專利名稱：一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法。
背景技術(shù)：
按照國家標準WS3-228 (Z-047) -2003 (Z)中規(guī)定，云芝糖肽原料藥是從擔子菌綱多孔菌科真菌云芝Cov-I菌株的液體發(fā)酵菌絲體中提取得到的一種中藥，能補益精氣，健脾養(yǎng)心，對細胞免疫功能和血象有一定的保護作用，用于食管癌、胃癌及原發(fā)性肺癌患者放、化療所致的氣陰兩虛、心脾不足證。云芝糖肽的活性成分為結(jié)合蛋白多糖，國家標準規(guī)定云芝糖肽中糖含量大于等于38.0%，蛋白含量大于等于11.5%，重均分子量大于等于40kd的多糖肽含量大于等于50%。經(jīng)研究，云芝胞外糖肽也同樣具有延長壽命和增強免疫 的功效，云芝胞外提取物5g/L對果蠅的平均壽命延長了 36. 38%。目前,云芝糖肽的生產(chǎn)工藝為液體發(fā)酵法,將云芝Cov-I菌株經(jīng)過搖瓶振蕩培養(yǎng)，種子罐、繁殖罐及發(fā)酵罐的通氣培養(yǎng)后得到發(fā)酵菌液，再將發(fā)酵菌液過濾得到云芝菌絲體和發(fā)酵液。但是云芝糖肽的生產(chǎn)工藝只利用了云芝菌絲體，從中提取中藥云芝糖肽，而把含有大量同樣具有免疫活性的發(fā)酵液卻作為廢水經(jīng)過處理后被排放了，其實發(fā)酵液中含有多糖肽、酚類、植物膽固類等化合物，十八種人體所需的氨基酸和維生素VB1JB2JB6及銅、鐵、鉀、鋅等10多種人體所需的活性微量元素，如果就這樣排放了，既造成了巨大的環(huán)保壓力，又造成了不必要的資源浪費和經(jīng)濟損失。根據(jù)發(fā)明專利200710042036. 6公開的方法，為了降低重金屬含量，利用去離子水替代飲用水發(fā)酵生產(chǎn)云芝菌絲體并提取云芝糖肽，以制備重金屬含量低于國際食品衛(wèi)生標準限量(英聯(lián)邦食品衛(wèi)生標準限量鉛低于6. Oppm，汞低于O. 5ppm,鎘低于O. Ippm,鉻低于I. Oppm,鋪低于I. Oppm,銅低于150ppm,錫低于230ppm,砷低于1.4ppm。)的高品質(zhì)云芝糖肽，但是去離子水比飲用水貴，這樣就增加了云芝糖肽的生產(chǎn)成本。而且目前的云芝糖肽發(fā)酵生產(chǎn)工藝也存在著收率較低、成本較高的弊端，這也導(dǎo)致了市場上的云芝糖肽原料藥和云芝糖肽成品的價格居高不下，增加了使用者的經(jīng)濟負擔。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從生產(chǎn)云芝糖肽過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液中提取云芝胞外糖肽，避免了資源浪費和經(jīng)濟損失，而且采用本法生產(chǎn)的云芝糖肽的生產(chǎn)成本低、收率高。本發(fā)明的技術(shù)方案如下將液體發(fā)酵生產(chǎn)云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮后加入乙醇溶液并冷藏，取其沉淀物干燥。所述副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮至比重為I. 02-1. 15。在濃縮發(fā)酵液中加入80wt% -IOOwt %的乙醇溶液，并使混合液中的乙醇含量達到 70wt% -75wt% ο所述冷藏溫度為0°C -80C，冷藏時間為4-24小時。將沉淀物在溫度為60°C _80°C條件下真空干燥。將活化的云芝Cov-I菌株,經(jīng)過斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、一級液體培養(yǎng)和二級液體培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)的逐級擴大培養(yǎng)方法得到發(fā)酵菌液，再將發(fā)酵菌液過濾后得到云芝菌絲體和副產(chǎn)物發(fā)酵液。其中云芝菌絲體的收率為每升發(fā)酵菌液20g以上。所述一級液體培養(yǎng)基、二級液體培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基所使用的碳源為葡萄糖、蔗糖、玉米粉、小麥粉、淀粉或糊精中的一種或幾種；氮源為黃豆餅粉、花生餅粉或酵母粉中的一種或幾種；其無機鹽用磷酸氫二鉀、碳酸鈣或硫酸鎂中的一種或幾種；所述一級液體培養(yǎng)基的碳氮源總量為該一級液體培養(yǎng)基的3. 