一種攜帶ctag1b/ny-eso-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體及構建方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種攜帶CTAG1B/NY?ESO?1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體，其構建方法，包括以下步驟：（1）體外克隆CTAG1B/NY?ESO?1基因；（2）將pscAAV?MCS載體和克隆基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進行雙酶切，然后DNA連接得攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV?CTAG1B；（3）測序鑒定。本發(fā)明所用腫瘤抗原基因有表達范圍廣、特異性高的特點；自補型重組腺相關病毒scAAV6有安全性高、侵染能力強的特點；基于pscAAV?CTAG1B重組載體的細胞免疫治療能有效緩解CTAG1B/NY?ESO?1抗原陽性腫瘤患者病情，且副作用小。
【專利說明】
一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相 關病毒載體及構建方法和應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于重組腺相關病毒載體技術領域，具體涉及一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1 腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體及構建方法和該載體在抗CTAG1B/NY-ES0-1抗 原陽性腫瘤細胞免疫療法中的應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是全球范圍內(nèi)危害人們身體健康和生命的重大疾病之一。腫瘤治療方式主要 包括手術、放療、化療、靶向治療以及免疫治療等，這些治療方式能一定程度抑制腫瘤的生 長，但是通常也伴隨著一定的副作用。對于靶向治療和免疫治療來說，靶點（即腫瘤抗原）的 選取尤為重要，關乎到療效的高低和副作用的大小程度。CTAG1B/NY-ES0-1是一種癌/睪丸 抗原（cancer-testis antigen)，其基因位于X染色體上Xq28區(qū)域。但CTAG1B/NY-ES0-1僅在 睪丸組織中表達，而在其他成體組織中不表達。在腫瘤細胞中，由于表觀遺傳因素的改變而 導致CTAG1B/NY-ES0-1的異常表達。NY-ES0-1是在1990s年代末由康奈爾大學（位于紐約， NewYork)的研究人員在食管癌(esophageal cancer)中發(fā)現(xiàn)的，并因此而命名。除了在食管 癌中表達外，CTAG1B/NY-ES0-1在黑色素瘤、滑膜肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌 以及膀胱癌等多種腫瘤中均有表達。CTAG1B/NY-ES0-1的表達量還與腫瘤惡性程度相關，并 且可作為腫瘤治療預后的指標之一。
[0003] CTAG1B/NY-ES0-1是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點，它廣泛并且特異地表達于多 種腫瘤組織中，同時它還具有良好的免疫原性。Jager等在黑色素瘤腫瘤患者體內(nèi)檢測到了 NY-ES0-1的特異性抗體，并從外周血中篩選到了能夠特異識別NY-ES0-1:157-165，157- 167和155-163表位的CD8+T細胞株。一項臨床試驗表明使用NY-ES0-1:157-165,157-167和 155-163肽段作為疫苗能夠誘導抗原特異性的CD8+T細胞，并抑制腫瘤的生長和轉移。然而 針對NY-ES0-1特征性抗原表位的疫苗具有一定的局限性，治療效果也十分有限。Hunder等 發(fā)明了一種體外分離和擴增特異性靶向NY-ES0-1的自體CD4+T細胞的技術，并成功用于治 療了一例復發(fā)性、轉移性的黑色素瘤腫瘤患者。該技術利用NY-ES0-1:157-170表位制成的 肽段激活DC細胞，然后DC細胞與T細胞共培養(yǎng)誘導抗原特異性的T細胞。該方法的缺點在于： 1、抗原肽段的半衰期有限，使用抗原段激活DC細胞需要反復添加;2、抗原肽段誘導的活化T 細胞多樣性有局限，與體內(nèi)天然存在的NY-ES0-1特異性的T細胞有差異。Rosenberg等研發(fā) 了靶向NY-ES0-1的TCR-T細胞免疫治療方法，將特異識別NY-ES0-1:157-165的TCR基因克隆 至慢病毒或逆轉錄病毒載體上，然后制備病毒感染T細胞，通過基因工程的手段改造 T細胞 使其表達特異性的TCR受體，該方法在臨床試驗中也取得了一定的進展。但是TCR-T細胞免 疫治療具有MHC限制性的特點，即腫瘤患者必須是NY-ES0-1和HLA-A*0201雙陽性才能使用 該治療方式。CTAG1B/NY-ES0-1是一個很好的靶點，但是上述的靶向該抗原的免疫治療方法 都有值得改進的地方。
