一種ι-卡拉膠酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ι?卡拉膠酶的制備方法，將一株產(chǎn)卡拉膠酶的菌株P(guān)seudoalteromonas carrageenovora ASY5接種于種子培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)酶，分離含ι?卡拉膠酶發(fā)酵液獲得ι?卡拉膠酶。本發(fā)明以ι?卡拉膠作為誘導(dǎo)劑發(fā)酵生產(chǎn)ι?卡拉膠酶，建立了ι?卡拉膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，對(duì)于卡拉膠降解酶及卡拉膠寡糖工業(yè)化生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
_種1 -卡拉膠酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物酶的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種^-卡拉膠酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卡拉膠又稱角叉菜膠、鹿角藻膠，是從某些紅藻(如麒麟菜屬、杉藻屬、角叉菜屬等)提取的極有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多糖，是由l，3-13_D-吡喃半乳糖和l，4-a-D-吡喃半乳糖交替連接而成的線性硫酸多糖。具有廣泛經(jīng)濟(jì)價(jià)值的僅有三種:主要為K-型、t-型和λ-型三種，其二糖單元分別含有I個(gè)、2個(gè)和3個(gè)硫酸基。t-型卡拉膠形成的凝膠富于彈性，柔軟、觸變性，無脫水收縮性，又具有耐高鹽等性質(zhì)，這些與K-型和λ-型膠體有明顯的不同，使得其在食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值和潛力?？ɡz的降解產(chǎn)物卡拉膠寡糖，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，有望成為新一代的海洋藥物。
[0003]卡拉膠酶(Carrageenase)是一種糖水解酶，它降解卡拉膠的β-l，4糖苷鍵產(chǎn)生卡拉膠低聚糖?？ɡz酶不但能作為工具酶用于卡拉膠寡糖的制備，還能用于藻類原生質(zhì)體的制備和卡拉膠結(jié)構(gòu)的研究，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]卡拉膠酶主要來源于海洋微生物及海洋軟體動(dòng)物，已在噬纖維菌屬、別單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、芽抱桿菌屬等屬的微生物中發(fā)現(xiàn)了卡拉膠酶。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)K-卡拉膠酶的研究較多，而對(duì)1-卡拉膠酶和λ_卡拉膠酶的報(bào)道很少。已經(jīng)報(bào)道的K-卡拉膠酶有十幾種，且都屬于糖苷水解酶16家族，但1-卡拉膠酶研究較少，目前只有來源于W teromonasfort is ^Oellulophaga ^Zobellia galactano voran s Microbuibifer thermo tol erans^ ι -卡拉膠酶，進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)等方面的研究及酶的重組表達(dá)。因此，尋找高活力的新型1-卡拉膠酶具有重要的理論意義和明確的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種卜卡拉膠酶的制備方法，通過發(fā)酵生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)ι -卡拉膠酶的最佳制備方法。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明解決的技術(shù)方案為:
一種ι -卡拉膠酶的制備方法，將產(chǎn)ι -卡拉膠酶的菌種JpSeuc/oa 2 i ero?o/3ascarrageenovora ASY5接種于種子培養(yǎng)基中，23°C活化培養(yǎng)24 h，活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中20°C發(fā)酵培養(yǎng)40 h，然后發(fā)酵液在4°C、10000 r/min條件下離心20 min，收集上清，即得ι-卡拉膠酶粗酶液。
[0007]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述種子培養(yǎng)基為:牛肉膏10g，胰蛋白胨10 g，加入蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)pH 7.8，水浴10 min，調(diào)節(jié)pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混勻后，121°C滅菌15 min，冷卻后在4°C下保存?zhèn)溆?所述人工海水中包括氯化鈉、氯化鉀、二水合氯化鈣、六水合氯化鎂、碳酸氫鈉、七水合硫酸鎂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 mL)依次為2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0008]作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉、酵母粉、二水合氯化鈣、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、1-卡拉膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 mL)依次為1.5、1.5、
0.02、0.38、0.13、0.9，充分混勻后，121°(:滅菌15 min，在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0009]本發(fā)明米用的產(chǎn)ι-卡拉膠酶的菌種carrageenovoraASY5，購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào):CICC 23819，前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌種能夠產(chǎn)生降解1-卡拉膠的1-卡拉膠酶。本發(fā)明以1-卡拉膠作為誘導(dǎo)劑發(fā)酵生產(chǎn)1-卡拉膠酶，建立了 1-卡拉膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，通過優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基，酶活達(dá)到1.24 U/mL，是優(yōu)化前的2.21倍，這對(duì)于卡拉膠降解酶和卡拉膠寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0010]圖1為波長(zhǎng)520nm處半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；橫坐標(biāo)為相當(dāng)半乳糖量(yg)，縱坐標(biāo)為吸光度，直線回歸方程為y=0.0034x-0.0333，相關(guān)系數(shù):R2=0.9983;
