變后的酶的最適抑提高了 0.5個單位，并且在中性環(huán)境下抑= 7.0相對酶活剩余 接近50%，與突變之前有改進。該突變體能在中性環(huán)境中很好發(fā)生作用，并且具有較理想耐 熱特性，適合耐高溫制粒，因此特別適合于作為水產(chǎn)飼料添加劑。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 W根據(jù)運些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1是本發(fā)明實施例提供的植酸酶突變體的制備方法流程圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明實施例3提供的最適抑的測定曲線圖；
[0021 ]圖3是本發(fā)明實施例3提供的最適溫度曲線圖；
[0022] 圖4是本發(fā)明實施例3提供的pH耐受曲線圖；
[0023] 圖5是本發(fā)明實施例3提供的70°C耐受曲線圖；
[0024] 圖6是本發(fā)明實施例3提供的80°C耐受曲線圖；
[0025] 圖7是本發(fā)明實施例3提供的90°C耐受曲線圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0027] 1、試驗材料和試劑
[00巧]菌株及載體:大腸桿菌Escherichia coli DMT感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)有 限公司，T 載體 PMD19-T,表達載體 PPIC9K 或 PPIC9、PPICZaA\B\C、PPICZA\B\C、PGAPZaA\B\C、 PPINK Hc\Lc等及畢赤酵母GS115或(X33、SMD1168、PICHIAPINK)(來源于INV口R0GEN公司）。 [00巧]2、酶類及其他生化試劑
[0030] DNA聚合酶，核酸酶內(nèi)切酶和dNTP購自化KaRa公司；植酸鋼購自Sigma公司；Fast MultiSite Mutagenesis System試劑盒購自TRANSGEN BIOTECH公司，其它都為國產(chǎn)試劑 (均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0031] 3、培養(yǎng)基：
[0032] LB培養(yǎng)基：PeptonelOg，化ast ex1:rac1:5g，化C1 lOg，加蒸饋水至 1000ml，pH=7。固 體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0 % (w/v)瓊脂。
[0033] YEPD培養(yǎng)基：Peptone20g，化ast extractlOg，glucose20g(單滅），加蒸饋水至 1000ml，pH=7。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0 % (w/v)瓊脂。
[0034] 酵母發(fā)酵培養(yǎng)基FA和FB購自INV口R0GEN公司。
[0035] 實施例1
[0036] 本發(fā)明通過計算機輔助手段比對替換了耐熱性高的煙曲霉植酸酶序列的無花果 曲霉植酸酶SEQ ID N0:4和無花果曲霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID N0:3在分子動力學模擬 過程中的氨鍵強弱作用，選取氨鍵作用加強的替換位點作為最終突變位點，即植酸酶突變 體SEQ ID N0:1。具體實施方案為利用分子動力學模擬軟件GR0MACS，在標準大氣壓強下、 lOOmM化C1溶液體系分別模擬含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的蛋白結(jié)構(gòu)在50°C和70°C下 的運動狀態(tài)50ns。利用gjiond模塊計算替換位點與互作氨基酸的氨鍵作用，最后選取氨鍵 作用相比于SEQ ID N0:3序列加強的替換位點作為最終突變位點。無花果曲霉(黑曲霉)植 酸酶氨基酸序列SEQ ID No:3中的氨基酸發(fā)生如下改變:第43位鄉(xiāng)氨酸變成絲氨酸、第46位 脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、第169位谷氨酷胺變?yōu)樘K氨酸、第170位脯氨酸變?yōu)樘於岚?、?71位 甘氨酸變?yōu)榫彼?、?52位蘇氨酸變?yōu)榫彼帷⒌?55位鄉(xiāng)氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天 冬氨酸變?yōu)楸彼?、?58位賴氨酸變?yōu)楣劝笨岚?V43S，P46S，Q169T，P170N，G171R，T252R, V25 抓，D256A，K258Q)。
[0037] 具體實施方案為W無花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因為模板，通過基因的點突變 方法，使無花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因發(fā)生突變，獲得了新的植酸酶基因的突變體SEQ ID 齡：2，將該突變基因與口口1〔91(或口口1〔9、口口1〔2日4\8\(：、口口1〔24\8\(：、口64口2日4\8\(：、口口1服 Hc\Lc相連構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或^33、5101168、？1邸14?1服）中進行表達， 發(fā)酵可W獲得該植酸酶突變體。該突變體能在中性環(huán)境中很好發(fā)生作用，并且具有較理想 耐熱特性，適合耐高溫制粒，因此特別適合于水產(chǎn)飼料添加劑。
[0038] 本發(fā)明植酸酶突變體的氨基酸序列SEQ ID No: 1;突變后無花果曲霉植酸酶核巧 酸序列SEQ ID No:2。
