一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，適用于以根皮苷為原料制備水溶性黃色素。該方法在根皮苷酶促氧化反應體系中同時加入β?葡萄糖苷酶和多酚氧化酶，使部分根皮苷先行被β?葡萄糖苷酶分解為根皮素，提高其反應活性，然后再在多酚氧化酶作用下進行酶促氧化，反應的速率和效率得到大幅提高。經(jīng)進一步萃取、純化后得到水溶性的黃色素，在pH2～5條件下呈亮麗的黃色，并且具有抗氧化等生物活性。利用本發(fā)明制備蘋果黃色素，既有效提高了根皮苷的酶促轉(zhuǎn)化速率，又避免了直接采用根皮素作為氧化底物原料成本過高的問題，具有較好的應用前景。
【專利說明】
一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及食用色素的酶法合成技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會的進步和人民生活水平的提高，食用合成色素對人體健康的影響和危害愈來愈受到關(guān)注，對天然食用色素的需求越來越大。黃色素是食品和化妝品工業(yè)非常需要的一種色素，過去通常用人工合成的酒石黃替代，但這種合成色素容易引起人們患哮喘和風疹，因此已在許多國家被禁止使用。然而，尋找天然水溶性的黃色素一直是個難題，并且為數(shù)不多的天然黃色素還會因為種種缺陷而使其應用受到極大的限制。如姜黃色素的水溶性較差，梔子黃色素雖易溶于熱水為橙色溶液，但其耐酸性較差也會使其在酸性食品、飲料中的應用受到限制，紅曲黃色素的耐光性差。在蘋果汁、蘋果酒加工過程中，蘋果中的根皮苷在多酚氧化酶的催化下緩慢氧化成為對光、熱穩(wěn)定的亮黃色，構(gòu)成了蘋果汁的主要顏色。據(jù)此，國外已有從氧化蘋果汁中分離黃色素的報道，但由于蘋果汁中黃色素含量太低、分離工藝復雜而無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。研究開發(fā)低成本、高效的蘋果黃色素的生產(chǎn)工藝技術(shù)成為蘋果黃色素產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵。
[0003]蘋果黃色素的形成過程本質(zhì)上就是蘋果中根皮苷酶促轉(zhuǎn)化為氧化產(chǎn)物的過程。因此，以提純的蘋果根皮苷為原料，采用體外轉(zhuǎn)化法模擬蘋果汁中黃色素形成過程制備蘋果黃色素可以使轉(zhuǎn)化過程得到較好的控制并可對黃色素產(chǎn)生一定的富集作用，因此可能成為蘋果黃色素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方式。但由于根皮苷相對比較穩(wěn)定，其酶促氧化反應進行較慢，以其為底物制備黃色素需要時間較長。如何提高根皮苷的轉(zhuǎn)化速率和效率是根皮苷酶促轉(zhuǎn)化制備黃色素的關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種低成本、高效的根皮苷酶促轉(zhuǎn)化體系與方法，獲得一種安全、穩(wěn)定的食用黃色素。
[0005]為達上述目的，本發(fā)明采用雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，具體包括以下步驟:
[0006]I)將根皮苷、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶共同溶于pH為5.5?7.0的磷酸鹽緩沖液中，通入氧氣并進行攪拌，于25?35°C條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，反應結(jié)束后加熱至80°C滅酶5min，得到轉(zhuǎn)化液。
[0007]2)將步驟I)所得轉(zhuǎn)化液中加入1:1的乙酸乙酯進行萃取，除去未反應完全的根皮苷，下層水相經(jīng)真空濃縮后進行干燥，得到黃色素粗品。
[0008]3)將步驟2)所得黃色素粗品溶解于甲醇中，離心除去不溶性的緩沖鹽，上清液減壓蒸發(fā)除去甲醇，得到精制黃色素。
[0009]步驟I)中所述的β-葡萄糖苷酶的添加量為2000?20000U/g根皮苷，多酚氧化酶的添加量為5000?50000U/g根皮苷，反應液中溶氧量飽和度為20?40 %，酶促反應時間為2?24h0
[0010]步驟2)中所述的萃取過程需重復3?4次，濃縮溫度為40?60°C。
[0011]步驟3)中所述的除鹽過程需重復進行2?4次，以徹底去除其中的緩沖鹽。
[0012]利用本發(fā)明所提供的方法制備得到的黃色素為水溶性黃色素，純度高，在PH2?5條件下呈亮麗的黃色，并且具有抗氧化等生物活性，是一種功能性黃色素。由于在根皮苷酶促轉(zhuǎn)化體系中同時加入葡萄糖苷酶和多酚氧化酶，使部分根皮苷先行被葡萄糖苷酶分解為根皮素，提高其反應活性，然后再在多酚氧化酶作用下進行酶促氧化，反應的速率和效率得到大幅提高。同等條件下(相同溫度、相同底物濃度、相同酶用量)，達到相同轉(zhuǎn)化率的時間可較單獨采用多酚氧化酶酶促轉(zhuǎn)化節(jié)約50%以上。利用本發(fā)明制備蘋果黃色素，既有效提高了根皮苷的酶促轉(zhuǎn)化速率，又避免了直接采用根皮素作為氧化底物原料成本過高的問題，具有明顯的社會效益和經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。