5% _5%，所述二級液體培養(yǎng)基的碳氮源總量為該二級液體培養(yǎng)基的 3.5% _5%，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源總量為該發(fā)酵培養(yǎng)基的6% -8%。所述每級液體發(fā)酵的接種量為該級液體發(fā)酵培養(yǎng)基的5% -10%，培養(yǎng)溫度為25 V -30°C，通氣量為O. 5v/(V · min)-I. 5v/ (v · min),發(fā)酵時間為48小時-72小時。以上云芝菌絲體發(fā)酵過程中使用的發(fā)酵用水均采用飲用水。所述云芝菌絲體經(jīng)過水提醇沉法得到云芝糖肽，包括如下步驟，(I)用重量為云芝菌絲體2-4倍量的純水清洗云芝菌絲體并過濾；用重量為云芝菌絲體3-5倍的純水于90°C _98°C溫度下提取2小時-6小時；分離得到提取液。( 2)將步驟(I)中的提取液經(jīng)減壓濃縮后采用醇沉法得到沉淀物，并取其干燥。該云芝糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液2g以上。所述步驟(2)中的醇沉法為在提取液的濃縮液中加入80wt% -95wt%乙醇溶液，并使混合液中的乙醇含量達到70wt% -75wt%，將混合液置于0°C _8°C條件下冷藏4小時-24小時并過濾，將云芝糖肽沉淀物在60°C -80°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝糖肽。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用醇沉法從生產(chǎn)云芝糖肽的副產(chǎn)物發(fā)酵液中提取具有免疫活性的云芝胞外糖肽，節(jié)約了資源，為企業(yè)獲得了經(jīng)濟收益；在采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)云芝菌絲體時，通過增加培養(yǎng)基中的碳氮總量及其碳氮比的調(diào)控，顯著提高了云芝糖肽和云芝胞外糖肽的收率，其中，云芝糖肽的收率從原來的lg/L提高至2g/L以上；本發(fā)明僅在云芝糖肽的提取階段采用純水，其他階段的水源都采用飲用水，由此生產(chǎn)得到的云芝糖肽完全符合國際食品衛(wèi)生標準，比現(xiàn)有技術(shù)公開的在發(fā)酵和提取全過程均使用去離子水更為經(jīng)濟、實惠、方便，降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明實施例II)云芝糖肽的生產(chǎn)過程取活化的云芝Cov-I菌株接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基，28°C條件下培養(yǎng)6天，得到云芝斜面菌種；將云芝斜面菌種，接種于由2%葡萄糖、4%玉米粉組成的搖瓶液體培養(yǎng)基，28°C條件下,培養(yǎng)6天,搖瓶轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘,得到云芝搖瓶菌種；取云芝搖瓶菌種2L,接種于裝有40L—級液體培養(yǎng)基的50L種子罐中，其中，一級液體菌種培養(yǎng)基含I %葡萄糖、2%玉米粉、1%糊精、1%黃豆餅粉、O. 075%硫酸鎂和O. I %磷酸氫二鉀，通氣量為O. 5v/(V ·π η)，28 條件下培養(yǎng)48小時，得云芝一級液體菌種；取云芝一級液體菌種40L，接種于裝有400L 二級液體培養(yǎng)基的I噸種子罐中，其中二級液體培養(yǎng)基由I %葡萄糖、2 %玉米粉、I %糊精、I %黃豆餅粉、O. 075%硫酸鎂和O. I %磷酸氫二鉀組成，通氣量為O. 5v/(v -min),28°C條件下培養(yǎng)48小時，得云芝二級液體菌種；取云芝二級液體菌種400L，接種于裝有4噸發(fā)酵培養(yǎng)基的5噸發(fā)酵罐中，其中發(fā)酵培養(yǎng)基含2%葡萄糖、2%玉米粉、3%糊精、1%黃豆餅粉、O. 05%硫酸鎂和O. I %磷酸氫二鉀，0-36小時通氣量為O. 5v/ (v · min)，36-72小時通氣量為I. 5v/ (v · mi n)，28°C條件下培養(yǎng)72小時，板筐壓濾，得云芝菌絲體；濾液為副產(chǎn)物發(fā)酵液。以上發(fā)酵用水均為飲用水。用重量為云芝菌絲體3倍量的純水清洗云芝菌絲體一次，板筐壓濾，用重量為云芝菌絲體4倍的純水，于98°C條件下提取4小時。板筐壓濾，將分離到的提取液于70°C條件下減壓濃縮至比重為I. 10，緩緩加入IOOwt %乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到75wt%，將混合物4°C條件下冷藏12小時，然后過濾得到云芝糖肽沉淀，70°C真空干燥，粉碎過篩， 即得云芝糖肽。2)云芝胞外糖肽的生產(chǎn)過程將液體發(fā)酵云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液于60°C減壓濃縮至比重為
