專利名稱：一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片、檢測系統(tǒng)及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種基于rRNA基因種專 一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片、檢測系統(tǒng)及檢測方法。
背景技術(shù)：
基因芯片是利用平行分析原理將大量不同序列的核酸分子作為分析樣品中靶基 因的探針，以微點(diǎn)陣方式固化在硅片，玻璃，尼龍膜等基質(zhì)上，從而制成通常意義上的基因 芯片，也稱為DNA微陣列。感染性病原體診斷芯片就是將待測病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片 上制成芯片，將從病人血液、組織或細(xì)胞中抽提出病原體的DNA或RNA，在制備靶基因的合 成中摻入了核苷單體dNTP及一部分與生物素一類的標(biāo)記物或熒光基因共價偶聯(lián)的核苷單 體dNTP，從而合成帶有各種信號標(biāo)記并被擴(kuò)增的cDNA靶基因，經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記熒光后與芯片進(jìn) 行雜交，然后將帶有標(biāo)記物來自不同細(xì)胞組織標(biāo)本的cDNA靶雜交到基因芯片上固定的探 針片段上，雜交信號由掃描儀掃描，再經(jīng)計算機(jī)分析，判斷陰陽性。靶基因的制備和標(biāo)記是基因芯片技術(shù)流程的一個重要環(huán)節(jié)，目前的通用技術(shù)是在 靶基因在與芯片探針結(jié)合雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。標(biāo)記方法根據(jù)樣品來源、芯 片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄 過程中實現(xiàn)對靶基因的標(biāo)記。細(xì)菌核糖體RNA(rRNA)是原核生物的標(biāo)志，其16S rRNA基因是以多拷貝形式存在 于所有細(xì)菌染色體基因中，該序列在原核生物中保守性極強(qiáng)，某些序列片段為所有細(xì)菌共 有，對于相近種或同一種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辨力較差，但其種間序列上的差異足 以進(jìn)行物種鑒定。并且每個細(xì)胞中含有rRNA拷貝數(shù)大約為10，000個，使得繞過前面對目 標(biāo)序列的擴(kuò)增，直接進(jìn)行低濃度樣本和開拓分子檢測應(yīng)用成為可能。在分子檢測領(lǐng)域中，所使用的檢測設(shè)備為半導(dǎo)體裝置，而捕獲探針是在溶液中制 備、標(biāo)記，這樣捕獲探針不能直接連接于基質(zhì)。例如，CN 200810117952. 6公開了一類分子 檢測系統(tǒng)，其公開了微生物病原體的非擴(kuò)增檢測實例，其捕獲探針并非直接固定于基質(zhì)上， 而是與多聚物偶聯(lián)后再間接固定到芯片基質(zhì)，這種方法雖然實現(xiàn)非酶擴(kuò)增檢測，但是多聚 物偶聯(lián)步驟繁瑣、增加檢測成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片。本發(fā)明的再一目的是提供一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測系統(tǒng)。本發(fā)明的再一目的是提供一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片，其包括1)基質(zhì)；
