一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法。本發(fā)明采用爆破和HPAC兩種方法對(duì)花生殼進(jìn)行預(yù)處理，然后用纖維素酶和木聚糖酶對(duì)其進(jìn)行酶解得到含有高濃度可發(fā)酵性糖的酶解液，并對(duì)酶解液進(jìn)行脫毒處理去除抑制物，以提高發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯的能力。爆破法預(yù)處理具有處理裝置簡(jiǎn)單、節(jié)約成本、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，HPAC法具有水解半纖維素、去除木質(zhì)素、產(chǎn)生抑制物較少、葡萄糖轉(zhuǎn)化率高以及環(huán)境危害小等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于其他脫毒方式，活性炭脫毒法去除更多的抑制物，最終提高了異戊二烯及其衍生物的產(chǎn)量。
【專利說(shuō)明】
一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)新興可再生燃料的領(lǐng)域，具體涉及一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生 產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在工業(yè)上異戊二烯的來(lái)源主要是通過(guò)化學(xué)法從石油基原料中獲得。然而，隨 著化石資源的日益枯竭、價(jià)格的不斷攀升，原料來(lái)源將成為異戊二烯工業(yè)生產(chǎn)的重要瓶頸 問(wèn)題。同時(shí)工業(yè)上獲得蒎烯，β_蒎烯的主要來(lái)源是采用高效精餾塔從脂松節(jié)油或粗硫酸 鹽松節(jié)油中進(jìn)行分離提取。然而，上述方法對(duì)設(shè)備的要求高，操作困難，能耗大，效率低等缺 點(diǎn)，同時(shí)犧牲很多自然資源。
[0003] 因此，尋求一種可持續(xù)替代石油基原料制備類異戊二烯化合物（異戊二烯、α_蒎 烯，蒎烯）的方法是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)。然而我國(guó)存在豐富的農(nóng)林廢棄物這一可再生資 源，而且這些含有木質(zhì)纖維素的農(nóng)林廢棄物大多數(shù)并沒(méi)有被有效的利用。
[0004] 我國(guó)花生產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的45%，約為1.3 X 107噸，花生殼產(chǎn)量約為3.64 X 106噸，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，經(jīng)過(guò)酶解處理后得到可發(fā)酵性糖。目前已有報(bào) 道稱可利用秸桿等其他農(nóng)林廢棄物為原料生產(chǎn)生物乙醇等生物能源，但是以花生殼為原料 生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，本發(fā)明 提供了以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)可發(fā)酵性還原糖的方法，以及根據(jù)該方法制備的糖液為碳源使 用工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物，主要內(nèi)容包括原料組分檢測(cè)、原料的預(yù)處理、酶解、發(fā) 酵能力檢測(cè)、酶解液脫毒處理、發(fā)酵能力再次檢測(cè)、主要抑制物分析。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明提供了一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，它包括以下 步驟： (1) 預(yù)處理:對(duì)花生殼進(jìn)行爆破法預(yù)處理或者HPAC法預(yù)處理； (2) 酶解:對(duì)預(yù)處理后的花生殼粉碎，過(guò)篩;再將花生殼粉末置于檸檬酸鈉緩沖液中，并 加入疊氮化鈉;然后再加入纖維素酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解處理； (3) 脫毒:對(duì)酶解液進(jìn)行活性炭脫毒處理、乙酸乙酯萃取方法脫毒處理或者亞硫酸鈉脫 毒處理； (4) 利用酶解液發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物:將帶有生產(chǎn)異戊二烯、α_蒎烯或β_蒎烯的 基因的質(zhì)粒和pTrc-low共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組菌株，將其擴(kuò)培后的菌液 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)制得類異戊二烯化合物。
