專利名稱：一種甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系、系統(tǒng)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母 雙雜交體系、系統(tǒng)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，為有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，成員 包括甲、乙、丙三型流感病毒，目前感染人的主要是甲、乙型流感病毒。甲、乙型流感病毒基 因組含有8個(gè)節(jié)段，為單鏈、負(fù)鏈的RNA，分別編碼至少10種以上的蛋白。根據(jù)病毒表面血 凝素(Hemaglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，ΝΑ)抗原性質(zhì)的不同，甲型流感 病毒又可以分為1-16種HA亞型和1-9種NA亞型。目前引起人類感染的流感病毒主要是 Hl (Ni)、Η3 (Ν2)亞型和B型流感病毒。流感病毒的RNA依賴的RNA聚合酶由PB1IB2JA三 個(gè)亞基組成，負(fù)責(zé)流感病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)抑制甲型流感病毒PBl亞基內(nèi)切酶活性進(jìn)行抗流感病毒藥物篩 選，但是，該類藥物的作用機(jī)理與宿主細(xì)胞某些RNA聚合酶相同，不具有特異性，達(dá)不到抑 制流感病毒復(fù)制的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體 系，解決現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)甲型流感病毒藥物篩選特異性、篩選通量低，目標(biāo)藥物作用機(jī)理不明 確等技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，該靶點(diǎn)特異性甲型流感 病毒藥物篩選酵母雙雜交體系轉(zhuǎn)化、弓I入甲型流感病毒的PBl基因和ΡΒ2基因，該甲型流感 病毒PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，該甲型流感病毒ΡΒ2基因的表達(dá)產(chǎn)物是獵物蛋白。以及，一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，該靶點(diǎn)特異性甲 型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括甲型流感病毒的PBl基因和PA基因，該甲型流感 病毒PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，該甲型流感病毒PA基因的表達(dá)產(chǎn)物是獵物蛋白。本發(fā)明實(shí)施例的進(jìn)一步目的在于提供一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵 母雙雜交系統(tǒng)，解決現(xiàn)有技術(shù)針對(duì)甲型流感病毒藥物篩選特異性、篩選通量低，目標(biāo)藥物作 用機(jī)理不明確等技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)，該靶點(diǎn)特異性甲型流感 病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)包括上述兩種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜 交體系。本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步目的在于提供上述靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母 雙雜交體系在篩選抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步目的在于提供上述靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母 雙雜交系統(tǒng)在篩選抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)，通過(guò) 轉(zhuǎn)化、引入甲型流感病毒PBl和PB2基因序列；PBl和PA基因序列；PB1、PB2及PA基因序列， 保證了該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白質(zhì)中，包 括甲型流感病毒RNA聚合酶的PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列或PBl亞基和PA亞基的 氨基酸序列或PBl亞基和PB2亞基及PA亞基的氨基酸序列。實(shí)現(xiàn)了通過(guò)篩選、確定對(duì)該靶 點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)起抑 制作用的藥物，來(lái)篩選抗流感病毒的藥物，保證了該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵 母雙雜交體系及系統(tǒng)的藥物篩選具有特異性高、篩選通量高和目標(biāo)藥物作用機(jī)理明確的優(yōu) 點(diǎn)ο


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的甲型流感病毒PB2、PBUPA基因PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳的結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PBl_pGBKT7酵母雙雜交重 組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例的酵母雙雜交體系、系統(tǒng)在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例的酵母雙雜交體系、系統(tǒng)PCR之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié) 果圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)通過(guò) 轉(zhuǎn)化、引入甲型流感病毒的PBl和PB2基因序列、PBl和PA基因序列或PB1、PB2及PA基因 序列，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)篩選、確定對(duì)該酵母雙雜交體系及系統(tǒng)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)起抑 制作用的藥物，來(lái)篩選抗甲型流感病毒的藥物，保證了該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩 選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)的藥物篩選具有特異性高、篩選通量高和目標(biāo)藥物作用機(jī)理明確 的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)施例提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，該 靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括甲型流感病毒的PBl基因和PB2基 因，該甲型流感病毒PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，該甲型流感病毒PB2基因的表達(dá)產(chǎn)物 是獵物蛋白。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系， 該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括甲型流感病毒的PBl基因和PA 基因，該甲型流感病毒PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，該甲型流感病毒PA基因的表達(dá)產(chǎn) 物是獵物蛋白。
