一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，包括下列步驟：1)將deer?IGF?Ⅰ基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒；2)對(duì)所述重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，并從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒；3)用SalⅠ酶對(duì)陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，并將酶切線性化后的陽(yáng)性的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115，得到陽(yáng)性重組子；4)在BMGY培養(yǎng)基中通過(guò)甲醇對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使所述陽(yáng)性重組子誘導(dǎo)表達(dá)可溶于BMGY培養(yǎng)基的deer?IGF?Ⅰ蛋白；5)從BMGY培養(yǎng)基分離出deer?IGF?Ⅰ蛋白。其技術(shù)效果是：純化方法簡(jiǎn)便，無(wú)需進(jìn)行蛋白的變性復(fù)性，蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益更高，便于大規(guī)模制備，應(yīng)用前景廣。
【專利說(shuō)明】
一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] IGF(insulin_like growth factors)，中文翻譯為胰島素樣生長(zhǎng)因子或類胰島素 生長(zhǎng)因子，因其結(jié)構(gòu)與胰島素類似而得名；也被稱為〃生長(zhǎng)激素介質(zhì)〃（即SM， somatomedins)。是生長(zhǎng)激素產(chǎn)生生理作用過(guò)程中必需的一種活性蛋白多肽物質(zhì)。現(xiàn)在已知 的胰島素樣生長(zhǎng)有IGF-I和IGF-II兩種。生長(zhǎng)激素的生理作用包括促進(jìn)生長(zhǎng)，且對(duì)于糖、脂、 蛋白質(zhì)代謝和無(wú)機(jī)鹽代謝必不可少。
[0003] 已知的IGF-I是一種活性蛋白多肽物質(zhì)，它是人體內(nèi)肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞等十 幾種細(xì)胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物，也就是說(shuō)人體內(nèi)本身就含有IGF-I。其具體功能如下：
[0004] 降血糖:在這方面IGF-I與胰島素相似，能增強(qiáng)人體對(duì)葡萄糖和氨基酸的吸收，促 進(jìn)糖原的合成和乳酸分泌，抑制糖原分解，增加人體對(duì)胰島素靈敏度的功能，提高人體胰島 素的作用效率。對(duì)胰島素非依賴型糖尿病，即II型糖尿病具有較好的療效。
[0005] 降血脂：IGF_I作用于脂肪細(xì)胞能促進(jìn)脂肪分解和糖原合成，降低血中總甘油三 酯、降低密度脂蛋白甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的水平。
[0006] 舒張血管：IGF-I能調(diào)節(jié)心臟的生理和病理狀況，具有舒張血管，降低血管阻力，增 加心臟的血流量的作用。
[0007] 促進(jìn)骨的合成代謝保持其正常結(jié)構(gòu)功能：IGF_I可明顯地促進(jìn)多種來(lái)源的軟骨細(xì) 胞分裂增殖和軟骨基質(zhì)的合成。IGF-I還可刺激軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)特異型膠原蛋白-II 型膠原，增加糖胺聚酶的活性，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酯酶的活性。
[0008] 促生長(zhǎng):IGF-I是人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑。
[0009] 促細(xì)胞分化：IGF-I對(duì)維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長(zhǎng)因子 合用能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。
[0010]創(chuàng)傷修復(fù)：IGF-I還參與創(chuàng)傷愈合的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明，損傷的神經(jīng)、肌肉和肉皮細(xì)胞 中IGF-I濃度增加。
[0011]由于馬鹿的鹿茸中含有大量的活性多肽，具有廣泛的藥用價(jià)值，多肽中最具價(jià)值 的是馬鹿胰島素生長(zhǎng)因子，即deer-IGF-I，但是鹿茸每年只能收集一次，并且deer-IGF-I在 鹿茸中的含量比較低，因此需要一種馬鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子表達(dá)純化工藝，簡(jiǎn)化鹿胰島素 生長(zhǎng)因子的純化工藝，降低成本，以克服鹿茸收集次數(shù)少，其中deer-IGF-I的含量技術(shù)問(wèn) 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種梅花鹿IGF-I蛋白真核表達(dá) 方法，其純化方法簡(jiǎn)便，無(wú)需進(jìn)行蛋白的變性復(fù)性，蛋白經(jīng)過(guò)磷酸化，糖基化修飾可使蛋白 活性更強(qiáng)，蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益更高；分離方法簡(jiǎn)便，便于大規(guī)模制備，應(yīng)用前景 廣。
[0013] 實(shí)現(xiàn)上述目的的的一種技術(shù)方案是：一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方 法，包括下列步驟：
[0014] 1)將deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0015] 2)對(duì)所述重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，并從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒；
[0016] 3)用Sal頂每對(duì)陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，并將酶切線性化后的陽(yáng)性的重 組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115,得到陽(yáng)性重組子；