[0007] 進(jìn)一步的：所述步驟（1)中HPAC法預(yù)處理為：用HPAC溶液在70 °C-80 °C的條件下處 理洗凈風(fēng)干的花生殼，所述花生殼與HPAC溶液的質(zhì)量比濃度為10%-20%，然后過(guò)濾分離獲得 處理液和花生殼，并用流水清洗分離后的花生殼直至清洗液PH為中性。
[0008] 進(jìn)一步的：所述步驟(2 )中將花生殼粉末以質(zhì)量體積比為1%-10%的濃度置于PH為 4.8的50 mM的檸檬酸鈉緩沖液中，加入疊氮化鈉使其w/v終濃度為0.01%。
[0009] 進(jìn)一步的：所述步驟（2)中加入纖維素酶和木聚糖酶，使其終濃度分別為30 - 40PFU/g和300 -350IU/ml，然后置于37°C的旋轉(zhuǎn)容器中酶解48 h。
[0010] 進(jìn)一步的:所述步驟(3)中將活性炭按照質(zhì)量體積比為1%-5%的比例加入到酶解液 中，震蕩，離心后過(guò)濾，取上清。
[0011] 進(jìn)一步的：所述步驟(3)中按照酶解液與乙酸乙酯1:1-1:5的體積比萃取，收集水 相即為脫毒后的酶解液。
[0012]進(jìn)一步的：所述步驟(3)中向酶解液中加入亞硫酸鈉，使其最終濃度達(dá)到lmmol/ L_5 mmol /L，在150 r /min、30°C下處理后得到脫毒后的酶解液。
[0013] 進(jìn)一步的：所述異戊二烯的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒PACY-MVAE-MVAS-Isp4和pTrc-low 共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至 OD6〇Q達(dá)到0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。 [0014] 進(jìn)一步的：所述α-蒎烯的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS2-Pt 3Q和pTrc- l〇w共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至 OD600達(dá)到0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。 [0015] 進(jìn)一步的：所述β-蒎烯的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS2-QH6和pTrc- l〇w共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直 至OD600達(dá)到0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果是:本發(fā)明采用爆破和HPAC(過(guò)氧化氫 和醋酸1:1混合液)兩種方法對(duì)花生殼進(jìn)行預(yù)處理，然后用纖維素酶對(duì)其酶解得到含有高濃 度可發(fā)酵性糖的酶解液，并對(duì)酶解液進(jìn)行脫毒處理去除抑制物以提高發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯的能 力，相對(duì)于其他脫毒方式，活性炭脫毒法去除更多的抑制物，為最優(yōu)處理方式，其中乙酸去 除率為76.9%，5-HMF去除率為72.83%，糠醛去除率為78.77%，最終提高了異戊二烯及其衍生 物的產(chǎn)量。
[0017] 在本發(fā)明將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖這一過(guò)程中，對(duì)原材料預(yù)處理和酶解是 其兩個(gè)關(guān)鍵步驟。因?yàn)槟举|(zhì)素和半纖維素阻礙纖維素酶水解纖維素，因此要想達(dá)到酶解目 的必須對(duì)原材料進(jìn)行預(yù)處理以去除其中的木質(zhì)素和半纖維素或者破壞其結(jié)構(gòu)。相對(duì)于其他 預(yù)處理方法(如:氨纖維爆破法，微生物處理法，稀酸處理法，蒸汽爆破法等），爆破法預(yù)處理 具有處理裝置簡(jiǎn)單、節(jié)約成本、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，HPAC法具有水解半纖維素、去除木質(zhì) 素、產(chǎn)生抑制物較少、葡萄糖轉(zhuǎn)化率搞以及環(huán)境危害小等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明預(yù)處理前花生殼中各組分含量； 圖2是本發(fā)明預(yù)處理前和處理后花生殼中各單糖組分含量； 圖3是本發(fā)明預(yù)處理前和處理后酶解液中各抑制物含量； 圖4是本發(fā)明異戊二烯GC分析； 圖5是本發(fā)明α-薇稀GC分析； 圖6是本發(fā)明β-薇稀GC分析； 