專利名稱:新型酵母菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種新型巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus) N0.54及其生物分子的應(yīng)用,特別是涉及調(diào)節(jié)血糖、肥胖或其相關(guān)癥狀的應(yīng)用。
背景技術(shù):
胰島分泌的胰島素是調(diào)降血液中葡萄糖濃度最重要的激素,其與肌肉細(xì)胞膜或脂肪細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合后,首先會使這些細(xì)胞發(fā)生一連串的下游信息反應(yīng)(包括活化PI3、PKC、Akt及P38MAPK等酶),進(jìn)而刺激帶有葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的囊泡往細(xì)胞膜移動,從而增加細(xì)胞膜上葡萄糖輸送 蛋白4的數(shù)量,使得這些細(xì)胞吸收葡萄糖的速度提升,達(dá)到調(diào)降血糖的效果。當(dāng)胰島無法分泌足量的胰島素或是胰島素?zé)o法使肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞發(fā)生足量的下游信息反應(yīng),造成血糖長期維持在126毫克/分升以上時(shí),身體的各個(gè)組織器官將會受到嚴(yán)重的損害,包括視網(wǎng)膜病變、腎臟病、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失、動脈粥狀硬化等,更嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)l(fā)生昏迷、死亡等情形。因此,臨床上特別定義空腹血糖高于126毫克/分升以上的病理狀況為糖尿病。糖尿病有兩種常見的形式:1型及II型糖尿病。其中,I型糖尿病是一種免疫系統(tǒng)對胰島進(jìn)行攻擊破壞的自體免疫疾病,使得患者的胰島無法分泌足量的胰島素,一般需要靠長期注射胰島素以控制體內(nèi)血糖濃度。II型糖尿病的患者一般仍具有正常分泌胰島素的能力,但因?yàn)榧∪饧?xì)胞及脂肪細(xì)胞有嚴(yán)重的胰島素抗性(Insulin resistance),因此,胰島素?zé)o法使這些細(xì)胞發(fā)生足量的下游信息反應(yīng),導(dǎo)致血糖無法降到正常值。其中,肥胖是導(dǎo)致所述胰島素抗性及II型糖尿病的重要因素,這歸因于脂肪細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子(cytokines)及趨化因子(chemokines)是引發(fā)胰島素抗性及II型糖尿病的重要原因,而肥胖者體內(nèi)的脂肪細(xì)胞顯然比一般人多出許多,因此肥胖會大幅度地提升發(fā)生胰島素抗性及II型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,50%的肥胖者將來會患有II型糖尿病,且至少有70%以上的II型糖尿病患者為過重或肥胖者,若這些過重的糖尿病患者能夠減重的話,其胰島素抗性情形將可以恢復(fù)到正?;蚪咏V?。目前II型糖尿病最佳的治療方式是飲食控制,它有助于維持血糖及正常體重。若原本的體重過重,則減重是最有效的治療方式,可使體內(nèi)的胰島素發(fā)揮更佳的降血糖功能。若減重及飲食都無法控制糖尿病時(shí),則必須遵照醫(yī)師的囑咐定期服用口服糖尿病藥物或注射胰島素。需特別說明的是,目前具備降血糖功效的藥物仍限于胰島素,缺乏替代性的藥物,其他口服糖尿病藥物僅能輔助性地增加胰島素的分泌、改善胰島素的功能、抑制糖類分解或延緩單糖類在胃腸道的吸收等。因此,當(dāng)口服糖尿病藥物配合高劑量胰島素仍無法控制血糖時(shí)(例如具有嚴(yán)重胰島素抗性的II型糖尿病患者),將沒有其他替代性的藥物可以調(diào)降血糖,僅能靠減重使胰島素抗性降低而逐漸恢復(fù)胰島素降血糖的功效,但減重對大部分的患者而言是困難的。此外,長期使用高劑量的胰島素也有其缺點(diǎn),當(dāng)長期使用高劑量胰島素卻仍無法使血糖回復(fù)正常時(shí)(例如具有嚴(yán)重胰島素抗性的II型糖尿病患者),會進(jìn)一步造成胰島逐漸喪失分泌胰島素能力的不利后果,此時(shí)即便成功地透過減重而降低病患胰島素抗性的問題,由于病患已惡化成無法自行分泌胰島素的患者,將永遠(yuǎn)失去自主調(diào)控血糖的能力。因此,有必要尋找一種具有調(diào)降血糖功效的替代性物質(zhì),可取代胰島素而達(dá)到調(diào)降血糖的效果,使I型及II型糖尿病患者有多種具備降血糖功效的物質(zhì)可供選擇。此外,有必要尋找一種物質(zhì),其能引發(fā)細(xì)胞發(fā)生一連串類似于胰島素的下游反應(yīng),而解決嚴(yán)重胰島素抗性個(gè)體的血糖不受胰島素調(diào)節(jié)的問題。再者,有必要尋找一種能有效達(dá)到減肥效果的物質(zhì),使II型糖尿病患者的胰島素抗性情形降低,讓II型糖尿病患者回復(fù)到可以有效地、自主地調(diào)降血糖的狀態(tài)。
發(fā)明內(nèi)容