圖2為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶相對(duì)酶活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖3為培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為培養(yǎng)溫度(°C)，縱坐標(biāo)為t-卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為1-卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖4為接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為接種量(mL)，縱坐標(biāo)為1-卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι -卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖5為裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為裝液量(mL)，縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι -卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖6為初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為初始pH值，縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι -卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖7為不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為不同碳源，縱坐標(biāo)為卜卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι -卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖8為碳源添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為碳源添加量(％)，縱坐標(biāo)為卜卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖9為不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為不同氮源，縱坐標(biāo)為卜卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι -卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖10為氮源添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為氮源添加量(％)，縱坐標(biāo)為卜卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖11為NaCl添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響圖；橫坐標(biāo)為NaCl添加量(g/L)，縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶相對(duì)活力(％)，次縱坐標(biāo)為ι-卡拉膠酶菌體密度Qftoo ；
圖12為優(yōu)化前后酶活變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]為使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面列舉本發(fā)明的具體實(shí)施例，并配合說明書附圖，詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。需強(qiáng)調(diào)的:實(shí)施例并非本發(fā)明技術(shù)方案所有可能實(shí)施方式的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]實(shí)驗(yàn)方法 1、初始培養(yǎng)基的配制
(I)人工海水:氯化鈉、氯化鉀、二水合氯化鈣、六水合氯化鎂、碳酸氫鈉、七水合硫酸鎂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 11^)依次為2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0013](2)種子培養(yǎng)基:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)pH 7.8，水浴10 min，調(diào)節(jié)pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混勻后，121°C滅菌15 min，冷卻后在4
°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0014](3)發(fā)酵培養(yǎng)基:氯化鈉、胰蛋白胨、二水合氯化鈣、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、ι-卡拉膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 mL)依次為2、0.5、0.02、0.38、0.13、0.5，充分混勻后，121°C滅菌15 min，在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0015]2 t-卡拉膠酶的制備
(I)菌種的活化:將產(chǎn)卡拉膠酶的菌種Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接種于種子培養(yǎng)基中，23°C活化培養(yǎng)24 ho
[0016](2)發(fā)酵培養(yǎng):菌種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，20°C發(fā)酵培養(yǎng)40 ho
[0017](3)將上述發(fā)酵液在4°C、10000 r/min條件下離心20 min，收集上清，即得ι-卡拉膠酶粗酶液。
[0018]3、卜卡拉膠酶發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化
通過單因素法對(duì)產(chǎn)卡拉膠酶菌株進(jìn)行培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分析不同因素對(duì)菌株ASY5的菌體密度及酶產(chǎn)量的影響，在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上，分別考察了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、初始PH、碳源、最佳碳源、氮源、最佳氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，從而篩選出最佳成分及培養(yǎng)條件。
[0019]4、卜卡拉膠酶活力的測(cè)定
發(fā)酵液離心后，分別取400 UL新鮮的發(fā)酵酶液和經(jīng)煮沸滅活發(fā)酵酶液加入到盛有600t>L濃度為0.5 g/L卜卡拉膠底物的試管中，分別記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將二者置于40°C水浴鍋中水浴反應(yīng)40 min，以反應(yīng)液中還原糖的增加量作為檢測(cè)酶活力的指標(biāo)。