圖7是本發(fā)明乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖8是本發(fā)明甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖9是本發(fā)明糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖1 〇是本發(fā)明5-羥甲基糠醛(5-ΗΜΠ 的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖11是本發(fā)明異戊二烯的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖12是本發(fā)明α_蒎烯的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 圖13是本發(fā)明β-蒎烯的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0020] 實(shí)施例1、通過(guò)不同方法對(duì)花生殼進(jìn)行組分鑒定 1.1花生殼組分鑒定 稱取花生殼試樣0.3 g，用200 ml乙醇于95 °C水浴中索氏抽提完全，風(fēng)干。
[0021] 稱取0.3 g樣品于耐壓管中，加入3 mL 72%的H2S〇4,充分?jǐn)嚢杌旌希庞?0 °C水浴鍋，水浴60 min后，加入84 mL去離子水，置于高壓滅菌鍋，121°C水解lh。
[0022] 1.1.1木質(zhì)素含量的測(cè)定 將水解后的樣品置于過(guò)濾坩堝中抽濾，收集濾液和殘?jiān)?。通過(guò)灰化法測(cè)定木質(zhì)素:將殘 渣和坩堝一同放于105°C干燥箱烘干至恒重，記重m，將殘?jiān)哇釄逯糜谙涫诫娮锠t中， 575±25°C灰化10h，干燥器中冷卻至室溫，稱重記錄m2。
[0023]計(jì)算木質(zhì)素：
由圖1可知花生殼中含有43%木質(zhì)素，木質(zhì)素所占比例較高，因此，通過(guò)預(yù)處理去除木質(zhì) 素可以加快水解效率進(jìn)而提高酶解液中可發(fā)酵性糖的含量。
[0024] 1.1.2纖維素和半纖維素含量的測(cè)定 糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:稱取D(+)葡萄糖，D(+)木糖，D(+)半乳糖，L(+)阿拉伯糖和D(+)甘 露糖各25mg，于25mL容量瓶定容，配制成lmg/mL的貯備液，等梯度稀釋，置于4°C冰箱 備用。
[0025] 糖回收標(biāo)準(zhǔn)溶液(SRS)的制備:準(zhǔn)確稱取一定量的D( + )葡萄糖D( + )木糖，D( + )半 乳糖，L( + )阿拉伯糖，D( + )甘露糖。加入lO.OmL去離子水和348yL的72% H2S〇4,配制成 以上單糖的糖回收標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)移至耐壓管中，酸解處理(同樣品酸解），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 HPLC測(cè)定單糖含量:取4mL濾液于10mL的燒杯中，用CaC03中和至pH為5-6。離 心取上清液，過(guò)〇.2μηι濾膜，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶進(jìn)行測(cè)定。
[0026] 色譜條件： 檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD) 進(jìn)樣量：10yL-50yL 流動(dòng)相:超純水 流速:〇.6mL/min 柱子溫度:80 ±5 °C 增益：10 氣體壓力:30psi 漂移管：加熱模式，80 ±25 °C 噴霧器:60% 運(yùn)行時(shí)間：20min 計(jì)算單糖以及纖維素、半纖維素的含量： 纖維素％= 半纖維素
注:Ac表示脫水矯正系數(shù)，用0.88( 132/150)脫水校正(anhydro correction)五碳糖 (木糖xylose和阿拉伯糖arabinose)及0.90(162/180)校正六碳糖（葡萄糖glucose、 半乳糖galactose和甘露糖mannose)。
[0027]由圖1可知，花生殼中全纖維素(纖維素和半纖維素)含量為47%，其含量相對(duì)于其 他木質(zhì)纖維素材料較高，因此，花生殼適合作為原料代替石油生產(chǎn)異戊二烯及其衍生物。 [0028] 1.1.3灰分的測(cè)定 將坩堝置于馬弗爐中900 25°C烘30-60 min，之后于干燥器中冷卻，恒重，記下重量， 與未放入馬弗爐前坩堝重量之差小于0.1 mg。
[0029] 稱量坩堝重量，記重m3,加入約0.50g粉碎后的樣品，記重m4,將坩堝和樣品置 于箱式電阻爐中，900±25°C灰化30-60 min，干燥器中冷卻至室溫，記重ms，計(jì)算總灰分 (Total Ash)。
[0030] 由閣1頭脫結(jié)米η」知，化王憑干狄甘含量為6%。
