一種人胰腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種新的適用于活體成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用Lonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將攜帶有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC?1細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株P(guān)ANC?1?LUC，進(jìn)一步構(gòu)建PANC?1?LUC裸鼠皮下移植瘤。體內(nèi)外生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明所構(gòu)建的PANC?1?LUC細(xì)胞株能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地表達(dá)熒光素酶，由此建立的胰腺癌裸鼠模型，相比較慢病毒載體介導(dǎo)的生物發(fā)光胰腺癌裸鼠模型，具有成瘤潛伏期短、成瘤率高、腫瘤生長(zhǎng)符合PANC?1移植瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，更適合活體成像研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種人胰腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的適用于活體成像研究的人胰腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是一種全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。早期確 診率低和術(shù)后轉(zhuǎn)移是胰腺癌死亡率高的主要原因，臨床上很難得到新鮮的、不同時(shí)期的胰 腺癌病理組織標(biāo)本，大大制約了對(duì)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的研究。近年來(lái)，活體成像技術(shù)作 為一種高效、靈敏的新興檢測(cè)手段被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，尤其是生物發(fā)光成像技術(shù)，具有 信號(hào)干擾小，成像本底較低，信噪比高且組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于動(dòng)物成像。因此， 構(gòu)建生物發(fā)光標(biāo)記的胰腺癌細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上建立適用于活體成像研究的胰腺癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 模型，對(duì)深入探討胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的治療手段有著非常重要的意義。
[0003] 目前，生物發(fā)光標(biāo)記細(xì)胞最常用的方法是慢病毒載體介導(dǎo)的熒光素酶基因（luc) 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，慢病毒載體能通過(guò)感染細(xì)胞將外源基因有效整合到細(xì)胞染色體上，從而達(dá)到 持久性表達(dá)。然而，慢病毒作為"自殺"性病毒，雖然其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的 基因所取代，但是該病毒仍然具有可能的潛在生物學(xué)危險(xiǎn)，易激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)，病 毒核酸會(huì)隨機(jī)插入宿主細(xì)胞從而影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)。因此，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達(dá) 熒光素酶的腫瘤細(xì)胞系在構(gòu)建小鼠移植瘤模型的過(guò)程中，往往出現(xiàn)成瘤率低、潛伏期大大 延長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)不正常、裸鼠狀態(tài)差等問(wèn)題。
[0004] 本發(fā)明運(yùn)用Lonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將攜帶有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC-1 細(xì)胞，利用嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株P(guān)ANC-1-LUC，進(jìn)一步構(gòu)建PANC-1- LUC裸鼠皮下移植瘤，同樣方法接種慢病毒載體構(gòu)建的PANC-1-luc細(xì)胞作為對(duì)照，觀(guān)察成瘤 率、瘤體積，檢測(cè)生物發(fā)光強(qiáng)度。體內(nèi)外生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明所構(gòu)建的PANC-1- LUC細(xì)胞株能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地表達(dá)熒光素酶，由此建立的胰腺癌裸鼠模型，相比較慢病毒載 體介導(dǎo)的生物發(fā)光胰腺癌裸鼠模型，具有成瘤潛伏期短、成瘤率高、腫瘤生長(zhǎng)符合PANC-1移 植瘤的生長(zhǎng)特點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，更適合活體成像研究。為深入研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤微 環(huán)境以及腫瘤對(duì)藥物的反應(yīng)等打下了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是建立一種適合活體成像研究的胰腺癌動(dòng)物模型，該模型成瘤潛伏 期短，成瘤率高，腫瘤生長(zhǎng)符合胰腺癌特點(diǎn)，并且具有穩(wěn)定、高效、線(xiàn)性關(guān)系良好的生物發(fā)光 特點(diǎn)，克服了慢病毒載體構(gòu)建的生物發(fā)光標(biāo)記細(xì)胞成瘤率低、成瘤潛伏期長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)不正 常等缺點(diǎn)，特別適合胰腺癌活體成像研究。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種人胰腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于:包括如下步驟：
