一種可在堿性條件下高效預(yù)處理木質(zhì)素原料的云芝栓孔菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境與新能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可在堿性條件下預(yù)處理木質(zhì)素 原料的云芝栓孔菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 木質(zhì)纖維素是一種可再生資源并且是地球上最豐富的有機(jī)物之一。我國的木質(zhì)纖 維素原料非常豐富，每年僅農(nóng)作物秸桿就有7億多噸，加上數(shù)量巨大的林業(yè)纖維廢料和工 業(yè)纖維廢渣，每年可利用的木質(zhì)纖維原料總量可達(dá)20億噸以上。因此，木質(zhì)纖維素在生物 材料領(lǐng)域和生物能源領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價值。
[0003] 木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素這三種成分組成，其中木質(zhì)素約占 15% -30 %左右。木質(zhì)素本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，不含易水解的單元，是公認(rèn)的最難以化學(xué) 和生物降解的天然高聚物之一。在木質(zhì)纖維素中，木質(zhì)素以一種物理屏障存在，緊密地包裹 在纖維素和半纖維素的外面，成為許多工業(yè)化過程中有效利用木質(zhì)纖維素材料的一個主要 障礙。因此，木質(zhì)素的降解是能否有效利用木質(zhì)纖維素原料的關(guān)鍵。目前針對木質(zhì)纖維素原 料中的木質(zhì)素的去除或者降解主要有三種方法：物理法、化學(xué)法及生物法等。物理法主要包 括機(jī)械粉碎法、高溫液態(tài)水法等，這些方法一般都需要高溫高壓條件及較高的能耗，對條件 要求比較苛刻、對設(shè)備要求也比較高，很難被真正應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)?；瘜W(xué)法主要包括酸（如 硫酸、鹽酸及一些有機(jī)酸等）、堿預(yù)處理法包（包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等）等，因?yàn)槌?本低廉，因此化學(xué)法是目前實(shí)際應(yīng)用中最常用的方法，但化學(xué)法一般對設(shè)備要求比較高、容 易引起環(huán)境污染、發(fā)酵前需要用大量的酸堿中和、易產(chǎn)生發(fā)酵抑制劑等。生物法是是從20 世紀(jì)20年代起開始研宄的，采用降解木質(zhì)素的微生物在培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生分解的酶類， 從而可以專一性降解木質(zhì)素，除去木質(zhì)素以解除其對纖維素的包裹作用。此法具有作用條 件溫和、能耗低、專一性強(qiáng)，不存在環(huán)境污染，處理成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。?是，目前生物法預(yù)處理木質(zhì)纖維素存在木質(zhì)素降解微生物種類少，降解條件苛刻，木質(zhì)素降 解酶類的酶活力低，作用周期長等問題。
[0004] 從目前已有的報道來看，大部分的木質(zhì)素降解菌降解木質(zhì)素都是在酸性或者中性 條件下進(jìn)行的，最適PH范圍都在3. 0-7. 0之間，而在堿性條件下利用微生物進(jìn)行木質(zhì)纖維 素的預(yù)處理還未見報道。由于木質(zhì)素本身具有在堿性條件下溶解性較高的生理學(xué)特性，因 此利用嗜堿性微生物在溫和堿性條件下預(yù)處理木質(zhì)纖維素，微生物對木質(zhì)素的降解作用與 堿性條件對木質(zhì)素的溶解作用有望形成協(xié)同效應(yīng)，從而提高降解效率，縮短作用周期。
[0005] 利用嗜堿性微生物在溫和堿性條件下進(jìn)行木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理將能很好地 解決生物預(yù)處理所遇到的效率低、周期長等問題。這主要基于以下幾個方面的原因：（1)在 堿性條件下，微生物在預(yù)處理木質(zhì)纖維素時，不容易被染雜菌，能減少纖維素和半纖維素的 損失；（2)反應(yīng)條件相對溫和（常溫常壓條件）且成本較低，可以采用低濃度并且可重復(fù)利 用的堿性物質(zhì)如堿石灰或者氨水調(diào)節(jié)PH ; (3)最重要的是木質(zhì)素本身具有在堿性條件下溶 解性較高的生理學(xué)特性，因此微生物對木質(zhì)素的降解與堿性條件木質(zhì)素的溶解作用，有望 形成協(xié)同效應(yīng)，提高降解效率，縮短作用周期。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種在堿性條件下高效預(yù)處理木質(zhì)素原料的新菌種： 云芝栓孔菌（Trametes versicolor)T_4。該菌于2014年09月02日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中 國科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號：CGMCC No. 9582。
[0007] 對菌株的形態(tài)特征觀察：菌落白色，絨毛狀，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，在適宜的瓊脂培養(yǎng) 基上長時間培養(yǎng)不形成完整的子實(shí)體，能夠形成菌管。菌絲管狀透明，有明顯的鎖狀聯(lián)合。 擔(dān)孢子短圓柱形，無色，薄壁，光滑。