2)捕獲探針，所述捕獲探針為基于原核生物rRNA基因種的16SrRNA專一序列，直 接固定于基質(zhì)表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣；3)報告探針，所述報告探針是基于rRNA基因種間的高度保守序列，其末端被標(biāo) 記。根據(jù)本發(fā)明的芯片，所述基質(zhì)可以為基因芯片領(lǐng)域的常規(guī)基質(zhì)，如硅片，玻璃，尼 龍膜等。捕獲探針的獲得及固定根據(jù)不同病原菌的種屬16SrRNA專一序列片段，設(shè)計并 合成一段特異性寡核苷酸探針，固定于基因芯片固相表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣。該探針可 以是，但不局限于以下病原菌的特異性寡核苷酸片段包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道臨 床常見病原菌以及臨床樣品中常見的非致病菌rDNA基因片段。上述寡核苷酸捕獲探針是通過對所有病原菌的rDNA序列的比對分析獲得的，每 種病原菌獲得η (η < 10)條特有的16-25個堿基候選條序列片段，經(jīng)過進(jìn)一步雜交驗證后， 最終每種病原菌確定1條特有序列，稱為“種專一捕獲探針”。將捕獲探針結(jié)合在芯片基質(zhì)表面可以通過多種途徑實現(xiàn)，例如可以在表面引入環(huán) 氧基團(tuán)，以與共聯(lián)探針的羥基或氨基反應(yīng)，還可以將表面用多聚賴氨酸處理，以結(jié)合點(diǎn)在表 面上的捕獲探針，紫外照射可以將探針結(jié)合在如載玻片或電子設(shè)備臨近的鈍化層等基質(zhì) 上，寡核苷酸可以被結(jié)合在引入醛基、氨基或異硫氰酸酯基的傳感器表面。陣列的制造機(jī)制 可以是針點(diǎn)、噴點(diǎn)或芯片上直接合成，所述基質(zhì)為玻璃或CMOS圖像傳感器表面。報告探針的獲得基于rDNA序列保守區(qū)設(shè)計并篩選出每種病原菌種間同源性最 高的30個堿基候選條序列片段，并在序列5’端標(biāo)記生物素，經(jīng)過進(jìn)一步雜交驗證后，最終 確定1條寡核苷酸通用序列，稱為“通用性報告探針”，優(yōu)選其長度為17-45個堿基。雜交單一樣本來源的靶rRNA與標(biāo)記的報告探針和基因芯片上的捕獲探針同時 雜交，形成“捕獲探針_靶rRNA-報告探針”雜交復(fù)合物，然后加入特異性酶，與報告探針的 標(biāo)記物(如生物素)進(jìn)行反應(yīng)，在底物催化下即可發(fā)出信號。根據(jù)本發(fā)明的基因芯片，其中，所述rRNA來源于致病病原體或非致病病原體，所 述致病病原體包括呼吸道、消化道和泌尿生殖道疾病相關(guān)致病病原體。根據(jù)本發(fā)明的基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，其包括1)基質(zhì)；2)捕獲探針，所述捕獲探針為基于原核生物rRNA基因種的16SrRNA專一序列，直 接固定于基質(zhì)表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣；3)報告探針；4)圖像傳感器?？梢酝ㄟ^數(shù)字圖象或者說“機(jī)器視覺”傳感技術(shù)來讀取陣列上結(jié)合的待檢物信號， 其具有低背景和相對高信噪比的特點(diǎn)，是一種強(qiáng)化的檢測待檢物的生物傳感器系統(tǒng)。具體 的說這種生物傳感器系統(tǒng)應(yīng)用了包括有子板上的數(shù)字圖象傳感器、陣列、帶有傳感器降溫 裝置的低光外殼和待檢物信號的積分方法等的信號傳感技術(shù)。陣列所產(chǎn)生的光學(xué)信號可以被數(shù)字圖象傳感器檢測，其中數(shù)字圖象傳感器包括光 敏元件的矩陣，點(diǎn)制的捕獲探針通過共價或非共價結(jié)合于數(shù)字圖象傳感器的表面形成陣 列。用另一種方式，捕獲探針可以點(diǎn)制在可以靠近數(shù)字圖象傳感器的載玻片上，而在載玻片
4和傳感器直接存在有光纖耦合器。陣列上單個探針點(diǎn)的局部區(qū)域可以大于數(shù)字圖象傳感器的單個光敏元件。同樣探針點(diǎn)大小可以與單個光敏元件一致。根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)，可以使用數(shù)字圖象傳感器檢測捕獲探針_靶rRNA-報告 探針雜交后產(chǎn)生的信號，其中數(shù)字圖象傳感器包括光敏元件的矩陣。數(shù)字圖象傳感器可以是CMOS活性像素傳感器，其每個像素對應(yīng)連接有數(shù)字轉(zhuǎn)換 器、放大器和寄存器的光敏二極管。CMOS活性像素傳感器的頂層是鈍化層，如可以充分透光 的二氧化硅，以作為隔絕陣列檢測的待檢物溶液和半導(dǎo)體線路的屏障。