3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，30°C下溫育并輕輕振蕩，酶解4小 時(shí)后用四層高級(jí)擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定劑懸 浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)。得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)4. 6X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
[0023] 實(shí)施例5: 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，3000r /min離心收集菌絲，并用無菌水與滲透劑各洗漆兩次，供制 備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，300U/ml的纖維素酶、15mg/ml 的蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 7mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整 pH5. 8 ;經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，35°C下溫育并輕輕振蕩，酶解2小 時(shí)后用四層高級(jí)擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定劑懸 浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)。得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)3. 47X IO7個(gè)/ml，并且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。
[0024] 對(duì)比例1 : 1) 孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)16h，3000r /min離心收集菌絲，并用無菌水與滲透劑各洗漆兩次，供制 備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：對(duì)纖維素酶、蝸牛酶和溶菌酶三種酶液進(jìn)行另外一種比例混合，包括 150U/ml的纖維素酶、10mg/ml的蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L NaCl作為滲 透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整PH5. 8 ;經(jīng)0. 22ΜΠ 1微孔濾膜過濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，30°C下溫育并輕輕振蕩，完全酶解 4小時(shí)后，用四層高級(jí)擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定 劑懸浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)，得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)I. 4X IO7個(gè)/ml。
[0025] 結(jié)論：通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)纖維素酶、蝸牛酶和溶菌酶在酶解液中的濃度比例不同，對(duì)高 山被孢霉原生質(zhì)體的制備有很大影響，對(duì)比實(shí)驗(yàn)中得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量就遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于本發(fā)明 最優(yōu)條件下的產(chǎn)量。
[0026] 對(duì)比例2 : 1)孢子懸液擴(kuò)大培養(yǎng)：上述孢子懸液Iml接入裝液量為50ml/250ml的三角瓶中，28°C、 150 r/min振蕩培養(yǎng)較長時(shí)間，達(dá)到20h，3000r /min離心收集菌絲，并用無菌水與滲透劑 各洗滌兩次，供制備原生質(zhì)體用； 2) 制備酶解液：按照以下比例對(duì)三種酶液進(jìn)行混合，300U/ml的纖維素酶、15mg/ml的 蝸牛酶和2500U/ml的溶菌酶，利用0. 8mol/L KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行配置，調(diào)整pH5. 8 ; 經(jīng)0. 22Mm微孔濾膜過濾除菌，保存于4°C冰箱備用； 3) 原生質(zhì)體制備：取5ml酶液加人Ig濕菌體，搖勻，30°C下溫育并輕輕振蕩，完全酶解 4小時(shí)后，用四層高級(jí)擦鏡紙過濾除去菌絲體碎片，在1500r /min離心15min，沉淀用穩(wěn)定 劑懸浮，洗滌兩次，血球板計(jì)數(shù)，得到原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)I. 8 X IO7個(gè)/ml。
[0027] 結(jié)論：滲透壓穩(wěn)定劑作為酶的溶解作用環(huán)境及原生質(zhì)體的存在環(huán)境，對(duì)于原生質(zhì) 體的制備至關(guān)重要；穩(wěn)定劑的性質(zhì)和濃度是維持和控制原生質(zhì)體數(shù)量的主要因素，而同時(shí) 穩(wěn)定劑對(duì)裂解酶的活性具有一定的促進(jìn)作用；通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)采用〇. 8mol/L KCl作為滲透 壓穩(wěn)定劑制備得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量偏低。
[0028] 原生質(zhì)體再生實(shí)驗(yàn)對(duì)比： 1) 制備培養(yǎng)基：高滲再生培養(yǎng)基為加入0. 8mol/L NaCl的PDA培養(yǎng)基；低滲再生培養(yǎng) 基為PDA培養(yǎng)基； 2) 原生質(zhì)體再生：選擇實(shí)施例1、2、3和對(duì)比例1、2得到的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體的再 生實(shí)驗(yàn)，將上述純化的原生質(zhì)體懸液，用0. 8mol/L NaCl做不同稀釋度分別接種于高滲和低 滲再生培養(yǎng)基，并血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)做對(duì)照，28°C培養(yǎng)三天后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算再生率； 3) 再生率計(jì)算。
[0029] 原生質(zhì)體再生實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1所示：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備高山被孢霉原生質(zhì)體的酶解液，由活性酶、滲透壓穩(wěn)定劑和水組成，其特征 在于：其活性酶的混合比為：300?375U/ml的纖維素酶、15?20mg/ml的蝸牛酶和2500? 5000U/ml的溶菌酶。
2. -種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟： 1) 將活化后的高山被孢霉接種在液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)收集菌絲體并洗滌干凈； 2) 在菌絲體中加入無菌酶解液，充分酶解后去除菌絲體碎片，收集洗滌得到原生質(zhì) 體； 其中，酶解液的組成如權(quán)利要求1所述。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：菌株在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)的時(shí) 間為15?20h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：按Ig濕菌體中加入酶液5ml的比 例將菌絲體與酶解液混合，酶解液中，纖維素酶的酶活為300?375U/ml、蝸牛酶的酶活為 15?20mg/ml、溶菌酶的酶活為2500?5000U/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的制備方法，其特征在于：酶解液的滲透壓穩(wěn)定劑NaCl， 其在酶解液中的濃度為〇· 7?0· 9 mol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：酶解液的滲透壓穩(wěn)定劑為0. 8 mol/ L 的 NaCl。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：酶解的溫度為29?35°C，酶解時(shí)間 為1. 5?6小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：酶解的溫度為30?32°C，酶解時(shí)間 為2?4小時(shí)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高山被孢霉原生質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明的酶解液由活性酶、滲透壓穩(wěn)定劑和水組成，其中活性酶的混合比為：300～375U/ml的纖維素酶、15～20mg/ml的蝸牛酶和2500～5000U/ml的溶菌酶。本發(fā)明的制備方法是將活化后的高山被孢霉接種在液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)收集菌絲體并洗滌干凈；在菌絲體中加入無菌酶解液，充分酶解后去除菌絲體碎片，收集洗滌得到原生質(zhì)體。本發(fā)明的酶解液，可以高效地酶解高山被孢霉菌絲體的細(xì)胞壁，制備得到高品質(zhì)的高山被孢霉原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)5.5×107個(gè)/ml。
【IPC分類】C12N1-14, C12R1-645
【公開號(hào)】CN104560733
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510002091
【發(fā)明人】班甲, 陳駿佳, 王帆, 班雯婷, 徐曉燕, 周正雄
【申請(qǐng)人】廣州甘蔗糖業(yè)研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月5日