[0008] 用真菌DNA提取試劑盒提取云芝栓孔菌（Trametes versicolor)的全基 因，然后以提取的基因?yàn)槟０澹酝ㄓ靡颪Sl :5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3' ；NS4 : 5' -CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3' 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，T-4 的 18S rDNA 序列如 SEQ ID NO :1 所示。 將獲得的序列提交NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)進(jìn)行Megablast，獲取同源性高的相關(guān) 序列，用ClustalX軟件進(jìn)行比對，Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹。根據(jù)18S rDNA序列所作的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。擴(kuò)增得到1.7kbp的基因序列，在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，T-4與Trametes versicolor (AY705965. 1) 的同源性為99%，T-4為云芝栓孔菌的新菌株，將其命名為云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4, GenBank 接受號為 KP208683。
[0009] 對云芝檢孔菌（Trametes versicolor) T-4的研宄表明：在喊性條件下，15天內(nèi)對 甘蔗渣中木質(zhì)素的降解率達(dá)到34. 7%，并且其致密結(jié)構(gòu)基本被完全破壞；15天內(nèi)對玉米秸 桿中木質(zhì)素的降解率達(dá)到28. 3%，并且其致密結(jié)構(gòu)基本被完全破壞。因此，本發(fā)明的第二個 目的是提供云芝栓孔菌（Trametes versicolor)T-4在堿性條件下預(yù)處理木質(zhì)素原料的應(yīng) 用。
[0010] 所述的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4在堿性條件下預(yù)處理木質(zhì)素原料 的應(yīng)用，具體預(yù)處理方法包括以下步驟：
[0011] (1)、在堿性條件下制備云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4作為降解木質(zhì)素 的接種物；
[0012] (2)、往木質(zhì)纖維素原料中加入步驟（1)制備的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4接種物，靜置培養(yǎng)，定期取樣測定木質(zhì)纖維素原料中各成分變化情況。
[0013] 優(yōu)選，步驟⑴的制備方法為：將云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4從斜面 挑取一小塊接入于PDA固體培養(yǎng)基平板上，28-35?靜置培養(yǎng)120h，即得到堿性條件下預(yù)處 理木質(zhì)纖維素原料的接種物。
[0014] 本發(fā)明中的用于預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的配制方法為：稱取一定重量的粉碎至 60?80目左右的木質(zhì)纖維素原料，然后按質(zhì)量比1:2?1:6加入pH8.0?11.0的堿性營 養(yǎng)液，混合均勻后，在溫度121°C條件下，滅菌20分鐘，冷卻后備用。
[0015] 所述的堿性營養(yǎng)液的制備方法為：分別稱量NH4NO3 I. 5g，K2HPO4 lg，KH2PO4 I. 2g， MgSO4O. 2g，CaCl2 (λ lg，F(xiàn)eSO4 (λ 05g，MnSO4 (λ 02g，以蒸餾水定容至 1L，然后用 NaOH 調(diào)節(jié) pH值到8?11之間。
[0016] 步驟（2)所述的加入步驟（1)制備的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4接種 物，優(yōu)選方法為：用滅過菌的打孔器將平板內(nèi)長滿菌絲的固體培養(yǎng)基切成約直徑〇. 5mm大 小的塊狀，每Ig木質(zhì)纖維素原料降解底物接入2塊。
[0017] 所述的PDA固體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)培養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明提供了一種在堿性條件下高效預(yù)處理木質(zhì)素原料的新菌種：云芝栓孔菌 (Trametes versicolor) T-4,能夠解決木質(zhì)纖維素原料生物預(yù)處理效率低、周期長等一系 列問題，在利用木質(zhì)纖維素原料制備燃料乙醇、沼氣等方面具有很大的潛力，為實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖 維素原料的清潔、高效及低成本的預(yù)處理奠定基礎(chǔ)。
[0019] 本發(fā)明的云芝檢孔菌（Trametes versicolor) T-4于2014年09月02日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號：CGMCC No. 9582。
【附圖說明】：
[0020] 圖1為云芝檢孔菌（Trametes versicolor) T-4的18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0021] 圖2為云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4在不同pH值條件下的對甘鹿澄中 木質(zhì)素的降解率變化情況；
[0022] 圖3為經(jīng)過云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4預(yù)處理后甘鹿澄結(jié)構(gòu)變化的 環(huán)境掃描電鏡（SEM)圖，其中，A為原料預(yù)處理前掃描電鏡圖，B為原料預(yù)處理后掃描電鏡 圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。<