適用的光學(xué)檢測包括檢測熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和量子點(diǎn)等方法，標(biāo)記物或信 號分子附著在報告探針上，包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光體、生物發(fā)光 劑、酶、抗體、顆粒如磁珠和量子點(diǎn)。用于檢測待檢物的信號分子包括放射性同位素，熒光染 料如Cy3、Cy5、Alexa Fluor488、熒光素、羅丹明、得克薩斯紅、玫瑰紅、丹磺酰氯、溴化乙啶、 萘胺、pyrenes、卟啉，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)如魯米諾、發(fā)光氨、吖啶苯酯、釕鹽、生色團(tuán)，和比色探針 如膠體金、偶氮染料、喹啉染料、花青染料。標(biāo)記物包括拮抗劑和對抗劑、毒素、抗原決定基、激素、抗體、多肽、酶、寡核苷酸、 肽核酸、凝集素、碳水化合物、蛋白和藥物，例如用于ELISA檢測的酶可以用來進(jìn)行熒光檢 測，另外，熒光標(biāo)記的抗生物素或鏈酶親和素。對一種特定的待檢物可以通過多種標(biāo)記物形成多種檢測方法，例如報告探針可以 連接多種熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，此外，報告探針也能夠結(jié)合多種靶點(diǎn)，因此報告探針可以 連接多種靶點(diǎn)結(jié)合分子和多種不同的標(biāo)記物。對于熒光檢測，熒光物的激發(fā)光可以由靠近陣列或者靠近CMOS傳感器外殼的LED 面板提供，在陣列附近陣列點(diǎn)與光敏二極管之間的窄帶濾光片可以從陣列的讀取信號中去 除激發(fā)信號，而對發(fā)射光進(jìn)行檢測。另一種方法是待檢物信號可以通過光學(xué)檢測化學(xué)發(fā)光來讀取測定信息。化學(xué)發(fā)光 來自于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光，可以被沒有濾光片的寬帶探測器所檢測，如CMOS活性像素傳感 器，陣列點(diǎn)發(fā)出的光直接被檢測，背景信號主要來自于“暗電流”。待檢物可以標(biāo)記上化學(xué)發(fā) 光標(biāo)簽用于化學(xué)發(fā)光檢測，如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。檢測效率一部分依賴于對標(biāo) 記的選擇性或特異性附著效率，標(biāo)記識別物可以是生物素或地高辛抗體此類的能被酶檢測 系統(tǒng)識別的物質(zhì)，然后發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)通過化學(xué)鍵斷裂釋放能量產(chǎn)生離散波長的光子。本發(fā)明中的陣列信號檢測可以使用數(shù)字圖象傳感器，也可以使用電荷耦合裝置 (CCD)、光電倍增管(PMT)或雪崩光電二極管來完成，待檢物的檢測也可以通過，例如電導(dǎo) 檢測來完成不同的陣列方案。根據(jù)本發(fā)明，可以直接把陣列構(gòu)建在數(shù)字圖象傳感器上以增強(qiáng)其檢測的信號，這 是通過檢測形成在數(shù)字圖象傳感器頂部薄的鈍化層上的陣列所發(fā)射的化學(xué)發(fā)光來實現(xiàn)的， 信號可以被接近于陣列的數(shù)字圖象傳感器感光原件方便的增強(qiáng)。根據(jù)本發(fā)明的基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測方法，其包括以下步驟1)制備多種形式樣品中的rRNA的粗品；2)在芯片基質(zhì)上直接固定一種或一種以上捕獲探針，所述捕獲探針為基于原核生 物rRNA基因種的16SrRNA專一序列，直接固定于基質(zhì)表面；