[0031] 1.1.4花生殼中有機(jī)組分含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取2.00. lg(Wl)烘干粉碎后的花生殼置于索氏提取器中，加入150ml有萃取劑 (95%乙醇:純苯酚比例為1:2混合液)到與提取器相連的圓底燒瓶中，連接好索氏提取器裝 置打開冷凝管開關(guān)，并加熱圓底燒瓶使其中的萃取劑沸騰蒸發(fā)萃取24h。萃取結(jié)束后真空蒸 發(fā)含有萃取物的萃取劑至20_25ml體積，然后將其轉(zhuǎn)移到干凈的已知重量的器皿中，并用少 量的萃取劑清洗圓底燒瓶后倒入上述器皿中，并真空蒸發(fā)至濕度接近零，然后在將其轉(zhuǎn)移 到105 ± 3°C的干燥箱中干燥lh后置于干燥箱中冷卻并稱重(W2)。另外以未加花生殼做對(duì)照 (W3)〇
[0032] 有機(jī)組分含量計(jì)算：
由圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，花生殼中有機(jī)組分含量為4%。
[0033] 1.1.5花生殼中單糖組分分析 取花生殼于0.25 ml 72% (v/v) H2S〇4中30 °C處理45 min，然后用去離子水將H2S〇4 稀釋到4 %，并將其置于121 °C保溫1 h，將已知的肌醇加到水解液中作為內(nèi)標(biāo)物，然后用 氨水調(diào)其PH至中性，加 lml硼氫化鈉溶液和0.1 ml冰醋酸，然后加0,2 ml甲基咪唑和2 ml冰醋酸，最后加5 ml去離子水并用2 ml二氯甲烷提取。提取液用氣相色譜檢測(cè)各單糖 組分：GC (GC-2010; Shimadzu, Otsu, Japan)，DB-225 毛細(xì)管色譜柱（30 m X 0.25 mm i.d·，0.25 μπι film thickness, J&W; Agilent, Folsom, CA, USA。檢測(cè)條件：進(jìn)樣器溫 度220 °C;離子火焰檢測(cè)器(FID)溫度250 °C;初始柱溫100 °C保持1.5min，5 °C/min升至 220 °C〇
[0034]實(shí)施例2、利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物 一、花生殼預(yù)處理 流水清洗干凈花生殼后風(fēng)干待用。
[0035] 1.1爆破法預(yù)處理花生殼 取清洗干凈的花生殼用蒸餾水處理使其濕度保持在75 %并將其置于爆破裝置內(nèi)，以 15-20 °C/min的升溫速度加熱爆破罐，當(dāng)溫度升至220 °C，壓力升至1.47 MPa時(shí)快速打開 爆破罐的蓋子，收集處理后的罐內(nèi)的花生殼并置于室溫內(nèi)冷卻。
[0036] 1.2 HPAC法預(yù)處理花生殼 HPAC溶液:過(guò)氧化氫和醋酸以1:1的比例混合得的溶液。
[0037]用100 ml HPAC溶液在80 °C的條件下處理10 g洗凈風(fēng)干的花生殼2 h，然后過(guò)濾 分離處理液和花生殼并用流水清洗分離后的花生殼直至清洗液PH為中性。
[0038] HPAC和爆破預(yù)處理后的花生殼同時(shí)置于-45 °C的干燥器內(nèi)干燥5天。
[0039]由圖2可知，預(yù)處理和未處理花生殼酶解液中均含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露 糖、半乳糖、葡萄糖，而且HPAC和爆破預(yù)處理的花生殼中比未處理花生殼中總糖分別多出 27.3%和1.6%，因此爆破和HPAC預(yù)處理后提高了花生殼的水解效率，尤其是HPAC預(yù)處理。 [0040] 二、酶解處理花生殼 2.1酶解處理花生殼 2.1.1粉碎機(jī)粉碎未處理和預(yù)處理后的花生殼，過(guò)60目篩子。
[0041 ] 2.1.2粉碎后的花生殼以1% (w/v)濃度置于PH為4.8的50 mM的檸檬酸鈉緩沖液 中，并加入疊氮化鈉使其終濃度為0.01% (W/V)。然后加入纖維素酶和木聚糖酶，使其終濃 度分別為30 PFU/g和300 IU/ml，然后置于200 rpm和37°C的旋轉(zhuǎn)容器中48 h。
[0042] 2.2酶解液中各組分含量的測(cè)定 取酶解液用0.2 μπι的濾膜過(guò)濾得濾液，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)未處理花生殼和預(yù)處理后 花生殼酶解液組分含量。
[0043] 2.2.1單糖檢測(cè)方法： 樣品量：10-50μ1 流動(dòng)相:HPLC三級(jí)水(用0.2μπι濾膜過(guò)濾并且脫氣） 流動(dòng)速率:〇 · 6ml/minute 柱溫:80-85 °C 檢測(cè)器溫度:盡量和柱溫相近 檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器 運(yùn)行時(shí)間：先20min數(shù)據(jù)收集，然后在運(yùn)行15min 由圖2可知，經(jīng)HPAC預(yù)處理的花生殼酶解液中木糖含量和葡萄糖含量要多于爆破和未 處理花生殼酶解液中其含量，并且HPAC預(yù)處理的花生殼中葡萄糖含量約為未處理花生殼的 兩倍。因此，HPAC法更適合作為花生殼的預(yù)處理方法。