[0004]重組腺相關病毒(rAAV)源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主 細胞范圍廣(分裂和非分裂細胞）、免疫源性低、在體內(nèi)表達外源基因時間長等特點，被視為 最有前途的基因轉移載體之一。經(jīng)過多年的研究，重組腺相關病毒的生物學特性己被深入 了解，尤其是其在各種細胞、組織和體內(nèi)實驗中的應用效果方面已經(jīng)積累了許多資料。按照 中和血清類型的不同，重組腺相關病毒可分為11種血清型，不同血清型的重組腺相關病毒 表現(xiàn)出不同的組織侵染能力。例如AAV2具有廣譜的組織嗜性，如肝、肺、肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)等， 但侵染效率一般;而AAV7更傾向于在骨骼肌中的侵染，而不能侵染其他組織。對于DC細胞的 侵染而言，AAV2、AAV6的使用均有報道，但AAV6的侵染效率更勝一籌。重組腺相關病毒是一 種單鏈DNA病毒，在宿主細胞內(nèi)，其單鏈DNA需要首先轉換為雙鏈DNA才能進行表達，因而限 制了其表達效率。自補型重組腺相關病毒（self-complementary，scAAV)則克服了這一障 礙，通過在載體右端的IRT(Inverted Terminal Repeats)區(qū)域引入特定的缺失和突變，從 而在病毒包裝過程中可以形成雙鏈的基因組。
[0005] 但將CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因用于構建自補型重組腺相關病毒載體并將其 用于抗CTAG1B/NY-ES0-1陽性腫瘤細胞免疫治療中未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗 原基因的自補型重組腺相關病毒載體及構建方法和應用。本發(fā)明采用了 scAAV6-DC-CTL細 胞免疫治療技術，將腫瘤抗原基因 CTAG1B/NY-ES0-1輸入到樹突狀細胞(DC)中，通過DC細胞 和T細胞共培養(yǎng)誘導出抗原特異性的殺傷性T細胞(CTL)，該方法安全性高，副作用小，靶向 性強，能有效殺傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤細胞。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：
[0008] 一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體的構建方 法，包括以下步驟：
[0009] (1)體外克隆 CTAG1B/NY-ES0-1 基因；
[0010] (2)將pscAAV-MCS載體和CTAG1B/NY-ES0-1基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進行雙酶切，然后進行DNA連接反應，得到攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV-CTAGIB; [0011] (3)測序鑒定。
[0012] 進一步地，步驟（1)中克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的方法為:從H1299肺癌細胞株中 提取總RNA，逆轉錄得到總c D N A，然后以c D N A為模板，在正義鏈引物5 ' - ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3 '（ SEQID-2)的引導下進行PCR反應，得到所述的CTAG1B/ NY-ES0-1基因。
[0013] 進一步地，上述所說的PCR擴增反應體系為：5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)10y L、dNTP Mixture(2.5mM each)4yL、Primer F lyL、Primer R lyL、cDNA 2yL、Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5yL、dH2〇 31.5yL〇
[0014] 進一步地，上述所說的PCR擴增反應條件為：98°C預變性5分鐘，接著98°C變性20 秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，共30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘。
[0015] 進一步地，步驟⑵中酶切反應體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)粒/CTAG1B/NY-ES0-1基 因 ，lyL EcoR I，lyL XbaI，5yL 10XNEB Buffer以及適量去離子水，總體積為50yL;反應條 件為:37 °C，1.5小時。
[0016] 上述任一項構建方法構建出的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組 腺相關病毒載體。