[0017] 4)在BMGY培養(yǎng)基中通過(guò)甲醇對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使所述陽(yáng)性重組子 誘導(dǎo)表達(dá)可溶于BMGY培養(yǎng)基的deer-IGF-I蛋白；
[0018] 5)從BMGY培養(yǎng)基分離出deer-IGF-I蛋白。
[0019] 進(jìn)一步的，步驟1包括下列步驟：
[0020] la.通過(guò)PCR引物在deer-IGF-I基因片段的上游引入EcoR I酶切位點(diǎn)和HIS標(biāo)簽蛋 白，下游引入Not頂每切位點(diǎn)和終止密碼子；
[0021] lb.在pPIC9k質(zhì)粒上進(jìn)行EcoR頂每切位點(diǎn)和Not頂每切位點(diǎn)上的雙酶切；
[0022] lc.將deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0023]再進(jìn)一步的，步驟1中，
[0024] EcoR I酶切位點(diǎn)引入的PCR引物為F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC,
[0025] Not I酶切位點(diǎn)引入的PCR引物為R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC〇
[0026] 再進(jìn)一步的，步驟2包括下列步驟：
[0027] 2a.將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體系轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子；
[0028] 2b.對(duì)所述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增；
[0029] 2c.用氨芐抗性平板篩選擴(kuò)增后的轉(zhuǎn)化子，從中選取陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，再?gòu)年?yáng)性的轉(zhuǎn) 化子中提取陽(yáng)性的重組質(zhì)粒。
[0030]再進(jìn)一步的，步驟3中利用HIS缺陷平板篩，篩選陽(yáng)性重組子。
[0031]再進(jìn)一步的，步驟4中的BMGY培養(yǎng)基分為培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基和誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培 養(yǎng)基，步驟4分為下列步驟：
[0032] 4a.在培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述陽(yáng)性重組子直至培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基的0D600 值達(dá)到8~10;所述培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基的溫度為27~30°C，振動(dòng)速率為250rpm;
[0033] 4b.將培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基中的陽(yáng)性重組子接種到誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中，所述 誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中的陽(yáng)性重組子的接種量為每毫升10D，再分次將甲醇加入所述誘 導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中，對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0034]更進(jìn)一步的，步驟4b中，在48小時(shí)內(nèi)，分次將甲醇加入所述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基 中，對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，補(bǔ)加甲醇的頻率為12小時(shí)一次，每 次補(bǔ)加甲醇后，所述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中的甲醇的濃度為0.5vol. %。
[0035] 進(jìn)一步的，步驟5包括下列步驟：
[0036] 5a.對(duì)所述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，收集上層清液；
[0037] 5b.對(duì)所述上層清進(jìn)行超濾濃縮；
[0038] 5c.再使經(jīng)過(guò)濃縮的上層清液通過(guò)鎳離子柱，以進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的純化和雜 蛋白的去除，收集含有deer-IGF-I蛋白的洗脫液；
[0039] 5d.對(duì)所述洗脫液進(jìn)行透析除鹽；
[0040] 5e.對(duì)透析除鹽后的洗脫液進(jìn)行低溫超濾濃縮，得到deer-IGF-I蛋白。
[0041 ] 進(jìn)一步的，通過(guò)MTT法，用MCF-7細(xì)胞檢測(cè)deer-IGF-I蛋白的活性。
[0042]本發(fā)明的一種梅花鹿IGF-I蛋白真核表達(dá)方法的技術(shù)方案，包括下列步驟：1)將 deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒;2)對(duì)所述重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，并從 中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒;3)用Sal I酶對(duì)陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，并將酶切線性 化后的陽(yáng)性的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115,得到陽(yáng)性重組子;4)在BMGY培養(yǎng)基 中通過(guò)甲醇對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使所述陽(yáng)性重組子誘導(dǎo)表達(dá)可溶于BMGY培養(yǎng) 基的deer-IGF-I蛋白；5)從BMGY培養(yǎng)基分離出deer-IGF-I蛋白。其技術(shù)效果是：純化方法簡(jiǎn) 便，無(wú)需進(jìn)行蛋白的變性復(fù)性，蛋白經(jīng)過(guò)磷酸化，糖基化修飾可使蛋白活性更強(qiáng)，蛋白的結(jié) 構(gòu)更穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益更高;分離方法簡(jiǎn)便，便于大規(guī)模制備，應(yīng)用前景廣。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為PIC9k質(zhì)粒載體物理圖譜。