[0044] 2.2.2有機(jī)酸、糠醛等抑制物的檢測(cè)方法： 樣品量：10-25μ1 流動(dòng)相:0.005Μ硫酸（用0.2μπι濾膜過(guò)濾并且脫氣） 流動(dòng)速率:〇 · 6ml/minute 柱溫：55-65 °C 檢測(cè)器溫度:盡量和柱溫相近 檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器 運(yùn)行時(shí)間：50min 由圖3可知，花生殼經(jīng)HPAC預(yù)處理后酶解液中不含甲酸，并且其5-HMF和糠醛含量幾乎 為零，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于爆破預(yù)處理的酶解液，乙酸含量相近。因此，HPAC預(yù)處理方法要優(yōu)于爆破法， 更適合進(jìn)行原材料的預(yù)處理。
[0045]圖7-圖10為HPLC法測(cè)得的乙酸、甲酸、糠醛、5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)以上標(biāo) 準(zhǔn)曲線可以計(jì)算樣品中各組分含量。
[0046] 三、比較三種酶解液脫毒處理方法 3.1活性炭脫毒處理 將活性炭按照l(shuí)%(w/v)的比例加入到酶解液中，在30°C、180rpm條件下震蕩10h，10000 rpm/min離心10 min后用0.2 μπι過(guò)濾，取上清。
[0047] 3.2乙酸乙酯萃取方法脫毒： 按照酶解液與乙酸乙酯1:1的體積比萃取三次，每次用分液漏斗分層，分別收集有機(jī)相 (萃取相)和水相(萃余相），水相即為脫毒后的酶解液。
[0048] 3.3亞硫酸鈉處理 向酶解液中加入亞硫酸鈉，使其最終濃度達(dá)到5 mmol /L，在150 r /min、30°C下處 理1 h后得到的即為脫毒后的花生殼酶解液。
[0049] 四、利用酶解液發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯和α-蒎烯 4.1檢測(cè)脫毒前后酶解液發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯、α_蒎烯和β_蒎烯的能力 4.1.1產(chǎn)物異戊二烯的發(fā)酵 4.1.1.1質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化 分別取已構(gòu)建好的質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-Isp4(參見Jianming Yang, et.al·，2012， PLoS ONE 7(4): e33509. doi:10.1371/journal.pone.0033509#PpTrc-low(SMYang et al. Bioresource Technology 104 (2012) 642-647)各5 μL然后加入到E.coli的感受 態(tài)細(xì)胞BL2UDE3)中，冰浴30 min，熱擊90 s，冰浴5 min，加入450 μL無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng) 基，放入37°C搖床中，180 rpm震蕩1 h。
[0050] 4.1.1.2篩選陽(yáng)性單克隆 取震蕩后的菌液1 〇〇 μL涂布于抗性(Cm+Amp，1 %。)平板上，37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。 [00511 4.1.1.3活化及擴(kuò)大培養(yǎng) 4.1.1.4 發(fā)酵 取擴(kuò)培后的菌液按1%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°c，180 rpm震蕩，直至0D6Q()達(dá)到 0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。
[0052] 4.1.1.5 產(chǎn)物檢測(cè) 產(chǎn)物采用氣相色譜檢測(cè)，其中異戊二烯的檢測(cè)條件為:氣化室：100°C;檢測(cè)器:50°C ;柱 溫 50°C 恒溫，Rt~1.8min(圖 4)。
[0053]如圖4所示，異戊二烯的出峰時(shí)間在2min左右，其分子式是C5H8,是一種共輒二烯 烴。發(fā)酵結(jié)果見圖11。由圖11可知，HPAC預(yù)處理花生殼后發(fā)酵異戊二烯產(chǎn)量高于爆破預(yù)處理 發(fā)酵異戊二烯產(chǎn)量，但是低于葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)量，并且脫毒后異戊二烯產(chǎn)量要高于未脫毒產(chǎn) 量，尤其是采用活性炭脫毒。因此，HPAC法更適合用于預(yù)處理花生殼發(fā)酵產(chǎn)異戊二烯，活性 炭脫毒要優(yōu)于其他兩種脫毒方法。