[0017] 上述所述的一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載 體在CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細胞免疫療法方面的應用。
[0018] 進一步地，攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體與 突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT和pHelper按摩爾比為1:1:1，共同用于CTAG1B/NY-ES0-1抗 原陽性腫瘤的細胞免疫療法。
[0019] 進一步地，所述的突變型輔助載體PAAV6-RC6MUT的構建方法為：將野生型載體 PAAV6-RC6上的四個位點T251，T492，S563和S663分步突變?yōu)槔i氨酸，得突變性輔助載體 pAAV6-RC6MUT即pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V;其中反應體系為lOxReaction buffer(Mg2+Plus)5yL,lOng/yL Sample plasmid 2yL,10pmol/yL primer F lyL,lOpmol/μ L primer R lyL,dNTP mixture(2.5mM each)，lyL Muta-direct Enzyme,38yL dH2〇； 反應條件為:95 °C預變性30秒，95 °C變性30秒，55 °C退火60秒，72°C延伸8分鐘，共15個循環(huán)， 最后4°C保存5分鐘；點突變反應所用引物如下：
[0020] T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
[0021 ] T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
[0022] T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
[0023] T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
[0024] S563V-F:TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7);
[0025] S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
[0026] S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
[0027] S663V-R:GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG (SEQID-10)。
[0028] 將攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體用于抗腫瘤 細胞免疫治療，治療過程為:將重組載體pscAAV-CTAGIB、突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT和 pHelper共轉染到293AAV細胞中制備自補型重組腺相關病毒（scAAV6)，再使用scAAV6侵染 單核樹突狀細胞(DC細胞），感染復數(shù)Μ0Ι為20，OOOvgs/ce 11，48h后重復侵染一次，然后將DC 細胞與T細胞按數(shù)量比為1:10共培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生特異性的抗腫瘤活性T細胞(CTL)，一周后再 用scAAV6侵染過的DC細胞去刺激T細胞，T細胞經(jīng)大量擴增，并按照l-3X109cells/m2對 CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤患者進行回輸治療。
[0029]本發(fā)明提供的一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒 載體及構建方法和應用，具有以下有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明的腫瘤抗原基因 CTAG1B/NY-ES0-1具有表達范圍廣、特異性高的特點， 是很好的免疫治療靶點。
[0031] (2)本發(fā)明的自補型重組腺相關病毒SCAAV6具有安全性高、侵染能力強的特點，尤 其對于DC細胞具有很好的嗜性。
[0032] (3)本發(fā)明的靶向CTAG1B/NY-ES0-1的scAAV6-DC-CTL細胞免疫治療方法能有效殺 傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的腫瘤細胞，能有效緩解CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤患者 的病情，且副作用很小。
【附圖說明】
[0033] 圖1為PCR克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的瓊脂糖電泳圖。