[0044] 圖2為pPIC9K質(zhì)粒酶切的電泳圖譜；
[0045] Μ泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA Marker;
[0046] 第1泳道為pPIC9K質(zhì)粒；
[0047] 第2泳道為pPIC9k質(zhì)粒與deer-IGF-I基因片段連接后的重組質(zhì)粒；
[0048] 第3泳道為deer-IGF-I基因片段的PCR引物。
[0049]圖3為鎳離子柱純化后的deer-IGF-I蛋白的凝膠蛋白電泳圖譜；
[0050] Μ泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白Marker;
[0051 ] 第1泳道為純化后的deer-IGF-I蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0052]請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明的發(fā)明人為了能更好地對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行理解，下面通 過(guò)具體地實(shí)施例，并結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明：
[0053]本發(fā)明利用基因重組技術(shù)制備梅花鹿重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I，即deer-IGF-I， 在deer-IGF-I基因片段的上游添加了酶切位點(diǎn)和HIS標(biāo)簽蛋白，下游添加了酶切位點(diǎn)和終 止密碼子，再與真核表達(dá)載體pPIC9k質(zhì)粒構(gòu)建了重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在巴斯德畢赤酵母 GS115中表達(dá)蛋白，pPIC9k重組質(zhì)粒以可溶性蛋白的方式表達(dá)deer-IGF-I蛋白，并通過(guò)鎳離 子柱進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的純化，促進(jìn)deer-IGF-I蛋白的正確折疊變成具有活性的deer- IGF-I蛋白，通過(guò)MTT法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)基中deer-IGF-I蛋白的質(zhì)量濃度與MCF-7細(xì)胞增 殖速率之間的函數(shù)關(guān)系。
[0054] 本發(fā)明在deer-IGF-I基因片段的基因序列中引入EcoR I酶切位點(diǎn)、Not頂每切位 點(diǎn)和HIS標(biāo)簽蛋白，與pPIC9k質(zhì)粒上的XcoR I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)一致。pPIC9k質(zhì)粒、 巴斯德畢赤酵母GS115均購(gòu)自Novagen公司，DH5a感受態(tài)大腸桿菌，購(gòu)自Promega公司，MCF-7 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海典藏細(xì)胞庫(kù)。
[0055] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述 特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí) 施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科 學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí) 驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
[0056] 本發(fā)明一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)純化方法，包括下列步驟：
[0057] 基因調(diào)取步驟:根據(jù)deer-IGF-I cDNA序列設(shè)計(jì)引物。在設(shè)計(jì)過(guò)程中遵循PCR引物 設(shè)計(jì)原則，從梅花鹿cDNA文庫(kù)中調(diào)取deer-IGF-I基因片段，增加位于deer-IGF-I基因片段 上游的，即位于deer-IGF-I基因片段的pi段上的EcoR頂每切位點(diǎn)，以及位于deer-IGF-I基 因片段下游，即位于deer-IGF-I基因片段的P4段5'端上的Not I酶切位點(diǎn)。EcoR I酶切位點(diǎn) 引入的PCR引物為F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC，Not 頂每切位點(diǎn)引入的PCR引物為R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC。
[0058] deer-IGF-I的cDNA基因片段的序列為： ATGG GAAA AATC AGCA GTCT TCCA ACCC AATT ATTT AAGT GCTG CTTT TGTG ATTT CTTG AAGC AGGT GAaG ATGC CCGT CACA TCCT CCTC GCAT CTCT TCTA CCTG GCCC TGTG CTTG CTCG CCTT CACC AGCT CTGC CACG GCGG GACC CGaG ACCC TCTG CGGG GCTG AGTT GOTO GATG CTCT CCAG TTCG TGTG CGGA GACA GGGG CTTT TA'TT
[0059] TCAA CAAG CCCA CGGG GTAC GGCT CGAG CAGT CGGA GGGC GCCC CAGA CGGG AATA GTGG ATCA GTGC TGCT TCCG GAGC TGTG ATCT GMG AGGC TGGA GATG TACT G(:GC GCCT CTCA AGCC CACt AA(;-G CGGC CCGC TCAG TCCG TGCC CAGC GCCA CACC GACA TGCC CAAG GCTG AGAA GGAA GTAC ATTT 6AAG AAGA CAAG TAGA (；GGA GTTG AGO A AACA A(；AA CTAC AGAA TGTAG.