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本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交 系統(tǒng)，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)包括上述兩種靶點(diǎn)特異性甲型 流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系。本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供上述靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體 系在篩選抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供上述靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系 統(tǒng)在篩選抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，通過(guò)轉(zhuǎn)化、 引入甲型流感病毒的PBl和PB2基因序列；PBl和PA基因序列；PB1、PB2及PA基因序列， 保證了該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)，包括甲型流感病毒的 RNA聚合酶的PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列；PBl亞基PA亞基的氨基酸序列；PBl亞基 和PB2亞基及PA亞基的氨基酸序列。實(shí)現(xiàn)了通過(guò)篩選、確定對(duì)該酵母雙雜交體系在相應(yīng)的 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)起抑制作用的藥物，來(lái)篩選抗流感病毒的藥物，保證了該抗流感 病毒藥物篩選酵母雙雜交體系的藥物篩選具有特異性高、篩選通量高和目標(biāo)藥物作用機(jī)理 明確的優(yōu)點(diǎn)。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)進(jìn)行詳細(xì)描述本發(fā)明實(shí)施例中的甲型流感病毒包括各種甲型流感病毒，例如流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 株A/PR8/34，Hl (Ni)、H3 (N2)亞型等。甲型流感病毒RNA聚合酶的三個(gè)亞基PBl、PB2、PA 在分子特征上具有保守性，在分子進(jìn)化中具有相同的基本序列。因此，本發(fā)明實(shí)施例中所述的甲型流感病毒PBl基因、PB2基因或PA基因，沒(méi)有特 別的限制，可以為任何的甲型流感病毒的PBl基因、PB2基因或PA基因。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系及系統(tǒng)使用 的酵母雙雜交質(zhì)粒包括兩種，一種酵母雙雜交質(zhì)粒表達(dá)的產(chǎn)物中包括酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因 子AD結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將甲型流感病毒PB2或PA的基因序列轉(zhuǎn)化、引入到該類酵母雙 雜交質(zhì)粒中；另一種酵母雙雜交質(zhì)粒表達(dá)的產(chǎn)物中包括酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子BD結(jié)構(gòu)域 的氨基酸序列，將甲型流感病毒PBl的基因序列轉(zhuǎn)化、引入到該類酵母雙雜交質(zhì)粒中。對(duì)本 發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系中所用的到的酵母雙雜 交質(zhì)粒沒(méi)有其他的限制。酵母雙雜交質(zhì)粒是指其表達(dá)產(chǎn)物中包含有酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子AD結(jié)構(gòu)域或BD 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，且用于蛋白質(zhì)相互作用的質(zhì)粒。甲型流感病毒的RNA聚合酶中，PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列相互作用，PBl 亞基和PA亞基的氨基酸序列相互作用，形成有效的RNA聚合酶。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異 性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系的靶點(diǎn)是上述PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列 相互作用或者PBl亞基和PA亞基的氨基酸序列的氨基酸序列相互作用或上述兩種作用的 組合。實(shí)施例1本發(fā)明實(shí)施例1提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系， 使用酵母雙雜交質(zhì)粒PGADT7和PGBKT7，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜 交體系還包括甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因和PB2基因，該P(yáng)Bl基因和PGBKT7重組，該P(yáng)B2基因和pGADT7重組。與該P(yáng)Bl基因互補(bǔ)的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，在SEQ ID NO :1中，第25位 至2298位的堿基序列對(duì)應(yīng)甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因的蛋白質(zhì)編碼 區(qū)；與該P(yáng)B2基因的堿基序列互補(bǔ)的DNA序列如SEQ IDNO 2所示，在SEQ ID NO :2中，第 28位至2307位的堿基序列對(duì)應(yīng)甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PB2基因的蛋白質(zhì)編 碼區(qū)。