[0034] 圖2為pscAAV-MCS質(zhì)粒的結構示意圖。
[0035] 圖3為重組載體pscAAV-CTAGIB的PCR鑒定結果圖。
[0036]圖4為重組載體pscAAV-CTAGIB的雙酶切鑒定結果圖；其中泳道1為載體pscAAV- MCS酶切結果圖，泳道2為重組載體pscAAV-CTAGIB的酶切結果圖。
[0037]圖5為定量PCR測定scAAV6病毒基因組滴度的實驗結果圖。
[0038]圖6為scAAV6-DC-CTL細胞免疫治療的流程圖。
[0039]圖7為scAAV6侵染樹突狀細胞的效率分析圖，其中A為無病毒陰性對照，B為野生型 scAAV6，C 為突變型 scAAV6。
[0040]圖8為樹突狀細胞表面分子⑶80、⑶86流式分析結果圖。
[00411圖9為流式細胞儀測定T細胞活化標志物0X40、4-1BB的分析結果圖。
[0042]圖10為CTL細胞體外殺傷H1299腫瘤細胞的分析結果圖。
【具體實施方式】
[0043] 實施例1 pscAAV-CTAGIB重組載體的構建及鑒定
[0044] -、材料及來源
[0045] l、pscAAV-MCS質(zhì)粒:從美國Cell Biolabs公司購買。
[0046] 2、H1299細胞:從中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫購買。
[0047] 3、基因擴增引物:根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CTAG 1B/NY-E SO-1基因的mRNA序列設計(NM_ 001327.2)。
[0048] 二、攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體的構建
[0049] 本實施例所提供的構建方法，是使用限制性內(nèi)切酶將載體的多克隆位點切開，再 運用DNA連接技術將CTAG1B/NY-ES0-1基因與載體進行連接反應，得到pscAAV-CTAGIB重組 載體，具體過程包括以下步驟：
[0050] (1)獲取總cDNA，具體方法為:采用Trizol試劑(Life technology公司）提取H1299 細胞的總RNA，首先離心收集細胞（1 X 107cells)，加入lmLTrizol進行提取，RNA沉淀用50yL DEPC-H20溶解，并測定其濃度；
[0051 ] 以lyg RNA為模板，進行逆轉錄反應，逆轉錄反應體系（20μυ為：lyL 01igo(dT)i8， 2yL dNTP Mix(10mM each),lyL Revert Aid M-MuL V,lyL RNase Inhibitor,4yL 5X Reaction Buffer，所用試劑盒為Thermo Scientifi公司購買，反應條件為42°C，1小時，得 到cDNA，-20°C保存待用；
[0052] (2)PCR克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因，具體方法為：以上述cDNA為模板，在引物1 (SEQID-1)5 '-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3 ' 和弓丨物2(SEQID-2)5 '- ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3'的引導下進行RCR擴增反應，得到CTAG1B/NY-ES0-1 基 因；
[0053] PCR擴增反應體系為：10yL 5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)，4yL dNTP Mixture (2.5mM each),lyL Primer F,lyL Primer R,2yL cDNA,0.5yL Prime STAR HS DNA Polymerase，31·5uL dH2〇;
[0054] PCR擴增條件為:98°C預變性5分鐘，98°C變性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒， 共30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘，反應結束后，對PCR產(chǎn)物進行1.5 %瓊脂 糖凝膠電泳，在680bp的位置出現(xiàn)了一條特異性條帶(如圖1所示），將該目的條帶進行回收 純化處理；
[0055] (3)構建pscAAV-CTAGIB重組載體:分別對pscAAV-MCS質(zhì)粒(如圖2所示)和CTAG1B/ NY-ES0-1基因進行限制性內(nèi)切酶反應，純化后進行酶連反應，所用限制性內(nèi)切酶為EcoR I ?HF和Xbal (購自NEB公司），酶切反應體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)?；駽TAG1B/NY-ES0-1基因， lyL EcoR I?HF，lyL XbaI，5yL 10XNEB Buffer以及適量去離子水，總體積為50yL;反應條 件為：37°C，1.5小時，反應結束后使用Axygen? Axyprep? PCR Clean-up Kit試劑盒進行 純化處理，并測定濃度，最后使用T4 DNA連接酶進行連接反應，反應體系為：lyL T4DNA Ligase (購自 TaKaRa公司），2yL 10 X ReactionBuffer，0 · 3pmol CTAG1B/NY-ES0-1基因片 段，0.03pmol pscAAV-MCS質(zhì)粒片段，以及適量的去離子水，總體積為20yL;反應條件為16 。。，過夜；
