一種高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋微生物的應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種海洋類酵母菌SD301菌株及利 用其高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角鯊烯（squalene)是一種脂質(zhì)不皂化物，其化學(xué)名稱為2, 6, 10, 15, 19, 23-六甲 基-2, 6, 10, 14, 18, 22-二十四碳六烯，屬開(kāi)鏈三萜，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD)活 性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能,是一種無(wú)毒 性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質(zhì)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、化妝品、食品等各 個(gè)領(lǐng)域。目前角鯊烯的來(lái)源主要是魚(yú)油，尤其是鯊魚(yú)肝油。但隨著漁業(yè)資源的日益枯竭及 相關(guān)法規(guī)的日臻完善，促使人們努力尋找其它的角鯊烯來(lái)源，如從橄欖油、棕櫚油、其他油 類作物，或者從莧屬植物、種籽、米糠、小麥胚芽中進(jìn)行提取分離，但角鯊烯在植物中含量極 低，大約以重量計(jì)算占比為0. 1到0. 7%。
[0003] 另一種替代方案是利用微生物發(fā)酵的方法來(lái)生產(chǎn)角鯊烯。如專利CN102787074 A、 CN 103748212 A公布了一株產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌株其干菌體中角鯊烯的質(zhì)量百分含量為 1% ;專利CN 102666837 A利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)出角鯊烯質(zhì)量含量占胞內(nèi)總脂質(zhì)的2% ; 而專利CN 103266137 B則利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)角鯊烯。但是這些專利共同的缺陷是 單位發(fā)酵體積內(nèi)角鯊烯的產(chǎn)量都遠(yuǎn)低于lg/L。在文獻(xiàn)報(bào)道中，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯 的產(chǎn)率則更低，如破囊壺菌ACEM 6063菌株角鯊烯產(chǎn)量大約為0. 1毫克/克生物量（參見(jiàn)勒 維斯等人《新生物技術(shù)》，2001年，第439-447頁(yè)。），而Schizochytrium mangrovei FBl菌 株的產(chǎn)量大約為〇. 162毫克/克生物量（參見(jiàn)：江等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2004年，第 52期，頁(yè)數(shù)1196至1200)，而Aurantiochytrium BR-MP4-A1菌株的產(chǎn)量大約為0. 18毫克 /克生物量（參見(jiàn)：李等人，《農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)雜志》，2009年，第57期，頁(yè)數(shù)4267至4272)， 而常等人分離到的類酵母菌Pseudozyma sp. JCC 207菌株其生產(chǎn)角S烯的能力最高，僅為 340. 52毫克/升發(fā)酵液。因此，篩選高角鯊烯產(chǎn)量的微生物是解決目前生物發(fā)酵法生產(chǎn)角 鯊烯行業(yè)關(guān)鍵瓶頸的有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0006] -種高產(chǎn)角S烯的類酵母菌，類酵母菌分類命名為類酵母菌（Pseudozyma sp.)， 已保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC No :9687,保藏日期為2014年9月19日。
[0007] -種高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌的應(yīng)用，所述類酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯中的應(yīng)用。
[0008] -種高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，以CGMCC No :9687菌株為出發(fā)菌株，在液體 培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵，分離得到菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞經(jīng)破碎、萃取、精制獲得角鯊烯。
[0009] 具體為：
[0010] ①將保存在甘油管的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，接種量3-5% (v/v)，在20-30°C， 以150-200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24-48h，獲得一級(jí)種子；
[0011] ②將一級(jí)種子接入種子培養(yǎng)基中，接種量3-5% (v/v)，在20-30°C，以150-200rpm 的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24-48h，獲得二級(jí)種子；