[0008] l)Lonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將攜帶有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC-1細(xì)胞；
[0009] 2)利用嘌呤霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株P(guān)ANC-1-LUC;
[0010] 3)構(gòu)建PANC-1 -LUC裸鼠皮下移植瘤，移植瘤的光強(qiáng)度與瘤體積有顯著的線(xiàn)性關(guān) 系。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟1)采用Nucleoi'ccior? SE Solution高效轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞，在 Lonza NucleofectorTM核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中將攜帶luc基因的GV258質(zhì)粒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌 PANC-1 細(xì)胞 48h。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟2)嘌呤霉素的濃度為7.5μg/ml。
[0013] 其中，所述嘌呤霉素篩選濃度的方法為:采用不同濃度的嘌呤霉素處理PANC-1細(xì) 胞，選擇4天細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為篩選濃度。
[0014] 更優(yōu)選的，所述步驟2)為:采用7.5μg/ml嘌呤霉素篩選表達(dá)熒光素酶的陽(yáng)性細(xì)胞 21天，撤去嘌呤霉素，陽(yáng)性克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，命名為 PANC-1-LUC〇
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟3)接種PANC-1-LUC細(xì)胞的細(xì)胞濃度為2.5 X 107個(gè)/ml。
[0016] 優(yōu)選的，以PANC-1-LUC細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5X107個(gè)/ ml，取200μ1皮下接種于裸鼠頸背部;一周后觀(guān)察成瘤率，并以游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移植瘤的 瘤結(jié)節(jié)最大直徑a和最小徑b，計(jì)算瘤體積(TV)，計(jì)算公式為:TV = 1/2 X a X b2，同時(shí)，每周一 次檢測(cè)腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度。
[0017] 另外本發(fā)明還提供了人胰腺癌裸鼠模型在活體成像中的應(yīng)用。
[0018] 下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：
[0019] 本發(fā)明采用NucIcofcciofSE Solution高效轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞，在Lonza Nucleofector?核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中將攜帶luc基因的GV258質(zhì)粒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胰腺癌PANC-1細(xì) 胞 48h。
[0020] 嘌呤霉素最佳篩選濃度的方法:采用不同濃度的嘌呤霉素（lμg/ml、2.5μg/ml、5μ g/ml、7.5μg/ml、10μg/ml)處理PANC-1細(xì)胞，選擇4天細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為篩選濃 度。
[0021] 本發(fā)明所述方法采用7.5μg/ml嘌呤霉素篩選表達(dá)熒光素酶的陽(yáng)性細(xì)胞21天，撤去 嘌呤霉素，陽(yáng)性克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，命名為PANC-1-LUC。 [0022] 本發(fā)明所述方法以PANC-1 -LUC細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5 X 107個(gè)/ml，取200μ1皮下接種于裸鼠頸背部。一周后觀(guān)察成瘤率，并以游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移 植瘤的瘤結(jié)節(jié)最大直徑a和最小徑b，計(jì)算瘤體積(TV)，計(jì)算公式為:TV= 1/2 X a X b2，同時(shí)， 每周一次檢測(cè)腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度。
[0023]本發(fā)明所述的PANC-1-LUC細(xì)胞，體內(nèi)外光通量值與細(xì)胞數(shù)之間呈顯著的直線(xiàn)相 關(guān)，在此基礎(chǔ)上建立的裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤快，成瘤率高，皮下腫瘤生長(zhǎng)符合 Gompertzian曲線(xiàn)，移植瘤的光強(qiáng)度與瘤體積有顯著的線(xiàn)性關(guān)系。相比較慢病毒載體方法， 更適合胰腺癌活體成像研究。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選在顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)（X 100);