1.02，緩緩加入IOOwt %乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到75wt%，將混合液在0°C條件下冷藏4小時，過濾得云芝胞外糖肽沉淀。60°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝胞外糖肽。按照重量法統(tǒng)計云芝菌絲體、云芝糖肽和云芝胞外糖肽的收率，按照國家標準WS3-228 (Z-047)-2003 (Z)進行主要質(zhì)量指標分析，按照英聯(lián)邦食品衛(wèi)生標準測定重金屬含量，結(jié)果云芝菌絲體的收率為每升發(fā)酵菌液24. 6g，云芝糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液
2.4g。云芝糖肽中糖含量為39. 8%，蛋白質(zhì)含量為24. 6%，重均分子量大于等于40Kd的占56. 7%，鉛含量為O. 222ppm，鎘含量為O. 085ppm，鉻含量為O. 760ppm，銻含量為O. 507ppm,銅含量為35. 217ppm,砷含量為O. 304ppm,汞未檢出，錫未檢出。云芝胞外糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液12. 6g。云芝胞外糖肽中糖含量為46.8%，蛋白質(zhì)含量為18.4%。實施例2I)云芝糖肽的生產(chǎn)過程取活化的云芝Cov-I菌株接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基中，28°C條件下培養(yǎng)7天，得云芝斜面菌種；將云芝斜面菌種，接種于由I. 5%葡萄糖、4%玉米粉組成的搖瓶液體培養(yǎng)基，25°C條件下，培養(yǎng)7天，搖瓶轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，得到云芝搖瓶菌種；將云芝搖瓶菌種2L，接種于裝有40L —級液體培養(yǎng)基的50L種子罐中，一級液體培養(yǎng)基含1%葡萄糖、2%小麥粉、O. 5%酵母粉、O. 05%硫酸鎂和O. 05%磷酸氫二鉀，通氣量為O. 5v/ (v · min), 25°C條件下培養(yǎng)36小時,得云芝一級液體菌種；取云芝一級液體菌種40L,接種于裝有400L 二級液體培養(yǎng)基的I噸種子罐中，二級液體培養(yǎng)基含2%葡萄糖、2%小麥粉、O. 5%酵母粉、O. 05%硫酸鎂和O. 05%磷酸氫二鉀，通氣量為O. 5v/ (V · min)，25°C條件下培養(yǎng)36小時，得云芝二級液體菌種；取云芝二級液體菌種400L，接種于裝有4噸發(fā)酵培養(yǎng)基的5噸發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基含3%葡萄糖、2%玉米粉、2%黃豆餅粉、O. 05%硫酸鎂和O. I %磷酸氫二鉀，通氣量為l.Ov/ (V ·π η)，25 條件下培養(yǎng)60小時，板筐壓濾，得云芝菌絲體；濾液為副產(chǎn)物發(fā)酵液。以上發(fā)酵用水均為飲用水。用重量為云芝菌絲體4倍量的純水清洗云芝菌絲體一次，板筐壓濾，用重量為云芝菌絲體3倍的純水，于94°C條件下提取2小時。板筐壓濾，將分離到的提取液于60°C條件下減壓濃縮至比重為I. 02，緩緩加入90wt%乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到73wt%，將混合物0°C條件下冷藏4小時，然后過濾得到云芝糖肽沉淀，60°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝糖肽。2)云芝胞外糖肽的生產(chǎn)過程將液體發(fā)酵云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液于70°C減壓濃縮至比重為I. 