一種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生四烯酸（ARA)是一種人體必需的ω-6型多不飽和脂肪酸。ARA不僅作為一種 重要的結(jié)構(gòu)脂類(磷脂）廣泛存在于哺乳動(dòng)物的器官，肌肉和血液組織中，而且還是許多具 有特殊活性的二十碳酸衍生物的直接前體，ARA的藥學(xué)價(jià)值，營(yíng)養(yǎng)保健功能卓越，已在醫(yī)藥、 食品、飼料等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
[0003] 高山被孢霉（iforiiereBa 是生產(chǎn)ARA最有潛力的菌株之一，但在研究過(guò) 程中發(fā)現(xiàn)，油脂中ARA產(chǎn)量和占總脂肪酸的百分含量較低，使之成為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn) ARA的技術(shù)瓶頸之一。利用傳統(tǒng)的生物工程技術(shù)，如誘變選育以及發(fā)酵過(guò)程控制等，都無(wú)法 對(duì)ARA生物合成代謝途徑進(jìn)行有效的調(diào)控從而突破該瓶頸難題。通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)高山 被孢霉進(jìn)行分子改造，定向選育ARA高產(chǎn)菌株，是提高ARA發(fā)酵生產(chǎn)水平和在總油脂的含量 的有效途徑，而構(gòu)建原生質(zhì)體是進(jìn)行以上研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備高山被孢霉原生質(zhì)體的酶解液。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種制備高山被孢霉原生質(zhì)體的酶解液，由活性酶、滲透壓穩(wěn)定劑和水組成，其特征在 于：其活性酶的混合比為：300?375U/ml的纖維素酶、15?20mg/ml的蝸牛酶和2500? 5000U/ml的溶菌酶。
[0007] -種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟：將活化后的高山被孢霉接 種在液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)收集菌絲體并洗滌干凈；在菌絲體中加入無(wú)菌酶解液及滲透 壓穩(wěn)定劑，充分酶解后去除菌絲體碎片，收集洗滌得到原生質(zhì)體；其中，酶解液的組成如上 所述。
[0008] 進(jìn)一步的，菌株在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為15?20h。
[0009] 進(jìn)一步的，菌株的酶解步驟為：按Ig濕菌體中加入酶液5ml的比例將菌絲體與酶 解液混合；酶解液中，纖維素酶的酶活為300?375U/ml、蝸牛酶的酶活為15?20mg/ml、溶 菌酶的酶活為2500?5000U/ml。
[0010] 進(jìn)一步的，酶解液的滲透壓穩(wěn)定劑為NaCl，其在酶解液中的濃度為0. 7?0. 9 mol/L 。
[0011] 進(jìn)一步的，酶解液的滲透壓穩(wěn)定劑為0.8 mol/L的NaCl。
[0012] 進(jìn)一步的，酶解的溫度為29?35°C，酶解時(shí)間為1. 5?6小時(shí)。
[0013] 進(jìn)一步的，酶解的溫度為30?32°C，酶解時(shí)間為2?4小時(shí)。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的酶解液，可以商效地酶解商山被抱霉菌絲體的細(xì)胞壁，制備得到商品質(zhì)的商 山被孢霉原生質(zhì)體。
[0015] 本發(fā)明提供了一種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法，通過(guò)本發(fā)明能夠獲得較高得 率的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)5. 5X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0017] 以下實(shí)驗(yàn)所用蝸牛酶購(gòu)自sigma公司。
[0018] 高山被袍霉菌絲體的活化： 將高山被袍霉(本實(shí)驗(yàn)室保藏)接種到斜面PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一周后，用無(wú)菌水制備孢 子懸液，稀釋至IO8個(gè)孢子/ml，備用。
[0019] 實(shí)施例1: 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)15?16h，3000r /min離心收集菌絲，并用無(wú)菌水與滲透劑各洗漆兩 次，供制備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，300U/ml的纖維素酶、15mg/ml 的蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整 pH5. 8 ;經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，30°C下溫育并輕輕振蕩，酶解4小 時(shí)后用四層高級(jí)擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定劑懸 浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)。得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)5. 5X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
[0020] 實(shí)施例2: 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)15?16h，3000r /min離心收集菌絲，并用無(wú)菌水與滲透劑各洗漆兩 次，供制備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，300U/ml的纖維素酶、15mg/ml 的蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整 pH5. 8 ;經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，35°C下溫育并輕輕振蕩，酶解4小 時(shí)后用四層高級(jí)擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定劑懸 浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)。得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)4. 4X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
[0021] 實(shí)施例3: 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，3000r /min離心收集菌絲，并用無(wú)菌水與滲透劑各洗漆兩次，供制 備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，375U/ml的纖維素酶、20mg/ml 的蝸牛酶和5000U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整 pH5. 8 ;經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，30°C下溫育并輕輕振蕩，酶解4小 時(shí)后用四層高級(jí)擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定劑懸 浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)。得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)4. 6X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
[0022] 實(shí)施例4: 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)20h，3000r /min離心收集菌絲，并用無(wú)菌水與滲透劑各洗漆兩次，供制 備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，300U/ml的纖維素酶、15mg/ml 的蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整 pH5. 8 ;經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過(guò)濾除菌，保存于4°C冰箱備用；