[0012] ③將二級(jí)種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2-10% (v/v)，通氣量0. 2_2vvm，攪拌 轉(zhuǎn)速200-800rpm，罐溫15-37°C，pH 4-9,發(fā)酵60-120h，發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯。
[0013] 上述發(fā)酵后獲得生物量為150-180g/L，角鯊烯產(chǎn)量為9-15g/L。
[0014] 所述種子培養(yǎng)基中，碳源含量為30-60g/L，氮源含量為10-20g/L，溶劑為1:1(質(zhì) 量比）的海水和蒸餾水的混合物。
[0015] 所述碳源為葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖維 素糖化液；所述氮源為有機(jī)氮源或無(wú)機(jī)氮源。
[0016] 所述有機(jī)氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷 氨酸鈉或尿素，所述無(wú)機(jī)氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。
[0017] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包含如下組分：葡萄糖20-120g/L，酵母提取物0.2-30g/ L，蛋白胨0· 2-20g/L，磷酸二氫鉀0· 5-8g/L，硫酸鎂0· 5-5g/L，海水晶5-30g/L，維生素 B13-200mg/L，維生素 B63-200mg/L，維生素 B121-50mg/L，生物素 l-50mg/L。
[0018] 所述二級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)的方式為分批發(fā)酵、補(bǔ)料-分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù) 發(fā)酵。
[0019] 所述分離方法為離心、過(guò)濾或絮凝；所述破碎方法為擠壓破壁或酶解法破壁；所 述萃取、精制步驟為利用非極性溶劑回收含角鯊烯的粗油，將所述粗油分子蒸餾得到角鯊 烯。
[0020] 所述非極性溶劑為正己烷或正己烷-乙醇的混合溶劑；所述的分子蒸餾為在 190?2 KTC和壓力5?20Pa條件下蒸出主餾分角鯊烯。
[0021] 進(jìn)一步的說(shuō)是，通過(guò)離心機(jī)（離心力4500g)分離發(fā)酵液，將質(zhì)量比為65:1的濕菌 體與蝸牛酶混合進(jìn)行破壁，之后再加入與濕菌體等體積的正己烷和等體積的乙醇，混合均 勻后靜置4小時(shí)。將上層有機(jī)相回收有機(jī)溶劑，剩余得到角鯊烯粗品。
[0022] 本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點(diǎn)和積極效果：
[0023] (1)從廣東省湛江市紅樹(shù)林水域篩選得到一株高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌菌株，該菌 株能在15°C _37°C條件下快速生長(zhǎng)，并大量積累角鯊烯。
[0024] (2)生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵時(shí)間短，角鯊烯產(chǎn)量大。在上述發(fā)酵條件下，80-100小時(shí)即 能獲得最大產(chǎn)量，獲得生物量為150_180g/L，角鯊烯產(chǎn)量為9-15g/L。
[0025] (3)產(chǎn)物純度高。在上述提取及分子蒸餾條件下，獲得的角鯊烯純度大于90%。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的類酵母菌SD301菌株在顯微鏡下的形態(tài)，a為光學(xué)顯 微鏡下觀察，b為掃描電鏡觀察；
[0027] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的類酵母菌SD301菌株角鯊烯含量分析的氣相色譜圖；
[0028] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用MEGA5軟件得到的類酵母菌SD301菌株ITS序列 的進(jìn)化樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明所得一株可高產(chǎn)角S烯的類酵母菌Pseudozyma sp. SD 301菌株，具有很好 的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0030] 實(shí)施例1 :類酵母菌對(duì)碳源的利用
[0031] 類酵母菌從廣東省湛江市紅樹(shù)林水域中篩選得到，其分類命名為類酵母菌 (Pseudozyma sp.)，實(shí)驗(yàn)室命名為類酵母菌SD301菌株，已保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，其保藏編號(hào)為 CGMCC No :9687,保藏日期2014年9月19日。
[0032] 該類酵母菌SD301菌株是圓柱形酵母狀植物性細(xì)胞，菌體長(zhǎng)約3-6um，紡錘形的孢 子在生長(zhǎng)在菌體一端（圖1)。其細(xì)胞內(nèi)具有大量角鯊烯積累，角鯊烯含量占菌體干重的質(zhì) 量比大于5% (圖2)。用分子生物學(xué)手段對(duì)其ITS區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)（圖3)，發(fā)現(xiàn)該菌株 與Pseudozyma屬的ITS序列的同源性大于99%，因此判定本菌株屬于類酵母菌，該序列記 作 SEQ ID NO. 1。
[0033]
[0034] 類酵母菌對(duì)碳源的利用