鑒于糖尿病患者對于新型降血糖物質(zhì)的需要,本發(fā)明的目的在于提供一種酵母菌菌株或其衍生的活性物質(zhì),其具有調(diào)降血糖的功效,可取代胰島素作為調(diào)降I型及II型糖尿病患者血糖的治療物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的 在于提供一種酵母菌菌株或其衍生的活性物質(zhì),其能引發(fā)細(xì)胞發(fā)生類似于胰島素的下游反應(yīng),而適用于具有胰島素抗性的個(gè)體作為調(diào)降血糖的物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種酵母菌菌株或其衍生的活性物質(zhì),其使得具有胰島素抗性的個(gè)體的血糖值下降,避免個(gè)體長期處于高血糖的狀況下而發(fā)生永遠(yuǎn)無法分泌胰島素的不利后果。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種酵母菌菌株,具有調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效,利于II型糖尿病患者改善其胰島素抗性情形。本發(fā)明提供一種分離的酵母菌株,巴斯德酵母菌N0.54 (Saccharomycespastorianus N0.54),其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期2011年12月31日,保藏編號 CCTCC M 2011496。根據(jù)上述發(fā)明,其特征在于具有調(diào)節(jié)血糖的功效。根據(jù)上述發(fā)明,其特征在于藉由所述酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ IDNO:1的蛋白質(zhì)達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其特征在于藉由所述酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ ID N0:1的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。本發(fā)明提供一種衍生酵母菌株,其為上述發(fā)明所述酵母菌株的衍生突變體,其特征在于所述衍生酵母菌株具有調(diào)節(jié)血糖的功效。根據(jù)上述發(fā)明,其為藉由所述衍生酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其特征在于藉由所述衍生酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ ID NO:I的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。根據(jù)上述發(fā)明,其特征在于具有調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效。本發(fā)明提供一種菌體提取物組合物,其包含上述發(fā)明所述酵母菌株的菌體提取物或所述酵母菌株的衍生突變體的菌體提取物中的至少任一種,其特征在于,具有調(diào)節(jié)血糖或調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效中的至少任一種。本發(fā)明提供一種純化菌體提取物組合物,其為由上述發(fā)明所述菌體提取物組合物,再進(jìn)一步純化而制得,其特征在于具有調(diào)節(jié)血糖或調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效中的至少任一種。本發(fā)明提供一種純化或人工合成的蛋白質(zhì),其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。根據(jù)上述發(fā)明,其為具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì);或者,其調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。本發(fā)明提供一種重組蛋白質(zhì),其氨基酸序列為SEQ ID NO:1中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)刪除、添加或取代后所衍生的序列,其特征在于所述重組蛋白質(zhì)為具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)。根據(jù)上述發(fā)明,其調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。本發(fā)明提供一種經(jīng)分離或人工合成的核酸分子,其編碼包含氨基酸序列為SEQ IDNO: I的蛋白質(zhì)。根據(jù)上述發(fā)明,其中所述氣基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其中所述氨基酸序列 為SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。本發(fā)明提供一種重組核酸分子,其為將上述發(fā)明所述的經(jīng)分離或人工合成的核酸分子進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、刪除或添加后所衍生的衍生核酸分子,其特征在于所述重組核酸分子編碼包含具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)。根據(jù)上述發(fā)明,其中所述具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到所述調(diào)節(jié)血糖的功效。
圖1:菌體提取物經(jīng)柱分離后,各段收集液對分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞吸收葡萄糖的影響的柱形圖。圖2:菌體提取物經(jīng)柱分離后,其中的DWl收集液的蛋白質(zhì)凝膠電泳分析圖。圖3:分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)所述分子量為54kDa的蛋白質(zhì)處理后,細(xì)胞上各種信息分子變化量的柱形圖。圖4:分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)所述54kDa的蛋白質(zhì)處理后,細(xì)胞膜上葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)變化量的蛋白質(zhì)印記分析圖。
