專利名稱：：多枝柴胡提取物及其抗菌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及中草藥多枝柴胡(BupleurumpolyclonumY.LietS.L.Pan)，具體涉及多枝柴胡的提取物及其在抗耐藥性金黃色葡萄球菌和耐藥性白色假絲酵母菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：據(jù)有關(guān)研究顯示，金黃色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌(mrsa)是引起院內(nèi)感染的多重耐藥菌。在第一個耐青霉素酶的e一內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林用于臨床治療葡萄球菌感染不久，1961年在英國發(fā)現(xiàn)了世界首例mrsa。從此，mrsa逐漸成為全世界院內(nèi)感染的主要病原菌。目前在許多國家仍在增長，mrsa幾乎對所有e-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，甚至累及到紅霉素，環(huán)丙沙星和慶大霉素。1996年在日本首次發(fā)現(xiàn)了MRSA對萬古霉素敏感性下降的菌株，即萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(VISA)。VISA的出現(xiàn)預(yù)示著萬古霉素治療葡萄球菌感染的臨床療效下降，隨之萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(VRSA)臨床株是否會分離到，成為人們監(jiān)測和關(guān)注的熱點。有研究表明，氟康唑長期應(yīng)用后不僅不良反應(yīng)增加，而且部分對多數(shù)現(xiàn)有抗真菌藥存在天然耐藥性的非白色念珠菌(如克柔念珠菌、光滑念珠菌)，以及呈現(xiàn)多重耐藥性的白色假絲酵母菌陽性檢出率增加，導(dǎo)致治療更為棘手。對HIV感染患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，氟康唑使用總劑量達(dá)到10g或長期使用氟康唑的患者發(fā)生耐藥株感染。氟康唑在治療中有誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性的作用，即使僅應(yīng)用2-3周，菌株也可呈現(xiàn)耐藥。而且目前大量預(yù)防使用氟康唑，尤其在AIDS等有長期免疫缺陷的患者中長期應(yīng)用是耐藥菌株逐步上升的主要原因之一。中草藥多枝柴胡是1984年在云南省發(fā)現(xiàn)和報道的新種柴胡，其有效成分柴胡皂苷的含量為北柴胡的23倍，紅柴胡的68倍。有關(guān)中草藥多枝柴胡的用途已引起有關(guān)研究者的關(guān)注。迄今，多枝柴胡的抗菌用途尤其是其抗耐藥性金葡菌和耐藥性白色假絲酵母菌的作用未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供中草藥多枝柴胡BupleurumpolyclonumY.LietS.L.Pan及其提取物和制備方法。本發(fā)明的另一目的是將上述多枝柴胡提取物作為藥物制劑的原料。本發(fā)明還有一個目的是提供中草藥多枝柴胡及其提取物在制備抗耐藥性金葡菌或耐藥性白色假絲酵母菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過對多枝柴胡有效成分的提取和分離，以及對各部位的抗菌藥理作用篩選，結(jié)果顯示，多枝柴胡的正丁醇提取物具有較強的抗耐藥性金葡菌和耐藥性白色假絲酵母菌的作用。本發(fā)明以下述方法制備多枝柴胡提取物。多枝柴胡根粗粉以含0.5%氨水的95%乙醇提取，提取物以石油醚脫脂，濃縮脫脂后的提取物，然后再以正丁醇和水萃取，取正丁醇層濃縮至干，得黃褐色粘稠狀固形物，即本發(fā)明多枝柴胡正丁醇提取物。本發(fā)明通過下述方法進(jìn)行多枝柴胡提取物的抗細(xì)菌和真菌的藥理作用篩選。1)應(yīng)用紙片法測多枝柴胡各提取部位的抑菌作用。菌株白色假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株(Ca,ATCC10231);金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(Sa,ATCC26003);大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)均由國家菌種收藏中心提供。方法參照美國國立臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)公布的紙片法藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。將沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱熔解后倒入無菌培養(yǎng)皿，35。C干燥20-30min后，挑取Ca(ATCC10231)及Sa(ATCC26003)3-5個菌落于生理鹽水，調(diào)節(jié)菌懸液濃度到1.0xl05/mL，在培養(yǎng)基上加入該菌懸液0.5ml，均勻涂布于，經(jīng)35。C干燥10min后分別貼上多枝柴胡提取物的藥敏片(紙片直徑為6mm，每片含藥量均為20嗎)，35'C培養(yǎng)24h-48h觀察結(jié)果，游標(biāo)尺測量抑菌圈的大小，記錄數(shù)據(jù)。每張紙片含藥20嗎。白色假絲酵母菌沙氏瓊脂平皿涂板，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平皿涂板。2)以微量稀釋法測多枝柴胡正丁醇提取物對耐藥性金葡菌或耐藥性白色假絲酵母菌的最小抑菌濃度。菌株白色假絲菌耐氟康唑(FRCA，編號為F1-F10)臨床分離株10株，由同濟(jì)醫(yī)院皮膚科真菌室分離，均經(jīng)法國美麗?？拐婢幟粼噭l鑒定為氟康唑耐藥(MIC值均^64yg/ml)。耐甲氧西林金黃色葡萄菌(MRSA，編號為M1-10)臨床分離株10株，由華山醫(yī)院抗生素研究所提供，用法國生物-梅利埃公司API鑒定系統(tǒng)鑒定，經(jīng)Sigma公司藥敏紙片及mecA基因檢測確認(rèn)其耐藥性。耐紅霉素但對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(ERSA，編號為E1-10)臨床分離株10株，由同濟(jì)醫(yī)院檢驗科提供，經(jīng)Sigma公司藥敏紙片確認(rèn)其耐藥性。