[0039] 實施例2，如圖1所示，一種植酸酶突變體的制備方法包括W下步驟：
[0040] S101:設(shè)計擴增引物F:-CTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R:- TAAGCAAAACACTCAGCCCAATC，無花果植酸酶連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，進行 突變PCR擴增，PCR體系按照試劑盒說明書配制50化；
[0041 ] PCR反應參數(shù)為:94°C預變性5min; 94°C變性30S，66 °C退火30s，72°C延伸3.5min， 共28個循環(huán)；94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸3.5min，共7個循環(huán)；72°C擴增后延伸 1 Omin;其中從66°C到52°C每個循環(huán)溫度下降0.5°C。
[0042] S102:取lOiil PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶正確后加化1 DMT酶于PCR 產(chǎn)物中，混勻，37°C解育化;進而進行突變片段組裝，配制lOiil組裝體系與50°C反應15min。
[0043] S103:轉(zhuǎn)化
[0044] ①加入lOiil突變組裝后的產(chǎn)物于50iil DMT感受態(tài)細胞中（在感受態(tài)細胞剛剛解凍 時加入產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴30min;
[0045] ②42 °C準確熱激45s，立即置于冰上1 Omin;
[0046] ③加500iilLB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)，37 °C培養(yǎng)化；
[0047] ④7000巧m離屯、3min，棄掉部分上清，保留100-15化1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液 涂板，培養(yǎng)過夜。
[004引S104:驗證陽性克隆子，每個位點的陽性克隆送出測序，測序結(jié)果與原序列比對， 找出突變正確的重組質(zhì)粒，再W突變一次質(zhì)粒作為模板，進行第二位點突變至止突變位點 全部突變掉。
[0049] 突變1位點引物為：
[0050] 1-F1：AATCGTCCATCTCCTCTGAGGTGCCAGCCGGATG
[0051 ] 1-R1：AGAGGAGATGGACGATTCGTTTGCCAGAGAGAAG
[0052] 突變2位點引物為：
[0053] 2-F1：TGAAGGATCCTCGTGCCACGCCCGGCCAATCGTCGCCAA
[0054] 2-R1：CCGTTCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCT
[0055] 2-F2：AAGGATCCTCGTGCCCAGAACGGCCAATCGTCGCCA
[0056] 2-R2：ATTGTCTGGGCTGGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTG
[0057] 2-F3：ATCCTCGTGCCCAGCCCAGACAATCGTCGCCAAAGATCG
[0 化引 2-R3 ： GGGCGTGGCACGAGGATCCTTCAGCTTGGTGCTCTG
[0059] 突變3位點引物為：
[0060] 3-F1：CCTTCGACACCATCTCCAGAAGCACCGTCGACACCAAGC
[0061 ] 3-R1：GGTGGCGTCGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAAGGAGC
[0062] 3-F2：ATCTCCACCAGCACCGACGCCACCAAGCTGTCCCCTTTC
[0063] 3-R2：GCTGGGTGTCGACGGTGCTGGTGGAGATGGTGTCGAA
[0064] 3-F3：CAGCACCGTCGACACCCAGCTGTCCCCTTTCTGTGAC [00化]3-R3:GCTTCTGGAGATGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG
[0066] 設(shè)計連接引物（F: -GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCTGGCAGTCCCTGCCTCGAGAA，R:- AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTAAGCAAAACACTCAGCCCAATC)，將突變后的植酸酶序列連接到酵 母菌表達載體ppic9k上，突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115來源于INV 口 R0GEN公司表達，發(fā) 酵測酶活。
[0067] 轉(zhuǎn)換載體PCR反應參數(shù)為:94°C預變性5min;94°C變性3〇3,55°(：退火305,72°(：延伸 1.5min，共30個循環(huán);72°C擴增后延伸lOmin;
[0068] 其它畢赤酵母表達載體構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化、篩選與發(fā)酵按相應的畢赤酵母載體 與宿主菌株說明書(來源于INV 口ROGEN公司)進行。
[0069] 實施例3植酸酶活力測定
[0070] 3.1、儀器與設(shè)備
[0071] 恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、恒溫培養(yǎng)振蕩器、pH儀比色皿等。