具體實(shí)施例方式鑒于現(xiàn)有技術(shù)的局限性及缺陷,本發(fā)明提供了一種酵母菌菌株,即巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)N0.54的酵母菌菌株或其衍生突變體(其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號CCTCCM2011496,保藏日期為2011.12.31,保藏中心地址為中國武漢市武昌珞珈山),其具有調(diào)節(jié)血糖的功效,且能有效地調(diào)節(jié)II型糖尿病個(gè)體的血糖。此夕卜,所述菌株也具有調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效。
以下提供了利用本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)說明書、本發(fā)明的技術(shù)及特點(diǎn),然而,所述實(shí)施例并非用以限定本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),當(dāng)可作各種改動與修飾。實(shí)施例1:制備具調(diào)節(jié)血糖、肥胖或其相關(guān)癥狀功效的酵母菌菌株及其菌體提取
將Saccharomyces pastorianus N0.54接種至麥芽提取物液體培養(yǎng)基(maltextract broth,MEB,購自Difico Labotories)中,于25°C培養(yǎng)48小時(shí)。以同樣方式進(jìn)行第二次活化后,將活化的Saccharomyces pastorianus N0.54接種于所述麥芽提取物液體培養(yǎng)基,菌液濃度為105CFU/mL。20°C、150rpm振蕩培養(yǎng)4天。離心,以二次去離子水將下層菌體清洗三次后,收集該菌體。將離心后的濕菌體置于三角錐型瓶中,以0.1N NH4OH于30°C、IOOrpm條件下提取酵母菌活性物質(zhì)2小 時(shí),再經(jīng)冷凍干燥,所得的粉末即為酵母菌菌體提取物。實(shí)施例2:制備STZ誘導(dǎo)的II型糖尿病大鼠將雄性Sprague-Dawley(SD)品系的大鼠分只飼養(yǎng)于不銹鋼籠中,動物房的溫度維持在23 ± I °C,濕度則維持在40-60 %。每日的光照周期為12小時(shí),飼料與蒸餾水自由攝食。大鼠飼養(yǎng)至平均重量為300g時(shí),以煙堿(nicotinamide, 230mg/kg體重)和鏈脲佐菌素(STZ,65mg/kg體重,檸檬酸鹽緩沖液中,pH 4.6)將其誘導(dǎo)成II型糖尿病大鼠,一周后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(Oral Glucose Tolerance Test, 0GTT),以評估是否產(chǎn)生II型糖尿病癥狀。經(jīng)確認(rèn)產(chǎn)生糖尿病癥狀后的大鼠即為STZ誘導(dǎo)的II型糖尿病大鼠。實(shí)施例3:制備分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞以補(bǔ)充了 10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM(購自Gibco,含10 μ g/mL胰島素、I μ MDEX及0.5mM IBMX)培養(yǎng)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞株(細(xì)胞株編號為BCRC60159,購自財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及菌種中心,新竹,臺灣)8天,使其分化成小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞。利用Oil-Red-O染色劑(配方為0.3% Oil-Red-O,60%異丙醇)在室溫下避光染色30分鐘,以確認(rèn)該細(xì)胞是否已成為分化的小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞。實(shí)施例4:菌體提取物對II型糖尿病大鼠空腹血■糖及胰島素濃度的影響請參見下列表1,其為STZ誘導(dǎo)的II型糖尿病大鼠經(jīng)喂食酵母菌菌體提取物6周后的空腹血糖及胰島素濃度測試結(jié)果。其中,血糖的測試方式為:將IOyL血漿與葡萄糖酶促試劑盒(Cat.N0.GL 2623,Randox)中的試液混合,于37°C作用5分鐘后,以分光光度計(jì)測量其在500nm的吸光值。比對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,即可換算出血漿中的葡萄糖濃度。此外,胰島素濃度的測試方式為:取25 μ L血漿,以大鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia AB, Sweden)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并利用 ELISA 讀數(shù)儀(μ Quant, BIO-TEK, U.S.A)讀取其在450nm的吸光值。比對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,即可換算出血漿中的胰島素濃度。糖尿病對照組的空腹血糖為220.65±20.88mg/dL,顯著高于正常對照組空腹?fàn)顟B(tài)的血糖192.73±18.56mg/dL(p < 0.05)。經(jīng)喂食酵母菌菌體提取物6周的糖尿病大鼠(即酵母菌體提取物組),其空腹血糖為194.47±21.02mg/dL,顯著低于糖尿病對照組的空腹血糖(P < 0.05),且與正常對照組無顯著差異,表明酵母菌菌體提取物有助于調(diào)降糖尿病個(gè)體的血糖達(dá)正常值。在大鼠空腹血漿的胰島素濃度方面,糖尿病對照組的空腹胰島素濃度為2.10±0.72mg/L,顯著高于正常對照組的空腹胰島素濃度1.44±0.65mg/L(p