[0025]其中，圖1A為PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后加嘌呤霉素篩選第2天的細(xì)胞形態(tài)；圖1B為篩選14 天單克隆的細(xì)胞形態(tài);圖1C為篩選21天陽(yáng)性克隆增殖的細(xì)胞形態(tài)。
[0026]圖2為活體成像系統(tǒng)檢測(cè)PANC-1-LUC細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)；
[0027]其中，圖2A表示PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒(GFP標(biāo)記）24h后，熒光 顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞GFP表達(dá)情況，90 %以上的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光；圖2B為PANC-1-LUC細(xì)胞生 物發(fā)光圖；圖2C為PANC-1-LUC細(xì)胞生物發(fā)光值。
[0028]圖3為活體成像系統(tǒng)檢測(cè)PANC-1-LUC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)熒光素酶的表達(dá)；
[0029]其中，圖3A表示皮下注射不同濃度PANC-1-LUC細(xì)胞lh后裸鼠的生物發(fā)光成像，編 號(hào)1-12 分別代表了不同的細(xì)胞數(shù)，1、2:1X107,3、4:5X106,5、6 :2X106、7、8:1X106,9、10: 5X105，11、12:2X 105;圖3B表示PANC-1-LUC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生物發(fā)光值。
[0030] 圖4為裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0032] 本發(fā)明實(shí)施例中所需要的材料、試劑均可市場(chǎng)購(gòu)得。
[0033] 實(shí)施例1:嘌呤霉素最佳篩選濃度的測(cè)定
[0034] ⑴材料:噪呤霉素、人胰腺癌PANC-1細(xì)胞(購(gòu)于美國(guó)ATCC)。
[0035] (2)實(shí)驗(yàn)方法:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞用0.25 %胰酶消化，以50 %的細(xì)胞 密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò) 夜。第2天加入不同濃度的噪呤霉素（]^/1111、2.5以8/1111、5以8/1111、7.5以8/1111、1(^/1111)，每2天 更換新的含有不同濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基，選擇4天細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為篩選濃 度。
[0036] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:培養(yǎng)第2天，5μg/ml以上劑量嘌呤霉素孔中細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡。培養(yǎng) 3天后，每孔均可見(jiàn)不同程度的細(xì)胞死亡，培養(yǎng)4天后，嘌呤霉素濃度為7.5μg/ml和lOμg/ml 的孔中細(xì)胞全部死亡。因此確定嘌呤霉素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的最佳篩選濃度為7.5yg/ ml〇
[0037] 實(shí)施例2:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的PANC-1細(xì)胞
[0038] (1)材料：帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒載體GV258，嘌呤霉素，Nucleof ector? Solution SE Kit〇
[0039] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0040] 1.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0041 ]取復(fù)蘇后第4代PANC-1細(xì)胞，以0 · 25% trypsin+0 · 02%EDTA消化細(xì)胞，1000r/min 離心5min收集細(xì)胞，取5 X 106個(gè)細(xì)胞，輕輕彈試管底部將細(xì)胞混勻，以Nudeofcctor? SE Solution重懸細(xì)胞，加入8yg表達(dá)熒光素酶的GV258質(zhì)粒載體，將細(xì)胞懸液輕輕加入電轉(zhuǎn)杯 中，4D-Nucleofector? System核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)以DN-100程序進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。以37°C預(yù)熱的培養(yǎng) 基將電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。
[0042] 1.2穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的PANC-1細(xì)胞篩選