[0056] (4)轉化及涂板:將上述連接產(chǎn)物5yL導入至100yL感受態(tài)細菌Τ0Ρ10(天根生物科 技公司）中，冰浴30分鐘，再42°C熱激90秒，然后冰上放置2分鐘，最后加入400yL LB培養(yǎng)基， 置于搖床中復蘇45分鐘，轉速為150r/min;最后取100yL菌液涂在含100yg/mL氨芐青霉素 (Amp)的LB平板上，37 °C細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；
[0057] (5)質(zhì)粒提?。禾羧慰寺∮?mL LB/Amp培養(yǎng)基，37°C搖床中培養(yǎng)16小時（轉速 200r/min)，然后收集細菌，使用E.Z.N.A.?End〇-Free Plasmid Mini KitI試劑盒提取質(zhì) 粒。
[0058] 三、重組載體的鑒定
[0059] 1、PCR鑒定：以提取的質(zhì)粒為模板，使用上述提到的引物1 ( SEQID-1)和引物2 (SEQID-2)進行PCR反應，產(chǎn)物中出現(xiàn)CTAG1B/NY-ES0-1特異性片段則表明重組質(zhì)粒構建成 功。PCR擴增體系和反應條件與上述提及的一致，反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%)， 觀察在680bp處是否出現(xiàn)一條特異性條帶(如圖3所示）。
[0060]由圖3可知，在680bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，說明重組載體構建成功。
[0061 ] 2、酶切鑒定：將提取的質(zhì)粒進行雙酶切反應，所用限制性內(nèi)切酶為EcoR 1@@和 Xbal，反應體系和條件如上所述。
[0062]結果如圖4所示，重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)了兩條條帶，一個為質(zhì)粒(約3.7kb)，另一個 為CTAG1B/NY-ES0-1 片段(680bp)。
[0063] 3、DNA測序鑒定:將提取的質(zhì)粒送樣測序，測序引物為：
[0064] CMV-F:5，-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3，（SEQID-11);
[0065] Reverse:5，-TAAAGCATCGAGATCGCAGG-3，（SEQID-12)〇
[0066] 使用NCBI Blast進行序列比對，測序得到的序列與CTAG1B基因序列100%吻合，進 一步證明構建的pscAAV-CTAGIB重組載體是正確的。
[0067] 實施例2自補型重組腺相關病毒的制備
[0068] 一、材料及來源
[0069] 1、實施例1中構建的pscAAV-CTAGIB重組載體。
[0070] 2、輔助載體 pAAV6-RC6MUT 和 pHe lper:購自 Ce 1 IB i o labs 公司。
[0071 ] 3、293AAV細胞:購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。
[0072] 4、Po lye thy lenimine (PEI):購自Poly sciences公司（Cat#23966)。
[0073] 5、0PTI_MEM培養(yǎng)基：購自Life technology公司。
[0074] 6、0ptiPrep? Density Gradient Medium(鵬克沙醇）和Benzonase:購自Sigma公 司。
[0075] 二、自補型重組腺相關病毒(scAAV6)的制備及鑒定
[0076] 制備方法是將重組載體pscAAV-CTAGIB和突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT、pHelper 共轉染到293AAV細胞中，收集病毒顆粒并純化鑒定，具體過程包括以下步驟：
[0077] (1)突變型輔助載體 pAAV6-RC6MUTS 卩 pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V的構 建，其具體方法是:將野生型載體PAAV6-RC6上的四個位點T251，T492，S563和S663分步突變 為結?氨酸，反應體系為5yL lOxReaction buffer，2yL Sample plasmid(10ng/yL，total 20ng),lyL primer(F)(10pmol/yL),lyL primer(R)(10pmol/yL),2yL dNTP mixture(each 2.5mM)，lyL Muta-direct Enzyme，38yL dH20;反應條件為：95°C預變性30秒，95°C變性30 秒，55 °C退火60秒，72 °C延伸8分鐘，共15個循環(huán);最后4°C保存5分鐘；其中點突變反應所用 引物如下：