10，緩緩加入90wt%乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到72wt%，將混合液在4°C條件下冷藏12小時，過濾得云芝胞外糖肽沉淀。70°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝胞外糖肽。分析結(jié)果如下云芝菌絲體的收率為每升發(fā)酵菌液20. 5g,云芝糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液2. lg。云芝糖肽中糖含量為41. 4%，蛋白質(zhì)含量為24. 3%，重均分子量大于等于40Kd的占53. I %，鉛含量為O. 690ppm,鎘含量為O. 180ppm,鉻含量為O. 391ppm,銻含量為O. 156ppm，銅含量為5. 343ppm，砷含量為I. 030ppm，汞未檢出，錫未檢出。云芝 胞外糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液11. 2g。云芝胞外糖肽的糖含量為51.9%，蛋白質(zhì)含量為19.5%。實施例3取活化的云芝Cov-I菌株接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)5天，得云芝斜面菌種；將云芝斜面菌種，接種于由2%葡萄糖、3%玉米粉組成的搖瓶液體培養(yǎng)基，30°C條件下，培養(yǎng)5天，搖瓶轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘，得到云芝搖瓶菌種；將云芝搖瓶菌種2L，接種于裝有40L—級液體培養(yǎng)基的50L種子罐，一級液體培養(yǎng)基含I %蔗糖、I %玉米粉、I. 5%花生餅粉、O. 5%酵母粉、O. I %硫酸鎂和O. 075%磷酸氫二鉀，通氣量為1.0 (v/V · min), 30°C條件下培養(yǎng)42小時,得云芝一級液體菌種；取云芝一級液體菌種40L,接種于裝有400L 二級液體培養(yǎng)基的I噸種子罐中，二級液體培養(yǎng)基含I %蔗糖、I %淀粉、I %黃豆餅粉、O. 5%花生餅粉、O. I %碳酸鈣和O. 05%磷酸氫二鉀，通氣量為l.Ov/ (V · min), 30°C條件下培養(yǎng)42小時，得云芝二級液體菌種；取云芝二級液體菌種400L，接種于裝有4噸發(fā)酵培養(yǎng)基的5噸發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基由I. 5%玉米粉、1%蔗糖、2%淀粉、I. 5%花生餅粉、
0.05%硫酸鎂和O. I %磷酸氫二鉀組成，0-24小時通氣量為O. 5v/ (v *min), 24-48小時通氣量為1.0v/(vmin)，30°c條件下培養(yǎng)48小時，板筐壓濾，得云芝菌絲體。以上發(fā)酵用水均為飲用水。用重量為云芝菌絲體2倍量的純水清洗云芝菌絲體一次，板筐壓濾，用重量為云芝菌絲體5倍的純水，于90°C條件下提取6小時。板筐壓濾，將分離到的提取液于80°C條件下減壓濃縮至比重為I. 15，緩緩加入80wt%乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到70wt%，將混合物8°C條件下冷藏24小時，然后過濾得到云芝糖肽沉淀，80°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝糖肽。2)云芝胞外糖肽的生產(chǎn)過程將液體發(fā)酵云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液于80°C減壓濃縮至比重為
1.15，緩緩加入SOwt %乙醇，并使混合液中的乙醇含量達到70wt%，將混合液在8°C條件下冷藏24小時，過濾得云芝胞外糖肽沉淀，80°C真空干燥，粉碎過篩，即得云芝胞外糖肽。分析結(jié)果如下云芝菌絲體的收率為每升發(fā)酵菌液22. 4g，云芝糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液2. 4g。云芝糖肽中糖含量為40. 3%，蛋白質(zhì)含量為25. I %，重均分子量大于等于40Kd的占64. 9 %，鉛含量為O. 560ppm,鎘含量為O. 120ppm,鉻含量為O. 464ppm,銻含量為O. 115ppm，銅含量為3.720ppm，砷含量為0.870ppm，汞未檢出，錫未檢出。云芝胞外糖肽的收率為每升發(fā)酵菌液10. 3g。云芝胞外糖肽中糖含量為52.8%，蛋白質(zhì)含量為17.6%
權(quán)利要求