[0060] 重組質(zhì)粒構(gòu)建步驟:在pPIC9k質(zhì)粒上進(jìn)行EcoR頂每切位點(diǎn)和Not頂每切位點(diǎn)上的 雙酶切，在pPIC9k質(zhì)粒上切下相應(yīng)基因片段，對(duì)雙酶切后的在pPIC9k質(zhì)粒進(jìn)行純化，并將在 序列合成步驟中deer-IGF-I基因片段在DNA連接酶的作用下克隆入雙酶切后的pPIC9k質(zhì)粒 上對(duì)應(yīng)的位置，完成deer-IGF-I基因片段在PIC9k質(zhì)粒上的取代，得到重組質(zhì)粒。
[0061] 轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增步驟:將重組質(zhì)粒連接體系轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，并 擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子，并用氨芐抗性平板，從擴(kuò)增后的轉(zhuǎn)化子中選取陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，再?gòu)乃鲫?yáng)性的 轉(zhuǎn)化子中提取陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒。
[0062]重組子構(gòu)建步驟:將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性的重組質(zhì)粒用Sal I酶進(jìn)行酶切線性化，并將 酶切線性化的陽(yáng)性的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115,得到陽(yáng)性重組子，利用HIS 缺陷平板篩篩選陽(yáng)性重組子，即HIS+重組子，利用陽(yáng)性重組子在MD平板上生長(zhǎng)的狀況，對(duì)篩 選后的陽(yáng)性重組子的表型進(jìn)行鑒定。
[0063] 重組子培養(yǎng)步驟:所述陽(yáng)性重組子在培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~18h，，使培養(yǎng) 用BMGY培養(yǎng)基的0D600值最終達(dá)到8~10。所述陽(yáng)性重組子是置于搖瓶中培養(yǎng)的，培養(yǎng)的溫 度為27~30°C，搖瓶的振動(dòng)頻率為250rpm。
[0064] 蛋白表達(dá)誘導(dǎo)步驟:將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的陽(yáng)性重組子接種到誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中， 誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基置于1L的搖瓶中，每個(gè)搖瓶中陽(yáng)性重組子的接種量為每毫升10D，搖 瓶的振動(dòng)速率為250rpm，接種陽(yáng)性重組子后使誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基的0D600值達(dá)到1。再 用甲醇對(duì)于陽(yáng)性重組子進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，時(shí)間為48小時(shí)，每隔12小時(shí)在誘 導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基補(bǔ)加一次甲醇，每次補(bǔ)加甲醇后，誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中的甲醇的 濃度均為〇.5vol. %。甲醇為無(wú)水甲醇。
[0065]離心分離步驟:蛋白表達(dá)誘導(dǎo)步驟結(jié)束后，在轉(zhuǎn)速為5000rpm的離心分離機(jī)上，對(duì) 誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行l(wèi)Omin的離心分離，收集離心分離后的上層清液，以從中分離 deer-IGF-I蛋白。
[0066]超濾濃縮步驟:將上層清液用超濾杯進(jìn)行超濾濃縮，濾膜的截留尺寸為5000Da。 [0067] 純化步驟:再使經(jīng)過(guò)超濾濃縮的上層清液通過(guò)鎳離子柱，以進(jìn)行deer-IGF-I蛋白 的純化和雜蛋白的去除，得到含有deer-IGF-I蛋白的洗脫液。
[0068] 透析除鹽步驟:對(duì)純化后含有deer-IGF-I的洗脫液透析，deer-IGF-I蛋白在透析 袋中進(jìn)行透析除鹽的，透析袋截留分子量為5000Da，外透析液為超純水，透析溫度為4°C，透 析時(shí)間為2 4小時(shí)，每隔4小時(shí)換一次外透析液。
[0069] 濃縮步驟：通過(guò)低溫超濾濃縮對(duì)經(jīng)過(guò)透析除鹽后的洗脫液進(jìn)行濃縮，得到deer- IGF-I蛋白。
[0070] 檢測(cè)步驟:用蛋白質(zhì)凝膠電泳法得到deer-IGF-I蛋白的電泳圖譜，通過(guò)MTT法檢測(cè) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)基中deer-IGF-I蛋白的質(zhì)量濃度與MCF-7細(xì)胞增殖速率之間的函數(shù)關(guān)系。
[0071] 畢赤酵母作為一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)性、高分泌的特點(diǎn)， 其宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115自身蛋白分泌量少，下游分離純化操作易行，能大規(guī)模生 產(chǎn)，是一種適合表達(dá)外源基因的真核表達(dá)系統(tǒng)。因此deer-IGF-I基因片段通過(guò)酶切連接入 pPIC9k質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入體系轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，擴(kuò)增重 組質(zhì)粒，從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115,通 過(guò)甲醇進(jìn)行deer-IGF-I蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。deer-IGF-I蛋白上含有HIS標(biāo)簽。
[0072]與從鹿的體內(nèi)提取deer-IGF-I蛋白再進(jìn)行純化相比，采用巴斯德畢赤酵母GS115 進(jìn)行真核表達(dá)，deer-IGF-I蛋白分泌到BMGY培養(yǎng)基中，純化方法簡(jiǎn)便，無(wú)需進(jìn)行deer-IGF-I 蛋白的變性復(fù)性，deer-IGF-I蛋白可通過(guò)磷酸化，糖基化修飾，增強(qiáng)活性，deer-IGF-I蛋白 結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益更高;分離方法簡(jiǎn)便，便于大規(guī)模制備，應(yīng)用前景廣。
