一種茶樹花原生質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種茶樹花原生質(zhì)體及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶葉是中國乃至世界的主要飲料，其之所W能成為中國人千百年W來篩選出來的 主要飲品，成為生活屯件事之一，是因?yàn)椴枞~中含有多種功能成分，可W促進(jìn)人體代謝活 力、提高免疫力、生津活血、凝神靜思，現(xiàn)代科學(xué)又發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗炎、降血糖、降血脂等 諸多功效。茶葉具有如此之多的功效物質(zhì)，但目前對其研究尚淺，運(yùn)些物質(zhì)的代謝及其調(diào)控 機(jī)制仍不明確，運(yùn)一方面是有由于運(yùn)些物質(zhì)是茶葉中特有的物質(zhì)，沒有模式植物可W借鑒， 另一方面，也正是由于該物種的特異性，想要確定某個蛋白基因的功能，沒有很好的表達(dá)體 系去驗(yàn)證，很多機(jī)制由于擬南芥或煙草中沒有相關(guān)的代謝通路，無法得到驗(yàn)證;而且茶葉是 木本植物，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)和組培技術(shù)的發(fā)展也頗具難度，因此，開發(fā)茶樹原生質(zhì)體分離和表 達(dá)的技術(shù)，是一個重要的突破方向。目前有一些木本植物葉子的原生質(zhì)體分離技術(shù)可W借 鑒，如蘋果、澄子等，然而茶樹的葉子由于纖維素和多酪等含量高，難W得到大量狀態(tài)好的 原生質(zhì)體用于后期轉(zhuǎn)化表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中做茶樹基因功能驗(yàn)證的手段匿乏，提供一種高效 分離茶樹花原生質(zhì)體的方法W及該方法制備得到的茶樹花原生質(zhì)體和該茶樹花原生質(zhì)體 在外源基因的表達(dá)應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，與其他植物相比，茶樹(Camellia sinensis)的葉子由于高纖 維、高多酪含量，難W獲取高質(zhì)量、大數(shù)量的原生質(zhì)體，茶樹花作為廢棄資源，具有跟茶葉一 致的遺傳背景，而且花的組織比較嫩，容易分離，茶樹花的原生質(zhì)體則能獲得很好的分離效 果和表達(dá)活性。
[0005] 本發(fā)明的茶樹花原生質(zhì)體，是將茶樹花置于消化酶液中經(jīng)酶解消化后得到茶樹花 原生質(zhì)體。
[0006] 優(yōu)選，所述的消化酶液具體配方為：每10ml含有MES 0.039g、甘露醇1.6g、KCl 0.0149g、纖維素酶0.15g、離析酶0.04g、果膠酶0.01 g和CaCh 0.0148g，余量為水。
[0007] 優(yōu)選，具體步驟如下：將茶樹花弄成細(xì)條后，放置于消化酶液中，于黑暗25°C下?lián)u 晃酶解消化得到茶樹花原生質(zhì)體。
[000引本發(fā)明還提供了上述茶樹花原生質(zhì)體在將外源基因轉(zhuǎn)入該茶樹花原生質(zhì)體進(jìn)行 表達(dá)的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明通過調(diào)整消化酶液配方體系，可W將茶樹花100%徹底降解，并獲得大量未 破損的茶樹花原生質(zhì)體。同時，外源基因轉(zhuǎn)化茶樹花原生質(zhì)體后得到的表達(dá)率可達(dá)30% W 上，與模式植物擬南芥中的平均表達(dá)水平一致。本發(fā)明對今后茶樹基因功能驗(yàn)證乃至亞細(xì) 胞定位w及代謝產(chǎn)物檢測提供了更直接的證據(jù)，比在擬南芥和煙草等模式植物中驗(yàn)證更有 針對性;而且，與長達(dá)一周W上的農(nóng)桿菌注射煙草或組培茶苗的瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)相比，該方法 所需的設(shè)備材料簡單，且快速有效，兩天即可看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而茶樹花原生質(zhì)體的分離也為 其進(jìn)一步綜合利用奠定了一定的基礎(chǔ)，還可W對茶樹花廢棄資源的深加工利用奠定一定的 基礎(chǔ)。
【附圖說明】：
[0010]圖1是在血球計數(shù)板上觀察的經(jīng)消化酶液消化分離后的茶樹花原生質(zhì)體，一個個 透明的圓形細(xì)胞即為茶樹花原生質(zhì)體。
[oow 圖2是在倒置巧光顯微鏡中觀察的經(jīng)eGFP: :pUC18轉(zhuǎn)化后的茶樹花原生質(zhì)體，圖中 A、C是明場，分別是在10倍和20倍的放大倍數(shù)下;B、D是對應(yīng)的GFP通道，其中的亮點(diǎn)是大量 表達(dá)了綠色巧光蛋白GFP的茶樹花原生質(zhì)體。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[001引實(shí)施例1:
[0014] 申請人研究發(fā)現(xiàn)，與其他植物相比、并經(jīng)過一定的條件優(yōu)化，茶樹花的原生質(zhì)體能 獲得很好的分離效果和外源基因表達(dá)活性。
[0015] W下對實(shí)施例的具體步驟進(jìn)行說明：
[0016] a)茶樹花原生質(zhì)體的分離純化：