<0.05)。經(jīng)喂食酵母菌菌體提取物6周后的糖尿病大鼠,其空腹胰島素濃為1.28±0.55mg/L,顯著降低其胰島素濃度約達(dá)39% (P < 0.05),并與正常對照組無顯著差異。以上結(jié)果顯示,經(jīng)喂食酵母菌菌體提取物6周能顯著調(diào)降糖尿病大鼠的高血糖及高胰島素達(dá)正常值。表I
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)分離的酵母菌株,巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)N0.54,其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號CCTCC M 2011496。
2.如權(quán)利要求1所述的酵母菌株,其特征在于具有調(diào)節(jié)血糖的功效。
3.如權(quán)利要求2所述的酵母菌株,其特征在于藉由所述酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQIDN0:1的蛋白質(zhì)達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其特征在于藉由所述酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。
4.一種衍生酵母菌株,其為權(quán)利要求2所述酵母菌株的衍生突變體,其特征在于所述衍生酵母菌株具有調(diào)節(jié)血糖的功效。
5.如權(quán)利要求4所述的衍生酵母菌株,其系藉由所述衍生酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQID N0:1的蛋白質(zhì)達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其特征在于藉由所述衍生酵母菌株產(chǎn)生的序列為SEQ ID NO:1的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。
6.如權(quán)利要求1所述的酵母菌株或其衍生酵母菌株,其特征在于具有調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效。
7.一種菌體提取物組合物,其包含權(quán)利要求1所述的酵母菌株的菌體提取物或所述酵母菌株的衍生突變體的菌體提取物中的至少任一種,其特征在于,具有調(diào)節(jié)血糖或調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效中的至少任一種。
8.—種純化菌體提取物組合物,其由權(quán)利要求7所述的菌體提取物組合物,再進(jìn)一步純化而制得,其特征在于具有調(diào)節(jié)血糖或調(diào)節(jié)肥胖或其相關(guān)癥狀的功效中的至少任一種。
9.一種純 化或人工合成的蛋白質(zhì),其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
10.如權(quán)利要求9所述的純化或人工合成的蛋白質(zhì),其為具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì);或者,其調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。
11.一種重組蛋白質(zhì),其氨基酸序列為SEQ ID NO:1中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸經(jīng)刪除、添加或取代后所衍生的序列,其特征在于所述重組蛋白質(zhì)為具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的重組蛋白質(zhì),其調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。
13.—種經(jīng)分離或人工合成的核酸分子,其編碼包含氨基酸序列為SEQ IDNO:1的蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的經(jīng)分離或人工合成的核酸分子,其中所述氨基酸序列為SEQID NO:1的蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)血糖的功效;或者,其中所述氣基酸序列為SEQ ID N0:1的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,以達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的功效。
15.一種重組核酸分子,其為將權(quán)利要求13所述的經(jīng)分離或人工合成的核酸分子進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、刪除或添加后所衍生的衍生核酸分子,其特征在于所述重組核酸分子編碼包含具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)。
16.如權(quán)利要求15所述的重組核酸分子,其中所述具有調(diào)節(jié)血糖的功效的蛋白質(zhì)調(diào)控目標(biāo)個(gè)體細(xì)胞膜上的葡萄糖輸送蛋白4(GLUT4)的含量或胰島素受體的含量,達(dá)到所述調(diào)節(jié)血糖 的功效。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離的巴斯德酵母菌No.54,所述巴斯德酵母菌具有調(diào)節(jié)血糖、肥胖或其相關(guān)癥狀的功效,有助于調(diào)控I型糖尿病的高血糖或同時(shí)調(diào)控II型糖尿病的高血糖及肥胖等兩項(xiàng)高危險(xiǎn)因數(shù)。
文檔編號A61P3/10GK103215194SQ20121002215
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者蔡國珍, 吳建輝 申請人:蔡國珍