[0072] 3.2、實驗材料
[0073] 3.2.1、酶液
[0074] 突變植酸酶菌株發(fā)酵酶液(突變)、原模板植酸酶菌株發(fā)酵酶液(無花果）
[0075] 3.2.2、溶液配制
[0076] 3.2.2.1、緩沖液:具體參見2002年黃培德譯分子克隆實驗指南第=版
[0077] 0.25mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH= 1.5-3.0)
[007引 0.25mol/L乙酸-乙酸鋼緩沖液(pH=3.5-6.5)
[0079] 0.25111〇1/1化13-化1緩沖液(抑=7.0-9.0)
[0080] 3.2.2.2、底物溶液:5mmol/L植酸鋼溶液
[0081 ] 稱取0.495g肌醇六憐酸鋼（C油6〇24P6Nai2)于100ml容量瓶中，用緩沖液定容至 100ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。配好后不要使底物溶液受熱，否則將影響測試結(jié)果。
[0082] 3.2.2.3、100g/L 鋼酸錠溶液
[0083] 取lOg鋼酸錠[(NH4)6Mo7024 ? 4此0]于100ml容量瓶中，加入1ml氨水(25%)，用雙 蒸水定容至100ml。
[0084] 3.2.2.4、硝酸溶液
[0085] 將濃硝酸與雙蒸水:2的比率配制
[0086] 3.2.2.5、2.35g/L 偏饑酸錠溶液
[0087] 取0.235g偏饑酸錠(NH4V03)于100ml棟色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(3. . 2.2.4)， 用雙蒸水定容至100ml。避光下可W保存一周。
[0088] 3.2.2.6、顏色終止液配制
[0089] 將鋼酸錠溶液(3.2.2.3)、偏饑酸錠溶液(3.2.2.5)與硝酸溶液(3.2.2.4) W1:1:2 的比率配制到相應的用量，要緩慢加入硝酸溶液，終止液中不要有白色沉淀。注意終止液現(xiàn) 用現(xiàn)配。
[0090] 酶活定義：
[0091] 酶活定義為:樣品在溫度為37°C、pH=5.5條件下，每分鐘從濃度為5. Ommol/L植酸 鋼溶液中釋放1皿〇1無機憐，即為一個酶活性單位，WU表示(GB/T 18634-2009)。
[0092] 酶活測定方法:取lOmL試管，加入1.8mL緩沖液(3.2.2.1)，加入0.2ml待測酶液，混 合后預熱5min，依次加入底物(3.2.2.2)，加入底物時間間隔一致，混合后反應30min，之后 依次加入終止液(3.2.2.6)，加入時間間隔和加入底物的時間間隔一致，混合后，冷卻1 Omin 在415nm波長下測定吸光值。如果有沉淀應先離屯、再測吸光值。對照組為先加入終止液后冷 卻至室溫再加入底物溶液。實驗為一個對照組，=個平行試驗。
[0093] (1)植酸酶抑適性和溫度適性的測定
[0094] ①植酸酶抑最適性測定
[00巧]將緩沖液(3.2.2.1)調(diào)成不同pH:2、3、4、5、6、7、8,9甘氨酸-鹽酸a.5-3.0)乙酸- 乙酸鋼(3.5-6.5)Tris-化l(7.0-9.0)不同抑的緩沖液溶解底物成不同抑，將酶液稀釋到合 適的倍數(shù)，依照上述的試驗方法在37°C測出最適抑，之后在最大值兩側(cè)補半點繼續(xù)檢測最 適抑值(例如最適抑=5，則再取抑=4、4.5、5、5.5和6按照上述的方法檢測）。
[0096] ②植酸酶溫度最適性的測定
[0097] 依照上述的方法測定，在上述pH的條件下，將反應物放在不同溫度下反應：10°C、 20°C、30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C，測出最適溫度后，在最大值兩側(cè)補半點（例如最適 溫度是40°C，則補充30°C、35°C、40°C、45°C、50°C按照上述方法檢測）。
[009引③植酸酶抑耐受測定
[0099] 將緩沖液(3.2.2.1)調(diào)節(jié)到不同pH: 2、3、4、5、6、7、8，用運些不同pH的緩沖液稀釋 酶液，從放入酶液之時開始計時，稀釋好的酶液放入37°C水浴鍋中耐受1小時放在冰上，之 后立馬按照上述的方法在最適pH和最適溫度下進行反應。對照組的酶液是未耐受過的酶 液。
[0100] ④植酸酶溫度耐受測定
[0101] 將酶液稀釋到相應倍數(shù)，然后放入不同溫度：70°c、80°C、90°C耐受Imin、3min、 5min、lOmin、15min、20min、30min、60min、90min、120min、150min。之后按照上述方法在最適 pH和最適溫度下反應。對照實驗組酶液是未溫度耐受過的酶液。
[0102] (2)結(jié)果與分析
[0103] ①無花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)基因突變，按上實驗方法進行突變后送華大基因 公司測序，結(jié)果如SEQ ID N0:2,對應植酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO: 1，轉(zhuǎn)化的酵母菌株具 有植酸酶活性，選取一株發(fā)酵酶活性單位高的菌株進行發(fā)酵獲得酶液進行酶學性質(zhì)測定。
[0104] ②植酸酶最適抑測定
[0105] 植酸酶酶促反應最適pH值結(jié)果如圖2所示。突變體與無花果植酸酶最適抑分別為 6.0、5.5;并且在2.5都有一個峰值，相對突變前無花果植酸酶，突變后的酶的最適抑提高了 0.5個單位，并且在中性環(huán)境下抑=7.0剩余接近50 %左右相對酶活，與突變之前有改進。
[0106] ③植酸酶最適溫度測定
[0107] 植酸酶酶促反應最適溫度值如圖3所示，突變和無花果植酸酶最適溫度為50°C ;突 變前后二者差異不明顯。
[0108] ④植酸酶酶促反應中pH耐受
[0109] 由圖4可知，兩種植酸酶的pH耐受曲線趨勢是相同的，在pH = 2-9之間37°C耐受化 相對酶活并沒有太大變化，基本維持在60 % W上。