[0035] 在250ml的三角搖瓶中，配置50ml培養(yǎng)基，氮源為酵母提取物20g/L，鹽度為15， 分別加入不同的碳源（葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖 維素糖化液），濃度為60g/L，調(diào)pH值為6. 0,高壓滅菌后，接入5ml預(yù)培養(yǎng)的菌種種子液，在 空氣浴振蕩器上28°C振蕩培養(yǎng)5天，振蕩轉(zhuǎn)速為ISOrpm。離心收集菌體，冷凍干燥至恒重， 測(cè)其干重；取部分菌體，通過(guò)GC-MS測(cè)定菌體中角鯊烯的百分含量。結(jié)果見(jiàn)表1。
[0036] 表1類酵母菌SD301菌株對(duì)碳源的利用
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌，其特征在于：類酵母菌分類命名為類酵母菌 (Pseudozyma sp.)，已保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC No :9687,保藏日期為2014年9月19 曰。
2. -種權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)角鯊烯的類酵母菌的應(yīng)用，其特征在于：所述類酵母菌 在發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯中的應(yīng)用。
3. -種高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于：以CGMCC No :9687菌株為出發(fā)菌 株，在液體培養(yǎng)基中高密度發(fā)酵，分離得到菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞經(jīng)破碎、萃取、精制獲得角 鯊烯。
4. 按權(quán)利要求3所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于： ① 將保存在甘油管的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，接種量3-5% (v/v)，在20-30°C，以 150-200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)24-48h，獲得一級(jí)種子； ② 將一級(jí)種子接入種子培養(yǎng)基中，接種量3-5% (v/v)，在20-30°C，以150-200rpm的轉(zhuǎn) 速，培養(yǎng)24-48h，獲得二級(jí)種子； ③ 將二級(jí)種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2-10% (v/v)，通氣量0. 2-2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速 200-800rpm，罐溫 15-37°C，pH 4-9,發(fā)酵 60-120h，發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯。
5. 按權(quán)利要求4所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)基 中，碳源含量為30-60g/L，氮源含量為10-20g/L，溶劑為1:1(質(zhì)量比）的海水和蒸餾水的 混合物。
6. 按權(quán)利要求5所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于：所述碳源為葡萄 糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質(zhì)纖維素糖化液；所述氮源為有 機(jī)氮源或無(wú)機(jī)氮源。
7. 按權(quán)利要求4所述的高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基 中包含如下組分：葡萄糖20-120g/L，酵母提取物0. 2-30g/L，蛋白胨0. 2-20g/L，磷酸二氫 鉀 0· 5-8g/L，硫酸鎂(λ 5-5g/L，海水晶 5-30g/L，維生素 B13-200mg/L，維生素 B63-200mg/L， 維生素 B121-50mg/L，生物素 l-50mg/L。
【專利摘要】本發(fā)明涉及海洋微生物的應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種海洋類酵母菌SD301菌株及利用其高密度發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的方法。類酵母菌分類命名為類酵母菌(Pseudozyma？sp.),已保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC？No：9687，保藏日期為2014年9月19日。所述類酵母菌在發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法獲得的角鯊烯純度達(dá)到90％以上，整套工藝操作方便，降低了成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。CGMCC No.968720140919
【IPC分類】C12R1-645, C12N1-14, C12P5-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104560731
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410829522
【發(fā)明人】崔球, 宋曉金, 譚延振, 王曉龍, 馮銀剛, 李文利
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日