[0078] T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
[0079] T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
[0080] T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
[0081 ] T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
[0082] S563V-F:TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7);
[0083] S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
[0084] S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
[0085] S663V-R:GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG(SEQID-10)。
[0086] (2)細胞轉染:使用聚醚酰亞胺(PEI)轉染法將重組載體pscAAV-CTAGIB、突變型輔 助載體pAAV6-RC6MUT和pHelper共轉染到293AAV細胞中；轉染前24小時，293AAV細胞傳代至 15cm dish中（密度3 X 105cells/mL)，培養(yǎng)基（DMEM高糖，購自Hyclone)體積為22 · 5mL(不 含抗生素）；轉染前3-4小時換液(20mL);轉染體系包括:在1.7mL EP管中加入500yL 0ΡΤΙ- MEM(37°C預熱），然后按摩爾比1:1:1的比例加入如下質(zhì)粒，13yg pHelper，8yg突變型輔助 載體pAAV-RC6MUT，5yg重組載體pscAAV-CTAGIB，然后再加入 110yL PEI(lmg/mL)，PEI與DNA 的比例為4:1 (v: w);將DNA/PEI混合溶液簡單地漩渦震蕩混勻，然后室溫放置15分鐘后將 DNA/PEI混合溶液逐滴加入培養(yǎng)皿中，并輕輕的旋轉培養(yǎng)皿以便轉染混合物能均勻的分布 到培養(yǎng)基中（DMEM高糖，購自Hyclone);
[0087] (3)病毒收集:將轉染好的細胞置于C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)72小時，然后收集細胞， 在乙醇+干冰和37 °C水浴中反復凍融三次，在細胞裂解液中加入核酸酶Benzonase (終濃度 50U/mL)，37°C孵育30分鐘;3700g離心20分鐘(4°C)收集上清，即為病毒粗提液；
[0088] (4)病毒的純化:使用不連續(xù)的碘克沙醇密度梯度離心法(iodixanol gradients) 純化病毒粗提液;402，000g離心1小時(4°C )，收集病毒濃縮層液體;使用肝素親和層析法進 一步純化scAAV6;
[0089] (5)病毒的鑒定:通過定量PCR的方法鑒定SCAAV6的顆粒數(shù)(viral genomes，vgs)。 以pscAAV-CTAGIB重組質(zhì)粒作為標準品，測定質(zhì)粒濃度并計算拷貝數(shù):拷貝數(shù)(Copies/yL) =質(zhì)粒濃度(ng/yL)X10-9\6.02\ 1023(阿伏伽德羅常數(shù))/質(zhì)粒分子量。以107、106、10 5和 1〇4拷貝數(shù)質(zhì)粒作標準曲線計算SCAAV6的基因組滴度。所用引物為：
[0090] 正義鏈引物：5'-GAGTGGCCAACTCCATCACT-3'（SEQID-13) ;
[0091] 反義鏈引物：5'-ACTCCCATTGACGTCAATGG-3'（SEQID-14)。
[0092] 如圖5所示，標準曲線能很好地擬合拷貝數(shù)和擴增循環(huán)數(shù)(CT)，而本發(fā)明的scAAV6 樣品的Ct值為17.9，由此可計算出其拷貝數(shù)為7.6\101()(樣品稀倍數(shù)為106)。
[0093] 實施例3 pscAAV-CTAGIB重組載體導入樹突狀細胞的腫瘤殺傷實驗
[0094] 一、材料及來源
[0095] 1、自補型重組腺相關病毒(scAAV6):按實施例2進行制備。
[0096] 2、AIM-V細胞培養(yǎng)基:購自Lonza公司。
[0097] 3、細胞因子:GM-CSF、IL-4、IL-2 和 TNFa，均購自 Peprotech 公司。
[0098] 4、CD3抗體(0KT3):購自Life Technology公司。
[0099] 5丄080、0)86、(《40和4-188流式檢測抗體：購自68丨〇8(^61?^公司。
[0100] 二、scAAV6-CTAG1B侵染樹突狀細胞
[0101] 如圖6所示，本實施例pscAAV-CTAGIB重組載體導入樹突狀細胞的腫瘤殺傷實驗的 整個過程包括以下步驟：