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3)報告探針和捕獲探針在規(guī)定的雜交條件下與同一個樣本的rRNA雜交，所述報 告探針是基于rRNA基因種間高度保守序列，設(shè)計和篩選的通用性寡核苷酸片段，長度為 17-45個堿基，5’端經(jīng)生物素(biotin)標(biāo)記，構(gòu)成通用性報告探針，可直接與靶rRNA進(jìn)行 雜交，然后加入特異性酶，與報告探針的標(biāo)記物(如生物素)進(jìn)行反應(yīng)，在底物催化下即可 發(fā)出信號，檢測信號直接從圖像傳感器得到數(shù)據(jù)。本發(fā)明提供了一套操作簡便、靈敏度高和實現(xiàn)信號放大的操作技術(shù)，是一種雙探 針(捕獲探針和報告探針)基因芯片信號放大技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，可以直接檢測多 種形式粗略樣品中的核酸，而不需要核酸的抽提和擴(kuò)增環(huán)節(jié)；捕獲探針直接連接到芯片基 質(zhì)表面，簡化檢測步驟、減少檢索成本，同時具有極高的檢測靈敏度，這種全新的發(fā)明可能 會改變或替代目前針對臨床核酸樣品或其它核酸樣品應(yīng)用領(lǐng)域的基因分型、基因突變和基 因表達(dá)圖譜的應(yīng)用現(xiàn)狀。


圖1在臨床樣本1中檢測到腦膜炎奈瑟菌。圖2在臨床樣本2中檢測到李斯特菌。圖3對可引起腦膜炎的4種病原菌同時檢測。
具體實施例方式實施例1腦脊液中微生物病原體的非擴(kuò)增檢測月市炎球菌(streptococcus pneumoniae)、腦膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、李其j 特菌(listeria monocytogenes)禾口 流感嗜血桿菌(hemophilus influenzae)等細(xì)菌是引起新生兒腦膜炎的主要病原菌。利用本發(fā)明中的檢測系統(tǒng)，臨床上 在無菌條件下抽取腦脊液作為臨床樣品，無需PCR擴(kuò)增，即可對細(xì)菌基因進(jìn)行非擴(kuò)增放大 檢測，實現(xiàn)快速確診。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因兼有保守性和變異性的特征，設(shè)計出能與所有細(xì)菌 16SrRNA雜交的報告探針，以及4種腦膜炎常見病原菌的捕獲探針。以下探針均由北京奧科 生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
臨床樣品的處理及靶基因的制備將2份不同病人的腦脊液各ImL分別加入到 ImL含有2% SDS的PBS緩沖液和ImL (體積)的玻璃珠混合，用最高速度在漩渦器上旋轉(zhuǎn) 混勻，然后用臺式超聲破碎機(jī)破碎一分鐘，重復(fù)4次以上，將超聲破碎產(chǎn)物離心，取上清。
基因芯片的制備將捕獲探針溶于20mM NaBO3 (pH 9. 0)/5mM NaCl/20% DMSO中， 采用基因芯片點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)樣，每個芯片點(diǎn)6個陣(4種捕獲探針以及陰、陽性對照)，按照 常規(guī)方法來制備芯片。雜交A 首先在點(diǎn)有6個陣的芯片加入封閉液I (6X SSPE/90%甲酰胺/lmg/ml BSA)， 于室溫靜置30min ；B 吸出封閉液I，加入雜交液(在IOyL上清液加入IOyL含有90%甲酰胺和 6XSSPE的溶液并加入1 μ L生物素報告探針)，室溫靜置1小時；C 然后轉(zhuǎn)到直接結(jié)合了捕獲探針的感受芯片上，于30°C雜交1小時。D 吸出雜交液，用洗液(0. IX SSPE/lmg/ml BSA/1%甘油)洗滌3次，每次5min ；E 加入封閉液II (IX TBS/5% BSA/1%甘油 /0. 05% Tween-20)靜置 30min ；F 吸出封閉液 II，加入濃度為 1 500 的 Straptavidine-HRP，反應(yīng) 30min ；G:以洗液(IX TBS/1%甘油/lmg/ml BSA)洗去未結(jié)合的 Straptavidine-HRP，洗 滌3次，每次5min。檢測然后將芯片傳感器插入檢測儀，加入底物催化，發(fā)出信號，檢測信號直接從 圖像傳感器得到數(shù)據(jù)。根據(jù)信號強(qiáng)弱確定病原菌的存在結(jié)果表明從臨床樣本1腦膜炎奈瑟菌的所在的 陣有明顯的亮點(diǎn)，說明樣本1的腦脊液中存在腦膜炎奈瑟菌(結(jié)果見圖1)；從臨床樣本2中 檢測到李斯特菌，并且該陣亮度較高，說明該病原菌在腦脊液中含量較高(結(jié)果見圖2)。另外，本系統(tǒng)不但可對單一病原菌進(jìn)行檢測，亦可對4種病原菌同時進(jìn)行檢測，將 4種病原菌，肺炎球菌、腦膜炎奈瑟菌、李斯特菌和流感嗜血桿菌稀釋至10，000cfu/mL,等 體積混合后，取0. 3mL與0. 