[0014]實施例1
[0015]—種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，包括以下步驟:
[0016]I)將5g根皮苷溶于5L pH為6.5的0.0lM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，同時加入25000Ui3-葡萄糖苷酶、100000U蘑菇多酚氧化酶，通入氧氣并進行攪拌，使反應液中溶氧量飽和度達到30%左右，于30°C條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，4h后加熱至80°C滅酶5min，得到轉(zhuǎn)化液。
[0017]2)將步驟I)所得轉(zhuǎn)化液中加入1:1的乙酸乙酯進行萃取，反復操作4次，除去未反應完全的根皮苷，下層水相在50?55°C條件下減壓濃縮后冷凍干燥，得到黃色素粗品。
[0018]3)將步驟2)所得黃色素粗品溶解于甲醇中，離心除去不溶性的緩沖鹽，上清液在40°C條件下減壓蒸發(fā)除去甲醇，反復操作3次，得到精制黃色素6.6g。
[0019]實施例2
[0020]—種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，包括以下步驟:
[0021]I)將3g根皮苷溶于3L pH為6.0的0.0lM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，同時加入?οοοουβ-葡萄糖苷酶、30000U蘑菇多酚氧化酶，通入氧氣并進行攪拌，使反應液中溶氧量飽和度達到35 %左右，于28 °C條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，Sh后加熱至80°C滅酶5min，得到轉(zhuǎn)化液。
[0022]2)將步驟I)所得轉(zhuǎn)化液中加入1:1的乙酸乙酯進行萃取，反復操作4次，除去未反應完全的根皮苷，下層水相在45?50°C條件下減壓濃縮后冷凍干燥，得到黃色素粗品。
[0023]3)將步驟2)所得黃色素粗品溶解于甲醇中，離心除去不溶性的緩沖鹽，上清液在40°C條件下減壓蒸發(fā)除去甲醇，反復操作4次，得到精制黃色素3.4g。
【主權(quán)項】
1.一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將根皮苷、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶共同溶于pH為5.5?7.0的磷酸鹽緩沖液中，通入氧氣并進行攪拌，于25?35°C條件下進行酶促轉(zhuǎn)化反應，反應結(jié)束后加熱至80°C滅酶5min，得到轉(zhuǎn)化液； 2)將步驟I)得到的轉(zhuǎn)化液中加入1:1的乙酸乙酯進行萃取，除去未反應完全的根皮苷，下層水相經(jīng)真空濃縮后進行干燥，得到黃色素粗品； 3)將步驟2)得到的黃色素粗品溶解于甲醇中，離心除去不溶性的緩沖鹽，上清液減壓蒸發(fā)除去甲醇，得到精制黃色素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，其特征在于:步驟1)中所述的葡萄糖苷酶的添加量為2000?20000U/g根皮苷，多酚氧化酶的添加量為5000?50000U/g根皮苷，反應液中溶氧量飽和度為20?40 %，酶促反應時間為2?24h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，其特征在于:步驟2)中所述的萃取過程需重復3?4次，濃縮溫度為40?60°C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，其特征在于:步驟3)中所述的除鹽過程需重復進行2?4次，以徹底去除其中的緩沖鹽。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶法轉(zhuǎn)化根皮苷制備黃色素的方法，其特征在于:步驟3)中所得到的黃色素為水溶性黃色素，在pH2?5條件下呈亮麗的黃色，并且具有抗氧化等生物活性，是一種功能性黃色素。
【文檔編號】C12P7/26GK105838745SQ201610265531
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月17日
【發(fā)明人】焦中高, 劉杰超, 張春嶺, 王雪暉, 陳大磊, 楊文博
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所