[0054] 4.1.2 α-蒎烯的發(fā)酵 4.1.2.1質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化 分別取質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS2-Pt3〇(Yang et al. Biotechnology for Biofuels 2013, 6:60)和所述pTrc-low各5μ1然后加入到E.coli的感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，然后冰 浴30min，熱擊90 s，冰浴5 min，加入450 μL無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基，放入37°C搖床中，180 rpm震蕩lh。
[0055] 4.1.2.2篩選陽(yáng)性單克隆 取震蕩后的菌液1 〇〇 μL涂布于抗性(Cm+Amp，1 %。)平板上，37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。 [0056] 4.1.2.3活化及擴(kuò)大培養(yǎng) 4.1.2.4 發(fā)酵 取擴(kuò)培后的菌液按1%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，180 rpm震蕩，直至OD600達(dá)到 0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。
[0057] 4.1.2.5 產(chǎn)物檢測(cè) 產(chǎn)物采用氣相色譜檢測(cè)。
[0058] α-蒎烯的檢測(cè)條件為:氣化室:200°C ;檢測(cè)器:200°C ;柱溫:50°C保溫0.5min，然后 以 4°C/min 升溫至 70°C，再以 20°C/min 升溫至 250°C，保溫 10min，Rt ~3.5min(圖 5)。
[0059] 如圖5所示，α-蒎烯的出峰時(shí)間在3.5min左右，其分子式是C1QH16。發(fā)酵結(jié)果見圖 12。由圖12可知，以活性炭脫毒后的HPAC預(yù)處理花生殼酶解液為碳源發(fā)酵α-蒎烯產(chǎn)量高于 未脫毒產(chǎn)量，但是低于葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)量。
[0060] 4.1.3 β-蒎烯的發(fā)酵 4.1.3.1質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化 分別取質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS2-QH6(馮紅茹等，生物工程學(xué)報(bào)，2015，13(l) :28- 35)和所述pTrc-low各5μ1然后加入到E. coli的感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)中，然后冰浴30min， 熱擊90 s，冰浴5min，加入450 μL無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基，放入37°C搖床中，180rpm震蕩lh。 [0061 ] 4.1.3.2篩選陽(yáng)性單克隆 取震蕩后的菌液1 〇〇 μL涂布于抗性(Cm+Amp，1 %。)平板上，37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。 [0062] 4.1.3.3活化及擴(kuò)大培養(yǎng) 4.1.3.4 發(fā)酵 取擴(kuò)培后的菌液按1%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，180rpm震蕩，直至0D6QQ達(dá)到 0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。
[0063] 4.1.3.5 產(chǎn)物檢測(cè) 產(chǎn)物采用氣相色譜檢測(cè)。
[0064] β-蒎烯的檢測(cè)條件為:氣化室:200°C ;檢測(cè)器:200°C ;柱溫:50°C保溫0.5min，然后 以4°C/min升溫至70°C，再以20°C/min升溫至250°C，保溫10 min，Rt~5min(圖6)。
[0065] 如圖6所不，β-薇稀的出峰時(shí)間在3 .Omin左右，其分子式是CioH16,為α-薇稀的同分 異構(gòu)體。發(fā)酵結(jié)果見圖13。由圖13可知，以活性炭脫毒后的HPAC預(yù)處理花生殼酶解液為碳源 發(fā)酵β-蒎烯產(chǎn)量高于未脫毒產(chǎn)量，但是低于葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)量。