3mL含有2 % SDS的PBS緩沖液和0. 3mL (體積)的玻璃珠混合， 用最高速度在漩渦器上旋轉(zhuǎn)混勻，離心、取上清作為制備的靶基因，然后即可按上述程序進(jìn) 行雜交、檢測。圖3中明確顯示出對4種病原菌同時檢測的結(jié)果。實施例2沙眼衣原體(CT)和淋球菌(NG)的檢測在對于最常見的性傳染疾病CT/NT進(jìn)行臨床檢測時，一般是用棉花球插入陰道取 樣。取樣后的棉花球可用PBS緩沖液將大部分細(xì)胞清洗下來，然后重懸在ImL的PBS中，取 0. 3mL與0. 3mL含有2% SDS的PBS緩沖液和0. 3mL (體積)的玻璃珠混合，然后用最高速 度在漩渦器上旋轉(zhuǎn)混勻，離心、取上清即為制備的靶基因溶液。捕獲探針的設(shè)計與制備基于CT和NG菌種間16S rRNA特異性基因組序列，各設(shè) 計一條捕獲探針，3’端標(biāo)記-NH2，交予北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。探針連接采 用氨基化探針與環(huán)氧活化的芯片共價結(jié)合的方法。序列如下CT-Pb 5' -GTTACTCGGATGCCCAAATATCGCC-NH2-3'NG-Pb 5' -GGATAGCGCAAGGCCCGAA-NH2-3‘報告探針的設(shè)計與制備在GenBank查得多種常見細(xì)菌16S rRNA基因序列，在保 守區(qū)用尋找一段大多數(shù)常見細(xì)菌共有保守序列，并在5’端偶聯(lián)上生物素，然后將序列提交 北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，作為報告探針。其序列為5' -Biotin-CGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACA-3雜交與檢測按實施例1操作程序進(jìn)行雜交和信號檢測，雜交溫度為30°C，時間為1小時。我們在對10份臨床樣本進(jìn)行基因芯片檢測的同時，也對樣本進(jìn)行了 CT/NG的PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明亮點(diǎn)位置準(zhǔn)確、清晰。有4份樣本呈現(xiàn)出CT/NG雙陽性雜交信號，其中2份 檢測到CT強(qiáng)陽性，NG信號較弱；其余6人為陰性。此結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果完全一致，說明 本檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。實施例3污水中細(xì)菌的快速檢測食品企業(yè)污水中含有各種無機(jī)污物和有機(jī)污物，其中夾帶的致病菌能導(dǎo)致多種疾 病的爆發(fā)和流行?，F(xiàn)行的檢測方法主要是利用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法、血清學(xué)方法和PCR方法， 其方法多存在一些限制培養(yǎng)時間長、不能區(qū)別親緣關(guān)系相近的細(xì)菌、靈敏度低等。而本發(fā) 明提供的基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、特異性的檢測。選取食品污水中常見的大腸桿 菌(escherichia coli)、腸球菌(enterococcus)、志賀氏菌(shigella flexneri)、沙門氏 菌(salmonella enterica)共計4種菌作為檢測對象。在16s RNA可變區(qū)分別設(shè)計4種特異性的捕獲探針；在16s RNA的穩(wěn)定區(qū)設(shè)計通
用性的報告探針，其序列如下表 靶基因的制備將采集的污水樣品IOmL置于臺式超聲破碎機(jī)破碎一分鐘，重復(fù)4 次以上，離心取上清。雜交與檢測按實施例1操作程序進(jìn)行雜交和信號檢測，雜交溫度為30°C，時間為 1小時。我們同時對不同地區(qū)采集的5份污水樣本進(jìn)行了基因芯片檢測和細(xì)菌培養(yǎng)檢測 的比對，結(jié)果表明基因芯片檢測結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果基本一致，并且基因芯片比細(xì)菌培養(yǎng) 具有更高的靈敏度。具體結(jié)果見下表。