[0110] ⑤植酸酶溫度耐受
[0111] 高溫下植酸酶的溫度耐受情況如圖5-7所示，隨著溫度的升高，相對酶活不斷降 低，隨著時間的增加，相對酶活也逐漸降低。無論在任何溫度和時間下，突變后的相對酶活 都高于突變前的，在70°C耐受化突變植酸酶相對酶活大約還有65%，而突變之前無花果植 酸酶僅僅剩余35%，突變植酸酶耐受化才降到半衰期W下。在80°C時突變后植酸酶相對酶 活剩余一半時的時間大約為60min，而突變前耐受15min就達到半衰期了。高溫90°C時耐受 30min突變后植酸酶相對酶活還剩余接近55%，突變前僅僅剩余25%，總之突變后與突變前 相比溫度耐受相對提高了30%。
[0112] 本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解，除非另外定義，運里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù) 語和科學術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像運里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
[0113] 最后所應說明的是：W上實施例僅用W說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應該理解:依然可W對本 發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。
【主權(quán)項】
1. 一種植酸酶突變體，其特征在于，所述植酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID N〇:l所 不。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體，其特征在于，所述植酸酶突變體由編碼無花果曲 霉植酸酶氨基酸序列SEQ ID No:3中第43位纈氨酸變成絲氨酸、第46位脯氨酸變?yōu)榻z氨酸、 第169位谷氨酰胺變?yōu)樘K氨酸、第170位脯氨酸變?yōu)樘於０?、?71位甘氨酸變?yōu)榫彼帷?第252位蘇氨酸變?yōu)榫彼帷⒌?55位纈氨酸變?yōu)樘於彼?、?56位天冬氨酸變?yōu)楸彼帷?第258位賴氨酸變?yōu)楣劝滨０范@得。3. 編碼權(quán)利要求1所述植酸酶突變體的編碼基因，其特征在于，所基因的核苷酸序列如 SEQIDNo:2**。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟包括： (1) 、無花果植酸酶基因連接到PMD19-T載體上的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物進行突變 PCR擴增;產(chǎn)物電泳檢測，條帶正確后加 lylDMT酶于PCR產(chǎn)物中，混勻，37°C孵育lh;進而進行 突變片段組裝，配制1〇μ1組裝體系與50°C反應15min; (2) 、加入10μ1突變組裝后的產(chǎn)物于50μ1 DMT感受態(tài)細胞中，混勻，冰浴30min;42°C準 確熱激45s，立即置于冰上lOmin;加500ylLB培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)、37°C培養(yǎng)lh;7000rpm離心3min， 棄上清，保留100-150μ1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜； (3) 、每個位點的陽性克隆送出測序，測序結(jié)果與原序列比對，找出突變正確的重組質(zhì) 粒，再以突變一次質(zhì)粒作為模板，進行第二位點突變至止突變位點全部突變掉； (4) 設(shè)計連接引物，將突變后的植酸酶序列連接到酵母菌表達載體ppic9k上，突變后的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115或X33、SMD1168、PICHIAPINK中進行表達，發(fā)酵測酶活，研究酶學及 應用特性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述突變 PCR條件為:94°C預變性5min;94°C變性3〇8、66°(：退火3〇8、72°(：延伸2.51^11，共28個循環(huán)；94 。(:變性30s，52°C退火30s，72°C延伸2.5min，共7個循環(huán);72°C擴增后延伸lOmin;其中從66°C 到52°C每個循環(huán)溫度下降0.5°C。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述植酸酶突變體的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)換載 體PCR反應參數(shù)為：94 °C預變性5min; 94 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸1.5min，共30個 循環(huán);72°C擴增后延伸lOmin。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶突變體在飼料添加劑中的應用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述植酸酶突變體在水產(chǎn)飼料添加劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK106047836SQ201610421861
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】黃遵錫, 韓楠玉, 苗華彪
【申請人】昆明愛科特生物科技有限公司