[0043]收集6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PANC-1細(xì)胞，以2 X 103細(xì)胞數(shù)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，第2 天待細(xì)胞貼壁后，加入7.5μg/ml嘌呤霉素，每2-3天更換新鮮的含嘌呤霉素的培養(yǎng)基。嘌呤 霉素處理后未轉(zhuǎn)染細(xì)胞大量死亡，耐藥細(xì)胞克隆繼續(xù)生長(zhǎng)，連續(xù)觀(guān)察21天，21天后撤去嘌呤 霉素，存活的單克隆細(xì)胞繼續(xù)常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0044] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0045] 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞經(jīng)4D_Nucleofector? System核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染攜帶 有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒GV258，48h后，加入嘌呤霉素（7.5μg/ml)，第2天細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，僅有 少部分細(xì)胞存活，14天形成克隆，形成的克隆繼續(xù)在含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，第21 天撤去嘌呤霉素，存活的細(xì)胞克隆繼續(xù)常規(guī)擴(kuò)開(kāi)培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，命 名為PANC-1-LUC。結(jié)果詳見(jiàn)圖1。
[0046] 實(shí)施例3:活體成像系統(tǒng)檢測(cè)PANC-1-LUC細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)
[0047] ⑴材料:PAN(M-LUC細(xì)胞，D-熒光素鉀鹽，異氟烷。
[0048] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)BALB/c-nu/nu裸鼠，雄性，4-5周齡。
[0049] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0050] 1.1體外生物發(fā)光檢測(cè)
[0051 ] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1-LUC細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5X 105個(gè)/ml，每 孔?οομL接種于黑色的96孔板中，依次逐孔倍比稀釋?zhuān)總€(gè)數(shù)量級(jí)的細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，各孔 加入100μΙ D-熒光素（150μg/ml)，于活體成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。
[0052] 1.2體內(nèi)生物發(fā)光檢測(cè)
[0053] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1-LUC細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5X107個(gè)/ml，再依 次稀釋為2.5 X 107個(gè)/ml、1 X 107個(gè)/ml、5 X 106個(gè)/ml、2.5 X 106個(gè)/ml、1 X 106個(gè)/ml，分別取 200μ1接種于3只裸鼠的背側(cè)皮下（共12個(gè)點(diǎn)）。瘤細(xì)胞接種后lh經(jīng)腹腔給予D-熒光素 (150mg/kg)，注射15min后，用麻醉機(jī)進(jìn)行小鼠異氟烷麻醉，置于小動(dòng)物活體成像儀中檢測(cè) 熒光素酶的表達(dá)情況。
[0054] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：攜帶有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒經(jīng)4D_NucleofectorTM System核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可 以有效轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，經(jīng)7.5μg/ml嘌呤霉素篩選21天得到高表達(dá)熒光素酶的陽(yáng)性細(xì)胞 株。在活體成像系統(tǒng)中觀(guān)察不同接種濃度細(xì)胞的生物發(fā)光情況，在接種6250個(gè)細(xì)胞的孔內(nèi) 可見(jiàn)明確的藍(lán)色，并且孔底面的顏色隨著接種細(xì)胞數(shù)的增多而變亮，經(jīng)SPSS線(xiàn)性回歸分析， 細(xì)胞數(shù)目與發(fā)光值呈直線(xiàn)相關(guān)(P〈〇.01)，R2 = 〇.9775。證明了熒光素酶基因已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)入 PANC-1細(xì)胞中。結(jié)果詳見(jiàn)圖2。
[0055]皮下接種不同濃度PANC-1-LUC細(xì)胞后lh，活體成像系統(tǒng)中可明確檢測(cè)到接種部位 有生物發(fā)光，且光強(qiáng)度隨接種細(xì)胞數(shù)的增多而增強(qiáng)。經(jīng)SPSS線(xiàn)性回歸分析，接種細(xì)胞數(shù)與發(fā) 光值具有顯著的線(xiàn)性關(guān)系(？〈0.01)，1?2 = 0.8517。結(jié)果詳見(jiàn)圖3。
[0056]實(shí)施例4:PANC-1_LUC裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)及生物發(fā)光特點(diǎn)分析 [0057] ⑴材料:PAN(M-LUC細(xì)胞，D-熒光素鉀鹽，異氟烷。
[0058] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)BALB/c-nu/nu裸鼠，雄性，4-5周齡。