[0020]采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法來測(cè)定還原糖，先取I mL的反應(yīng)液于管中再加ImL DNS溶液，在沸水浴反應(yīng)5 min，冰上冷卻10 min左右，用蒸餾水定容至5 mL，以蒸餾水作為空白，于520 nm下測(cè)定吸光度值。酶活力單位(U)定義為:在40° C條件下，每分鐘產(chǎn)生Imo I還原糖(以半乳糖計(jì))所需要的酶量。
[0021]以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，橫坐標(biāo)為半乳糖的相當(dāng)量(yg)，縱坐標(biāo)為其在520 nm處的光吸收值，由此得到的線性回歸方程是:y=0.0034χ_0.0333，R2 =
0.9983)ο
[0022]實(shí)施例1:
ι-卡拉膠酶發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化
(I)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
將活化后的產(chǎn)卡拉膠酶菌種Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在18°C，選擇培養(yǎng)O h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h后，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)時(shí)間。
[0023]由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加酶活呈上升趨勢(shì)，在32h-40 h之間，ι-卡拉膠酶活趨于平穩(wěn)，在40 h酶活達(dá)到最高值，在40 h以后酶活開始下降。由此確定菌株ASY5發(fā)酵產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)時(shí)間為40 ho
[0024](2)培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
設(shè)置培養(yǎng)溫度為16 °C、18 °C、20 °C、22 °C、24 °C、26 °C、28 °C，在最適培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)溫度。
[0025]溫度通過影響微生物體內(nèi)各種生理代謝所需的酶而影響微生物的新陳代謝活動(dòng)，菌株P(guān)seudoalteromonas carrageenovora ASY5來源于海洋，屬于海洋細(xì)菌，所以在較低溫度時(shí)能夠生長(zhǎng)良好。由圖3可知，菌體在20°C時(shí)生長(zhǎng)得最好。
[0026](3)接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
設(shè)置接種量為I %、2%、3%、4%、5%、6%、7%，在最適培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳接種量。
[0027]由圖4可知，當(dāng)接種量由1%增加到4%時(shí)，酶活迅速上升，當(dāng)接種量為4%時(shí)卜卡拉膠酶活達(dá)到最高，菌體生長(zhǎng)最好，所以菌株的最適接種量為4%。
[0028](4)裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
將產(chǎn)卡拉膠酶菌株按照25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL的裝液量在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，然后冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳裝液量。
[0029]由圖5可知，當(dāng)250mL三角瓶中裝液量為25 mL-125 mL時(shí)，酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，裝液量為50 mL時(shí)，產(chǎn)酶量最高，說明發(fā)酵液中的溶氧量比較適宜，所以選擇最適裝液量為50 mL/250 mL。
[0030](5)初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
設(shè)置初始pH值為pH 6、pH 6.5,pH 7、pH 7.5,pH 8、pH 8.5,pH 9、pH 9.5，在上述最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最適初始pH值。
[0031 ]由圖6可知，當(dāng)pH為6.0-9.5時(shí)，卡拉膠酶活力隨著pH值的增加，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，PH為7.0時(shí)獲得最高ι-卡拉膠酶活力。菌株在6.0-9.0環(huán)境中均能生長(zhǎng)，在pH為7.0-9.0時(shí)，菌體密度趨于穩(wěn)定，但大于9.5時(shí)生長(zhǎng)較弱，綜合考慮選擇其最適生長(zhǎng)pH為pH 7.0。
[0032](6)碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
分別加入0.25%的蔗糖、麥芽糖、t -卡拉膠、K-卡拉膠、a-乳糖、葡萄糖、海藻酸鈉作為培養(yǎng)基的唯一碳源，在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳碳源。
[0033]微生物的碳源譜很廣，但對(duì)于異養(yǎng)微生物來說，糖類是最廣泛利用的碳源，其次是醇類，有機(jī)酸類和脂類等。如圖7可知，菌株在不同碳源存在的情況下，菌株均能生長(zhǎng)，其中K-卡拉膠和卜卡拉膠均能獲得較高的卜卡拉膠酶活力。通過圖8發(fā)現(xiàn)，t-卡拉膠在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)產(chǎn)酶，隨著ι-卡拉膠濃度的增加，菌體生長(zhǎng)越來越好，菌株產(chǎn)ι-卡拉膠酶的能力越來越強(qiáng)，由此確定ι-卡拉膠最佳濃度為0.9%。
[0034](7)氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
分別加入0.5%的細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨，硝酸鈉、硝酸錢、磷酸氫二銨、氯化銨作為培養(yǎng)基的唯一氮源，在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，確定培養(yǎng)基的最佳氮源。
[0035]氮源是可以被微生物利用，構(gòu)成細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的物質(zhì)的總稱由圖9可知，添加不同的氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響不同，添加濃度為0.5%的有機(jī)氮源(酵母粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、胰蛋白胨)時(shí)，菌體生長(zhǎng)較好，菌株能夠利用有機(jī)氮源產(chǎn)ι-卡拉膠酶，而在0.5%的無機(jī)氮源(0.5%的硝酸鈉、硝酸銨、磷酸氫二銨)存在條件下，ι-卡拉膠酶酶活很低，所以選擇酵母粉為最佳氮源。圖10顯示，一定濃度的酵母粉對(duì)菌體的生長(zhǎng)合成具有明顯的抑制作用，當(dāng)添加量為1.5%時(shí)獲得最大菌體密度，隨后菌體密度急劇下降，最終確定酵母粉的最佳添加量為1.5%。