這種檢測技術(shù)為以后更大規(guī)模的檢測研究奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，可以推廣應(yīng)用 于環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督、商品檢驗檢疫等許多領(lǐng)域。
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權(quán)利要求
一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括1)基質(zhì)；2)捕獲探針，所述捕獲探針為基于rRNA基因種的16S rRNA專一序列，直接固定于基質(zhì)表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣；3)報告探針，所述報告探針是基于rRNA基因種間高度保守序列，其末端被標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述捕獲探針的長度為16-25個堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述報告探針的長度為17-45個堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述rRNA來源于致病病原體或非致 病病原體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述致病病原體包括血液、呼吸道、 消化道和泌尿生殖道疾病相關(guān)致病病原體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述基質(zhì)為玻璃或CMOS圖像傳感器表面。
7.一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測系統(tǒng)包括1)基質(zhì)；2)捕獲探針，所述捕獲探針為基于rRNA基因種的16SrRNA專一序列，直接固定于基質(zhì) 表面，構(gòu)成基因芯片微點(diǎn)陣；3)報告探針，所述報告探針是基于rRNA基因種間的高度保守序列，其末端被標(biāo)記；4)圖像傳感器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述圖像傳感器為CMOS圖像傳感器。
9.一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測方法，其特征在于所述方法包括以 下步驟1)制備多種形式樣品中的rRNA的粗品；2)在芯片基質(zhì)上直接固定一種或一種以上捕獲探針，所述捕獲探針為基于rRNA基因 種的16S rRNA專一序列，直接固定于基質(zhì)表面；3)報告探針和捕獲探針在規(guī)定的雜交條件下與同一個樣本的rRNA雜交，所述報告探 針是基于rRNA基因種間的高度保守序列，其末端被標(biāo)記；4)檢測信號，檢測信號直接從圖像傳感器得到數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因芯片應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片、檢測系統(tǒng)及檢測方法。根據(jù)本發(fā)明的基于rRNA基因種專一序列的非酶擴(kuò)增檢測基因芯片，其包括1)基質(zhì)；2)捕獲探針，所述捕獲探針為基于原核生物rRNA基因種的16SrRNA專一序列，直接固定于基質(zhì)表面；3)報告探針，所述報告探針是基于rRNA基因種間的高度保守序列，其末端被標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)，可以直接檢測多種形式粗略樣品中的核酸，而不需要核酸的抽提和擴(kuò)增環(huán)節(jié)；捕獲探針直接連接到芯片基質(zhì)表面，簡化檢測步驟、減少檢索成本，同時具有極高的檢測靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK101899512SQ20101022875
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者劉治平, 欒升, 甘一迪 申請人:北京九州泰康生物科技有限責(zé)任公司