[0102] 1、取腫瘤患者外周血50-150mL，使用淋巴細胞分離液獲取外周血單個核細胞 (PBMC)，使用Am-V培養(yǎng)基(含10%FBS)重懸，置于37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時；
[0103] 2、將懸浮細胞轉移至新的培養(yǎng)皿，PBS洗滌三次，貼壁細胞即為單核細胞 (monocyte);懸浮細胞即淋巴細胞，使用含IL-2(20IU/mL)和0KT3(100ng/mL)的A頂-V培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0104] 3、在單核細胞中加入制備好的自補型重組腺相關病毒(感染復數(shù)M0I:20,000vgs/ cell)，同時加入 GM-CSF(50ng/mL)和 IL-4(100ng/mL)，37°C 培養(yǎng) 4 小時；
[0105] 4、去除步驟3 中舊的培養(yǎng)基，補充含 GM-CSF(50ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和 TNFa (50ng/mL)的A頂-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5天，即可收獲成熟的樹突狀細胞。
[0106] 使用SCAAV6-GFP侵染樹突狀細胞進行侵染效率分析，結果如圖7所示，熒光顯微鏡 拍照顯示突變型scAAV6的侵染效率為70%，而野生型scAAV6的侵染效率為30%，野生型 scAAV6具有更高的轉染效率。
[0107] 5、將成熟的樹突狀細胞與T淋巴細胞共培養(yǎng)(DC細胞與T細胞的數(shù)量比為1:10)，培 養(yǎng)基為含IL_2(20IU/mL)的A頂-V;7天后再用scAAV6侵染過的DC細胞去刺激T淋巴細胞；
[0108] 6、樹突狀細胞表面分子CD80、CD86的檢測，使用流式細胞儀進行定量分析，以確定 樹突狀細胞的功能。
[0109] 如圖8所示，樹突狀細胞表面⑶80、CD86的表達均顯著升高，陽性率分別為76.2% 和79.3% 〇
[0110] 三、細胞毒性τ淋巴細胞(CTL)體外殺傷實驗
[0111] 1、成熟的樹突狀細胞與τ淋巴細胞共培養(yǎng)(細胞數(shù)量比1:10)結束后，使用流式細 胞儀分析細胞表面0X40、4-1BB分子的表達性。
[0112] 如圖9所示，流式測定的結果為表面分子(^40、4-188的表達陽性率分別59.2%、 49.1%，這表明樹突狀細胞與T細胞共培養(yǎng)后，可刺激T細胞的激活。
[0113] 2、使用51Cr(鉻-51)釋放實驗方法檢測CTL細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)一定時間后腫瘤 細胞的死亡率。具體實驗步驟為：
[0114] A、標記靶細胞:取培養(yǎng)對數(shù)生長期的靶細胞(H1299)4X106/mL，加入100-200uCi51Cr，37°C水浴2小時，每隔15min振搖一次;然后用含5%FBS的RPMI-1640(購自Hyclone)培 養(yǎng)液洗滌三次，除去游離的51Cr;
[0115] B、CTL與腫瘤細胞共培養(yǎng)：標記后的靶細胞按照lX103/well的密度鋪在96孔板 中，然后加入CTL細胞(CTL細胞與腫瘤細胞數(shù)量比為10:1或20:1)，37°C5 %C02培養(yǎng)，共培養(yǎng) 時間為4小時(數(shù)量比為10:1時)或6小時(數(shù)量比為20:1時）；
[0116] C、測定:每孔吸出50yL培養(yǎng)上清置于檢測管中，在γ-計數(shù)儀上測定上清液的每分 鐘放射性活性(cpm值）；殺傷活性=(實驗孔cpm平均值-自然釋放孔cpm平均值)/(最大釋放 孔cpm平均值-自然釋放孔cpm平均值）；
[0117] 如圖10所示，使用scAAV6-DC-CTL可有效殺傷CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性的H1299 細胞，CTL和腫瘤細胞數(shù)量比為10:1和20:1時對應的殺傷率分別為63.7%和81.1 %。
【主權項】
1. 一種攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病毒載體的構建方 法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 體外克隆 CTAG1B/NY-ES0-1基因； (2) 將pscAAV-MCS載體和CTAG1B/NY-ES0-1基因分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進 行雙酶切，然后進行DNA連接反應，得到攜帶CTAG1B基因的重組載體pscAAV-CTAGIB; (3) 測序鑒定。2. 