[0059] (2)實(shí)驗(yàn)方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1-LUC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5 X 107個(gè)/ml，取 200μ1皮下接種于裸鼠頸背部，以同樣方法皮下接種相同濃度慢病毒載體構(gòu)建的PANC-1- luc細(xì)胞作為對(duì)照。一周后觀(guān)察成瘤率，并以游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移植瘤的瘤結(jié)節(jié)最大直徑a 和最小徑b，計(jì)算瘤體積(TV)，計(jì)算公式為:TV= 1/2 X a X b2，同時(shí)，每周一次檢測(cè)腫瘤生物 發(fā)光強(qiáng)度。
[0060] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PANC-1-LUC細(xì)胞皮下接種裸鼠，潛伏期為3~5天，1周后成瘤率達(dá)到 80%以上。而同樣條件下接種的慢病毒載體構(gòu)建的PANC-1-luc細(xì)胞，潛伏期需10~14天，接 種10天后成瘤率僅為30%，19天后成瘤率才達(dá)到80%。觀(guān)察6周，PANC-1-LUC裸鼠皮下腫瘤 生長(zhǎng)曲線(xiàn)符合Gompertzian曲線(xiàn)，而慢病毒載體構(gòu)建的PANC-1-luc細(xì)胞移植瘤接種30天后 才出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。詳見(jiàn)圖4。
[0061] 活體成像系統(tǒng)檢測(cè)移植瘤生物發(fā)光強(qiáng)度，分析其與瘤體積的相關(guān)性，結(jié)果如表1所 示。接種后1〇、19、27、34、40天均可明確檢測(cè)到接種部位有生物發(fā)光，并且在后4次檢測(cè)中， PANC-1-LUC移植瘤的光強(qiáng)度與瘤體積具有顯著的線(xiàn)性關(guān)系(P〈0.05)。而慢病毒載體構(gòu)建的 PANC-1-luc移植瘤在前3次的檢測(cè)中，光強(qiáng)度與瘤體積相關(guān)系數(shù)很小，未呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系(P> 0.05)，在34d和40d的檢測(cè)中，兩者呈現(xiàn)較高的相關(guān)系數(shù)，具有顯著的線(xiàn)性關(guān)系(P〈0.01)。
[0062] 表1裸鼠皮下移植瘤生物發(fā)光強(qiáng)度及其與瘤體積的相關(guān)性
[0063]
[0064] *P〈0.05，#P〈0.01，生物發(fā)光強(qiáng)度與瘤體積線(xiàn)性關(guān)系的顯著性檢驗(yàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于:包括如下步驟： ULonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將攜帶有l(wèi)uc基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膜腺癌PANC-1細(xì)胞； 2) 利用嚷嶺霉素篩選出能穩(wěn)定表達(dá)巧光素酶的細(xì)胞株P(guān)ANC-1-LUC; 3) 構(gòu)建PANC-1-LUC裸鼠皮下移植瘤，移植瘤的光強(qiáng)度與瘤體積有顯著的線(xiàn)性關(guān)系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于：所述步驟1)采用Nuclcorcctoi·篡SE Solution高效轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞，在Lonza Nucleofector?核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中將攜帶luc基因的GV258質(zhì)粒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膜腺癌PANC-1細(xì) 胞4她。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于:所述步驟2)嚷嶺霉素的濃度為7.化g/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于:所述嚷嶺霉素篩選濃度的方法為:采用不同濃度的嚷嶺霉素處理PANC-1細(xì)胞，選擇 4天細(xì)胞全部死亡的最小濃度作為篩選濃度。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于:所述步驟2)為:采用7.扣g/ml嚷嶺霉素篩選表達(dá)巧光素酶的陽(yáng)性細(xì)胞21天，撤去嚷 嶺霉素，陽(yáng)性克隆繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)巧光素酶的細(xì)胞株，命名為PANC-1-LUC。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于:所述步驟3)接種PANC-1-LUC細(xì)胞的細(xì)胞濃度為2.5 X 107個(gè)/ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適用于活體成像研究的人膜腺癌裸鼠模型的構(gòu)建方法，其特 征在于:所述步驟3)為：WPANC-1-LUC細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5 X 1〇7 個(gè)/ml,取20化1皮下接種于裸鼠頸背部;一周后觀(guān)察成瘤率，并W游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移植瘤 的瘤結(jié)節(jié)最大直徑a和最小徑b，計(jì)算瘤體積(TV)，計(jì)算公式為:TV=l/2XaXb2,同時(shí)，每周 一次檢測(cè)腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度。8. 權(quán)利要求1-7任一所述方法制備的人膜腺癌裸鼠模型在活體成像中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105838735SQ201610093498
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年2月19日
【發(fā)明人】屠玨, 陳民利, 凌云, 黃宇, 齊月寒
【申請(qǐng)人】浙江中醫(yī)藥大學(xué)