1.一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于將液體發(fā)酵生產(chǎn)云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮后加入乙醇溶液并冷藏，取其沉淀物干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于所述副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮至比重為1.02-1. 15。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于在濃縮發(fā)酵液中加入80wt % -IOOwt %的乙醇溶液，并使混合液中的乙醇含量達到70wt% -75wt%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于所述冷藏溫度為0°C _8°C，冷藏時間為4-24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于將沉淀物在溫度為60°C _80°C條件下真空干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于所述云芝菌絲體和發(fā)酵液的獲取過程是將活化的云芝Cov-I菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、一級液體培養(yǎng)、二級液體培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)的逐級擴大培養(yǎng)方法得到發(fā)酵菌液并過濾，即得到云芝菌絲體和副產(chǎn)物發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于所述一級液體培養(yǎng)基、二級液體培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基所使用的碳源為葡萄糖、蔗糖、玉米粉、小麥粉、淀粉或糊精中的一種或幾種，氮源為黃豆餅粉、花生餅粉或酵母粉中的一種或幾種；所述一級液體培養(yǎng)基的碳氮源總量為該一級液體培養(yǎng)基的3.5% _5%，所述二級液體培養(yǎng)基的碳氮源總量為該二級液體培養(yǎng)基的3. 5% -5%，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源總量為該發(fā)酵培養(yǎng)基的6% -8%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，其特征在于所述云芝菌絲體經(jīng)過水提醇沉法得到云芝糖肽，包括如下步驟， (1)用重量為云芝菌絲體2-4倍量的純水清洗云芝菌絲體并過濾；用重量為云芝菌絲體3-5倍的純水于90°C _98°C溫度下提取2-6小時；分離得到提取液。
(2)將步驟(I)中的提取液經(jīng)減壓濃縮后采用醇沉法得到沉淀物，并取其干燥。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種利用生產(chǎn)云芝糖肽時產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液生產(chǎn)云芝胞外糖肽的方法，將液體發(fā)酵生產(chǎn)云芝菌絲體過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮后加入乙醇溶液并冷藏，取其沉淀物干燥即得云芝胞外糖肽。其步驟為將所述副產(chǎn)物發(fā)酵液減壓濃縮至比重為1.02-1.15，在濃縮發(fā)酵液中加入80wt％-100wt％的乙醇溶液，并使混合液中的乙醇含量達到70wt％-75wt％，將混合液0℃-8℃下冷藏4-24小時，過濾后將沉淀物在60℃-80℃條件下真空干燥。本發(fā)明采用醇沉法從生產(chǎn)云芝糖肽的副產(chǎn)物發(fā)酵液中提取具有免疫活性的云芝胞外糖肽，節(jié)約了資源，為企業(yè)獲得了經(jīng)濟收益的同時也降低了排污壓力。
文檔編號C08B37/00GK102863549SQ20121037578
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者茅仁剛, 袁萍, 陳浙江, 葉曉平, 呂丹, 王曉然, 張?zhí)? 申請人:上海師范大學(xué), 上海新康制藥廠