根據(jù)權利要求1所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病 毒載體的構建方法，其特征在于，步驟（1)中克隆CTAG1B/NY-ES0-1基因的方法為：從H1299 肺癌細胞株中提取總RNA，逆轉錄得到總cDNA，然后以cDNA為模板，在正義鏈引物5'-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3 ' 和反義鏈引物5 ' -ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3 ' 的 引導下進行PCR擴增反應，得到所述的CTAG1B/NY-ES0-1基因。3. 根據(jù)權利要求2所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病 毒載體的構建方法，其特征在于，PCR擴增反應體系為:含Mg 2+的5xPrime STAR Buffer 10μ L、濃度為2.5mM的dNTP Mixture 4yL、Primer F lyL、Primer R lyL、cDNA 2yL、Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5yL、dH2〇31.5yL〇4. 根據(jù)權利要求2所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病 毒載體的構建方法，其特征在于，PCR擴增反應條件為:98 °C預變性5分鐘，98 °C變性20秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存5分鐘。5. 根據(jù)權利要求1所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病 毒載體的構建方法，其特征在于，步驟（2)中酶切反應體系為：lyg pscAAV-MCS質(zhì)粒/ CTAG1B/NY-ES0-1 基因 ，lyL EcoR I，lyL XbaI，5yL10X NEB Buffer以及適量去離子水，總 體積為50yL;反應條件為:37°C，1.5小時。6. 根據(jù)權利要求1-5任一項所述的構建方法構建出的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原 基因的自補型重組腺相關病毒載體。7. 根據(jù)權利要求6所述的攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自補型重組腺相關病 毒載體在CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細胞免疫療法方面的應用。8. 根據(jù)權利要求7所述的用途，其特征在于，攜帶CTAG1B/NY-ES0-1腫瘤抗原基因的自 補型重組腺相關病毒載體與突變型輔助載體pAAV6-RC6 MUT和pHelper按摩爾比為1:1:1，共 同用于CTAG1B/NY-ES0-1抗原陽性腫瘤的細胞免疫療法。9. 根據(jù)權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的突變型輔助載體pAAV6-RC6MUT的構 建方法為:將野生型載體PAAV6-RC6上的四個位點T251，T492，S563和S663分步突變?yōu)槔i氨 酸，得到突變性輔助載體pAAV6-RC6 MUT;其中反應體系為含Mg2+的lOxReaction buffer 5yL， lOng/yL Sample plasmid 2yL, 10pmol/yL primer F lyL, 10pmol/yL primer R lyL，濃度 為2.5mM的dNTP mixture 2yL，lyL Muta-direct Enzyme，38yL dH2〇;反應條件為：95°C預 變性30秒，95°C變性30秒，55°C退火60秒，72°C延伸8分鐘，共15個循環(huán);最后4°C保存5分鐘； 點突變反應所用引物如下： T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC； T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG； T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC； T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG； S563V-F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG； S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA； S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC； S663V-R：GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCT 〇
【文檔編號】C12N15/66GK105838738SQ201610179322
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】申重陽, 陳勇軍, 王仲
【申請人】成都康景生物科技有限公司