[0036](8)NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響
分別向培養(yǎng)基中添加 10 g/L、15 g/L,20 g/L,25 g/L,30 g/L,35 g/L的NaCl，以改變培養(yǎng)基的鹽度，在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，分別測(cè)其菌體密度，利用冷凍離心收集酶液，并用DNS法測(cè)定酶活，
菌株P(guān)seudoal teromonas car rage en o vora ASY5來源于海洋，故菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶會(huì)受NaCl濃度的影響，如圖11所示，隨著NaCl濃度的增加，卡拉膠酶活力都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，菌體密度一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，雖然環(huán)境中的高鹽濃度是菌生長(zhǎng)必須的，但過高的鹽濃度對(duì)酶的活力卻有一定的抑制作用，也不利于菌株生長(zhǎng)，NaCl濃度為15 g/L時(shí)，ι-卡拉膠酶活力達(dá)到最高值，所以選擇最適NaCl濃度為15 g/L。
[0037]
實(shí)施例2:
ι-卡拉膠酶發(fā)酵優(yōu)化工藝與初始發(fā)酵工藝對(duì)照，按照實(shí)施例1的優(yōu)化參數(shù)，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
1、優(yōu)化后培養(yǎng)基的配制
人工海水:包括氯化鈉、氯化鉀、二水合氯化鈣、六水合氯化鎂、碳酸氫鈉、七水合硫酸鎂，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 1^)依次為2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0038]種子培養(yǎng)基:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸餾水250 mL，調(diào)節(jié)pH 7.8，水浴10min，調(diào)節(jié)pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混勻后，121°C滅菌15 min，冷卻后在4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0039]發(fā)酵培養(yǎng)基:氯化鈉15g，酵母粉15 g，二水合氯化鈣0.2 g，十二水合磷酸氫二鈉3.82 g，二水合磷酸二氫鈉1.3 g，ι-卡拉膠9 g，依次溶于1000 mL的蒸饋水中，充分混勾后，121°C滅菌15 min，在4 oC下保存?zhèn)溆谩?br>[0040]2、優(yōu)化后ι-卡拉膠酶活力的測(cè)定
(I)菌種的活化:將產(chǎn)卡拉膠酶的菌種Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接種于種子培養(yǎng)基中，23°C活化培養(yǎng)24 ho
[0041](2)發(fā)酵培養(yǎng):菌種活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:1-卡拉膠0.9%，酵母粉1.5%，NaCl 15 g/L，培養(yǎng)溫度20°C，接種量4%，裝液量50 mL，培養(yǎng)時(shí)間40 h，培養(yǎng)基的初始pH為pH 7.0。
[0042](3)將上述發(fā)酵液在4°C、10000 r/min條件下離心20 min，收集上清，即得ι-卡拉膠酶粗酶液。
[0043](4)以1-卡拉膠作為誘導(dǎo)劑發(fā)酵生產(chǎn)1-卡拉膠酶，建立了 1-卡拉膠酶的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，通過優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基，如圖12所示，優(yōu)化后酶活達(dá)到1.24 U/mL，是優(yōu)化前的2.21倍，這對(duì)于卡拉膠降解酶和卡拉膠寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
[0044]以上實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的具體描述，僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非本發(fā)明技術(shù)方案的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種1-卡拉膠酶的制備方法，其特征在于:將產(chǎn)1-卡拉膠酶的菌種Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接種于種子培養(yǎng)基中，23°C活化培養(yǎng)24 h，活化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中20°C發(fā)酵培養(yǎng)40 h，然后發(fā)酵液在4°C、10000 r/min條件下離心20 min，收集上清，即得t -卡拉膠酶粗酶液。2.如權(quán)利要求1所述的一種卜卡拉膠酶的制備方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基為:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸饋水250 mL，調(diào)節(jié)pH 7.8，水浴10 min，調(diào)節(jié)pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混勻后，121°C滅菌15 min，冷卻后在4°C下保存?zhèn)溆?所述人工海水中包括氯化鈉、氯化鉀、二水合氯化鈣、六水合氯化鎂、碳酸氫鈉、七水合硫酸鎂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 11^)依次為2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。3.如權(quán)利要求1所述的一種卜卡拉膠酶的制備方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉、酵母粉、二水合氯化鈣、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、1-卡拉膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/100 1^)依次為1.5、1.5、0.02、0.38、0.13、0.9，充分混勻后，121°(:滅菌15 min，在4° C下保存?zhèn)溆谩?br>【文檔編號(hào)】C12N9/38GK105950590SQ201610592652
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月26日
【發(fā)明人】肖安風(fēng), 李佳佳, 肖瓊, 倪輝, 蔡慧農(nóng), 吳昌正, 朱艷冰
【申請(qǐng)人】集美大學(xué)