1株MRSA標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC29213)由華山醫(yī)院抗生素研究所提供。培養(yǎng)基RPMI-1640液體培養(yǎng)基RPMI-1640粉(美國LifeTechnologiesInc)10.4g，三氮嗎啡丙磺酸(M0PS，F(xiàn)luka進(jìn)口分裝)34.53g，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至lOOOmL，用直徑0.2"m的無菌針頭濾器過濾除菌，置4'C冰箱備用。米勒-海頓肉湯培養(yǎng)基米勒-海頓肉湯10g，蒸餾水100ml溶解，置醫(yī)用消毒鍋內(nèi)消毒10分鐘，冷卻后備用。微量稀釋法具體步驟按照(NCCLS)M27-A推薦的酵母菌微量稀釋法操作。實驗結(jié)果顯示多枝柴胡正丁醇提取物對耐氟康唑白色假絲酵母菌，對耐紅霉素金黃色葡萄菌和耐甲氧西林金黃色葡萄菌抑菌效果明顯好。本發(fā)明的上述多枝柴胡提取物可作為抗菌類藥物制劑的原料，制成片劑、注射劑、膠囊、栓劑、緩釋劑、復(fù)方制劑等。具體實施方式實施例l1)制備多枝柴胡提取物多枝柴胡Bupleurumpolyclo畫Y.LietS.L.Pan2005年8月采自云南省會澤縣。根100g打成粗粉，用含0.5%氨水的95%乙醇600ml回流l小時，過濾，再加含0.5%氨水的95%乙醇400ml回流0.5小時，過濾；合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得浸膏(總提取物)13.6g。浸膏用95X乙醇50ml溶解后，以每次50ml石油醚萃取3次脫脂。合并脫脂后的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，再以100ml正丁醇和50ml水的混合溶液溶解，置分液漏斗中分離，重復(fù)3次，合并正丁醇層，濃縮至干，得正丁醇提取物8.15g。合并水溶液，濃縮至干，得水提取物3.02g。2)紙片法測抑菌作用參照美國國立臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)公布的紙片法藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，將沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱熔解后倒入無菌培養(yǎng)皿，35r千燥20-30min后，挑取白色加絲酵母菌及金黃色葡萄球菌3-5個菌落于生理鹽水，調(diào)節(jié)菌懸液濃度到1.0xl05/mL，在培養(yǎng)基上加入該菌懸液0.5ml，經(jīng)35。C干燥10min后分別貼上含多枝柴胡提取物的藥敏片(紙片直徑為6mm，每片含藥量均為20嗎)，35'C培養(yǎng)24h-48h觀察結(jié)果，游標(biāo)尺測量抑菌圈的大小，其中，白色假絲酵母菌沙氏瓊脂平皿涂板，金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂平皿涂板，記錄數(shù)據(jù)。3)微量稀釋法多枝柴胡提取物分別在米勒-海頓肉湯培養(yǎng)基及RPMI-1640液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一系列倍比稀釋，氟康唑在RPMI-1640液體培養(yǎng)基中進(jìn)行系列倍比稀釋，紅霉素及甲氧西林在米勒-海頓肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行系列倍比稀釋，調(diào)節(jié)接種菌為1.0xl05cfb/mL。35。C培養(yǎng)24小時，以有否沉淀出現(xiàn)判斷其最小抑菌濃度。4)實驗結(jié)果顯示多枝柴胡正丁醇提取物對耐氟康唑白色假絲酵母菌，對耐紅霉素金黃色葡萄菌和耐甲氧西林金黃色葡萄菌抑菌效果明顯好。表1是多枝柴胡各提取物紙片法的抑菌效果(抑菌圈咖)。表2是多枝柴胡正丁醇提取物微量稀釋法對耐氟康唑白色假絲酵母菌最小抑菌值(嗎/ml)。表3是多枝柴胡正丁醇提取物對耐紅霉素金黃色葡萄菌最小抑菌值(pg/ml)，(微量稀釋法)。表4是多枝柴胡正丁醇提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄菌最小抑菌值(嗎/ml)，(微量稀釋法)。表l提取物名稱白色假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株(Ca,ATCC10231)大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(Sa,ATCC26003)總提取物6.86.36.7正丁醇提取物8.28.48.3水提取物6.06.06.1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、多枝柴胡提取物，其特征在于，通過下述方法制備取多枝柴胡根粗粉加乙醇回流，減壓濃縮，以石油醚脫脂，再以正丁醇和水的混合溶液溶解，分離，減壓濃縮至干，得黃褐色粘稠狀固形物。2、權(quán)利要求1所述的多枝柴胡提取物在制備抗菌類藥物組合物中的用途。3、按權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的抗菌類藥物是抗耐氟康唑白色假絲酵母菌類藥物。4、按權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的抗菌類藥物是抗耐紅霉素金黃色葡萄菌類藥物。5、按權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的抗菌類藥物是抗耐甲氧西林金黃色葡萄菌類藥物。全文摘要本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及中草藥多枝柴胡(BupleurumpolyclonumY.LietS.L.Pan)及其提取物在制備抗菌類藥物組合物中的用途。本發(fā)明通過對多枝柴胡有效成分的提取和分離，以及對各部位的抗菌藥理作用篩選，結(jié)果顯示，多枝柴胡的正丁醇提取物具有較強的抗耐藥性金葡菌和耐藥性白色假絲酵母菌的作用。本發(fā)明的多枝柴胡提取物可作為抗菌類藥物制劑的原料，制成片劑、注射劑、膠囊、栓劑、緩釋劑、復(fù)方制劑等。文檔編號A61K36/233GK101310731SQ20071004102公開日2008年11月26日申請日期2007年5月22日優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日發(fā)明者么春艷,何晶晶,葉元康,云康,沈亮亮,潘勝利,棟董申請人:復(fù)旦大學(xué)