[0073]本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明， 而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變 化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，包括下列步驟： 1) 將deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒； 2) 對(duì)所述重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，并從中篩選出陽(yáng)性的重組質(zhì)粒； 3) 用Sal頂每對(duì)陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化，并將酶切線性化后的陽(yáng)性的重組質(zhì) 粒電轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115,得到陽(yáng)性重組子； 4) 在BMGY培養(yǎng)基中通過(guò)甲醇對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使所述陽(yáng)性重組子誘導(dǎo) 表達(dá)可溶于BMGY培養(yǎng)基的deer-IGF-I蛋白； 5) 從BMGY培養(yǎng)基分離出deer-IGF-I蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟1包括下列步驟： la. 通過(guò)PCR引物在deer-IGF-I基因片段的上游引入EcoR頂每切位點(diǎn)和HIS標(biāo)簽蛋白， 下游引入Not頂每切位點(diǎn)和終止密碼子； lb. 在pPIC9k質(zhì)粒上進(jìn)行EcoR I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)上的雙酶切； lc. 將deer-IGF-I基因片段克隆入pPIC9k質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟1中， EcoR 頂每切位點(diǎn)引入的PCR引物為F:CCGG AATT CATG CATC ATCA CCAT CACC ATGG AAAA ATCA GCAG TCTT CC, Not I酶切位點(diǎn)引入的PCR引物為R:ATAA GAAT CTAC ATTC TGTA GTTC TTGT TTCC。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟2包括下列步驟： 2a.將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體系轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子； 2b.對(duì)所述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增； 2c.用氨芐抗性平板篩選擴(kuò)增后的轉(zhuǎn)化子，從中選取陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，再?gòu)年?yáng)性的轉(zhuǎn)化子 中提取陽(yáng)性的重組質(zhì)粒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟3中利用HIS缺陷平板篩，篩選陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟4中的BMGY培養(yǎng)基分為培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基和誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基，步驟4分為下列步 驟： 4a.在培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述陽(yáng)性重組子直至培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基的0D600值達(dá) 到8~10;所述培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基的溫度為27~30°C，振動(dòng)速率為250rpm; 4b.將培養(yǎng)用BMGY培養(yǎng)基中的陽(yáng)性重組子接種到誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo) 表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中的陽(yáng)性重組子的接種量為每毫升10D，再分次將甲醇加入所述誘導(dǎo)表 達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中，對(duì)所述陽(yáng)性重組子進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于： 步驟4b中，在48小時(shí)內(nèi)，分次將甲醇加入所述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中，對(duì)所述陽(yáng)性重 組子進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，補(bǔ)加甲醇的頻率為12小時(shí)一次，每次補(bǔ)加甲醇后，所 述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基中的甲醇的濃度為0.5vol. %。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:步 驟5包括下列步驟： 5a.對(duì)所述誘導(dǎo)表達(dá)用BMGY培養(yǎng)基進(jìn)行離心分離，收集上層清液； 5b.對(duì)所述上層清進(jìn)行超濾濃縮； 5c .再使經(jīng)過(guò)濃縮的上層清液通過(guò)鎳離子柱，以進(jìn)行deer-IGF-I蛋白的純化和雜蛋白 的去除，收集含有deer-IGF-I蛋白的洗脫液； 5d.對(duì)所述洗脫液進(jìn)行透析除鹽； 5e.對(duì)透析除鹽后的洗脫液進(jìn)行低溫超濾濃縮，得到deer-IGF-I蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種梅花鹿胰島素樣生長(zhǎng)因子真核表達(dá)方法，其特征在于:通 過(guò)MTT法，用MCF-7細(xì)胞檢測(cè)deer-IGF-I蛋白的活性。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK105838732SQ201610322353
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】陳建兵, 王瑜, 黨平
【申請(qǐng)人】上海藍(lán)莊生物醫(yī)藥科技有限公司