[0017] 消化酶液配方如表1所示。其中纖維素酶(Cellulase R-10)、離析酶(Macero巧me R-10)、果膠酶(Pectinase Y-23)購自日本YaKult公司。其他試劑購自美國Sigma公司。在加 入化亂之前先55°C熱處理去除蛋白酶活性，恢復(fù)到室溫后再加入化此。其配制方法是，先 將MES0.039g、甘露醇1.6g、KCl 0.0149g、纖維素酶0.15g、離析酶0.04g、果膠酶O.Olg加入 水中，55°C熱處理lOmin后恢復(fù)至室溫，再加入化Cl2 0.0148g，然后用水定容至10ml，由此 得到消化酶液，消化酶液配好后，經(jīng)0.45WI1濾膜過濾W除去未徹底溶解的粉末，轉(zhuǎn)入9cm培 養(yǎng)皿中。然后取10朵茶樹花的花瓣，用刀片切成0.1mm的細(xì)條后，浸入10ml消化酶液中，在黑 暗25°C下，W轉(zhuǎn)速50巧m搖晃消化化.。
[0018] 表1原生質(zhì)體消化酶液配方（10ml體系）
[0019]
[0020] b)茶樹花原生質(zhì)體的純化與轉(zhuǎn)化
[0021] 經(jīng)化的酶液消化后，茶樹花瓣基本上都降解成分散的原生質(zhì)體，由此得到茶樹花 原生質(zhì)體，此時在此茶樹花原生質(zhì)體中加入10ml的W5溶液(表2)，混勻后經(jīng)75皿的尼龍網(wǎng)過 濾。濾液經(jīng)200 X g離屯、2min，吸去上清。沉淀用1ml W5溶液重懸，并在血球計數(shù)板下計數(shù)后 (圖1)，用W5溶液將濃度稀釋到2 X 105celIs/ml。將稀釋后的茶樹花原生質(zhì)體溶液在冰浴中 放置30min后，吸去上清，再加入同體積的MMg溶液(表2)，使?jié)舛热詾?X105cells/ml，得到 含茶樹花原生質(zhì)體的MMg溶液。
[0022] 取10化1上述含茶樹花原生質(zhì)體的MMg溶液，加入lOul eGFP: :pUC18質(zhì)粒（即含有 eGFP的pUC 18質(zhì)粒，在質(zhì)粒能表達(dá)eGFP)和11 Ou 1陽G/化溶液(表2)，混勻后室溫放置15min。 加入440ul W5溶液顛倒混勻，經(jīng)200Xg離屯、2min后吸去上清，沉淀用50化1 W5溶液稀釋后 轉(zhuǎn)移到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在弱光下培養(yǎng)過夜后，在倒置巧光顯微鏡下觀察表達(dá)情況。
[0023] 表2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試劑配方
[0024]
[0025] 結(jié)果顯示，本發(fā)明幾乎可W100%徹底降解茶樹花，獲得大量未破損的茶樹花原生 質(zhì)體。而轉(zhuǎn)化茶樹花原生質(zhì)體后得到的表達(dá)率可達(dá)30% W上（圖2,圖中A、C是明場，分別是 在10倍和20倍的放大倍數(shù)下;B、D是對應(yīng)的GFP通道，其中的亮點(diǎn)是大量表達(dá)了綠色巧光蛋 白GFP的原生質(zhì)體），與模式植物擬南芥中的平均表達(dá)水平一致。本發(fā)明對今后茶樹基因功 能驗(yàn)證乃至亞細(xì)胞定位W及代謝產(chǎn)物檢測提供了更直接的證據(jù)，比在擬南芥和煙草等模式 植物中驗(yàn)證更有針對性;而且，與長達(dá)一周w上的農(nóng)桿菌注射煙草或組培茶苗的瞬時表達(dá) 實(shí)驗(yàn)相比，該方法所需的設(shè)備材料簡單，且快速有效，兩天即可看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而茶樹花原 生質(zhì)體的分離也為其進(jìn)一步綜合利用奠定了一定的基礎(chǔ)。
【主權(quán)項】
1. 一種茶樹花原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，是將茶樹花置于消化酶液中經(jīng)酶解 消化后得到茶樹花原生質(zhì)體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的消化酶液配方為:每10ml含有 MES 0.039g、甘露醇 1.6g、KCl 0.0149g、纖維素酶0.15g、離析酶0.04g、果膠酶O.Olg和 CaCl2 0.0148g，余量為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下:將茶樹花弄成細(xì)條后， 放置于消化酶液中，于黑暗25°C下?lián)u晃酶解消化得到茶樹花原生質(zhì)體。4. 一種按照權(quán)利要求1、2或3所述的制備方法制備得到的茶樹花原生質(zhì)體。5. 權(quán)利要求4所述的茶樹花原生質(zhì)體在將外源基因轉(zhuǎn)入該茶樹花原生質(zhì)體進(jìn)行表達(dá)的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種茶樹花原生質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。是將茶樹花置于消化酶液中經(jīng)酶解消化后得到茶樹花原生質(zhì)體。本發(fā)明通過調(diào)整消化酶液配方體系，可以將茶樹花100％徹底降解，并獲得大量未破損的茶樹花原生質(zhì)體。同時，外源基因轉(zhuǎn)化茶樹花原生質(zhì)體后得到的表達(dá)率可達(dá)30％以上，與模式植物擬南芥中的平均表達(dá)水平一致。本發(fā)明對今后茶樹基因功能驗(yàn)證乃至亞細(xì)胞定位以及代謝產(chǎn)物檢測提供了更直接的證據(jù)，比在擬南芥和煙草等模式植物中驗(yàn)證更有針對性；而且，與長達(dá)一周以上的農(nóng)桿菌注射煙草或組培茶苗的瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)相比，該方法所需的設(shè)備材料簡單，且快速有效，兩天即可看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【IPC分類】C12N5/04
【公開號】CN105670985
【申請?zhí)枴緾N201610255637
【發(fā)明人】楊子銀, 梅鑫, 周瀛, 傅秀敏
【申請人】中國科學(xué)院華南植物園
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月22日