[0066] 以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí) 施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或替 換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特征在于它包括以下 步驟： (1) 預(yù)處理:對(duì)花生殼進(jìn)行爆破法預(yù)處理或者HPAC法預(yù)處理； (2) 酶解:對(duì)預(yù)處理后的花生殼粉碎，過(guò)篩;再將花生殼粉末置于檸檬酸鈉緩沖液中，并 加入疊氮化鈉;然后再加入纖維素酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解處理； (3) 脫毒:對(duì)酶解液進(jìn)行活性炭脫毒處理、乙酸乙酯萃取方法脫毒處理或者亞硫酸鈉脫 毒處理； (4) 利用酶解液發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物:將帶有生產(chǎn)異戊二烯、α-蒎烯或β-蒎烯的 基因的質(zhì)粒和pTrc-low共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組菌株，將其擴(kuò)培后的菌液 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)制得類異戊二烯化合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟（1)中HPAC法預(yù)處理為：用HPAC溶液在70°C_80°C的條件下處理洗凈風(fēng)干 的花生殼，所述花生殼與HPAC溶液的質(zhì)量比濃度為10%-20%，然后過(guò)濾分離獲得處理液和花 生殼，并用流水清洗分離后的花生殼直至清洗液PH為中性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中將花生殼粉末以質(zhì)量體積比為1%-10%的濃度置于PH為4.8的50 mM 的檸檬酸鈉緩沖液中，加入疊氮化鈉使其w/v終濃度為0.01%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中加入纖維素酶和木聚糖酶，使其終濃度分別為30 -40PFU/g和300 -350IU/ml，然后置于37°C的旋轉(zhuǎn)容器中酶解48 h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟(3)中將活性炭按照質(zhì)量體積比為1%-5%的比例加入到酶解液中，震蕩，離 心后過(guò)濾，取上清。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟(3)中按照酶解液與乙酸乙酯1:1-1:5的體積比萃取，收集水相即為脫毒 后的酶解液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述步驟(3)中向酶解液中加入亞硫酸鈉，使其最終濃度達(dá)到lmmol/L-5 mmol / L，在150 r /min、30°C下處理后得到脫毒后的酶解液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于所述異戊二稀的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-Isp4和pTrc-low共轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到 0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述α-蒎烯的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS 2-Pt3〇和pTrc-low共轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到 0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用花生殼降解糖發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，其特 征在于:所述β-蒎烯的發(fā)酵方法為:將質(zhì)粒pACY-MVAE-MVAS-GPPS 2-QH6和pTrc-low共轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌中構(gòu)建重組菌株，取擴(kuò)培后的菌液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至0D6Q()達(dá)到 0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mM，然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)為30°C、180 rpm震蕩培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12P5/02GK105838741SQ201610136973
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月11日
【發(fā)明人】楊建明, 王蘇蒙
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)