該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系中包括的外源基因序列為， 甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl-pGBKT7的基因序列、PB2-pGADT7的基因序列， 即外源基因序列包括甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因序列和pGBKT7的基因 序列、甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PB2基因序列和pGADT7的基因序列。本發(fā)明實(shí)施例的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系以甲型流感 病毒PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列存在相互作用形成復(fù)合體作為靶點(diǎn)來(lái)篩選藥物，具 有良好的特異性。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例2提供了靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，使用 酵母雙雜交質(zhì)粒PGADT7和pGBKT7，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系 還包括甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因和PA基因，該P(yáng)Bl基因和pGBKT7重 組，該P(yáng)A基因和pGADT7重組。與該P(yáng)Bl基因的堿基序列互補(bǔ)的DNA序列如SEQ ID NO :1所示；與該P(yáng)A基因的堿 基序列互補(bǔ)的DNA序列如SEQ ID NO: 3所示，在SEQ ID NO :3中，第25位至2175位的堿基 序列對(duì)應(yīng)甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PA基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系中包括的外源基因序列為， 甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl-pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 株A/PR8/34的PA-pGADT7的基因序列，即外源基因序列包括甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/ PR8/34的PBl基因序列和pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PA基 因序列和PGADT7的基因序列。本發(fā)明實(shí)施例的抗流感病毒藥物篩選酵母雙雜交細(xì)胞以PBl亞基和PA亞基的氨 基酸序列存在相互作用形成復(fù)合體作為靶點(diǎn)來(lái)篩選藥物，具有良好的特異性。實(shí)施例3本發(fā)明實(shí)施例3提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系， 該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括上述實(shí)施例1和實(shí)施例2的靶點(diǎn) 特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系。其中，實(shí)施例1的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，使用酵母 雙雜交質(zhì)粒PGADT7和pGBKT7，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系還包 括甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因和PB2基因，該P(yáng)Bl基因和pGBKT7重組， 該P(yáng)B2基因和pGADT7重組。實(shí)施例2的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，使用酵母雙雜交 質(zhì)粒pGADT7和pGBKT7，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系還包括甲型 流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl基因和PA基因，該P(yáng)Bl基因和pGBKT7重組，該P(yáng)A基
6因和pGADT7重組。與該P(yáng)Bl基因、該P(yáng)B2基因及該P(yáng)A基因的堿基序列互補(bǔ)的DNA序列如前面所述， 在此不重復(fù)闡述。該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系中包括的外源基因序列為， 甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PBl-pGBKT7的基因序列、甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株 A/PR8/34的PA-pGADT7的基因序列以及甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的PB2_pGADT7 的基因序列。本發(fā)明實(shí)施例的抗流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系以PBl亞基和PA亞基的氨 基酸序列、PBl亞基和PB2亞基的氨基酸序列存在相互作用形成復(fù)合體作為雙靶點(diǎn)來(lái)篩選 藥物，具有良好的特異性。制備實(shí)施例4本發(fā)明實(shí)施例制備方法中，A/PR8/34毒株即流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株的PB2、PBU PA 等基因T載體克隆由房師松克隆并保存；酵母雙雜交體系、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、YPDA(完全培 養(yǎng)基)、SD (基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、-Leu/_Trp、-Ade/-His/-Leu/_Trp、X- α -Gal 等購(gòu)自 Clontech 公司；PrimeStar Taq酶購(gòu)自TAKARA公司；所有限制性內(nèi)切酶、Τ4連接酶均購(gòu)自NEB公司； 引物合成和序列測(cè)定在大連寶生物公司完成。步驟一、引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank公布的流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株A/PR8/34的ΡΒ2基因序列、PBl基因 序列、PA基因序列和pGADT7、pGBKT7載體多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)三對(duì)引物，序列和酶切位點(diǎn) 見(jiàn)表1。表1酵母雙雜交體系構(gòu)建所用引物 該表1中的引物序列中，PBl基因的引物有PBl Forward即PBl正向引物和PBl Reverse即PBl反向引物；PBl基因正向引物的序列如SEQ ID NO :4所示，PBl反向引物的序 列如SEQ ID N0:5所示；PB2基因的引物有PB2Forward即正向引物和PB2 Reverse即反向 引物；PB2正向引物的序列如SEQ IDNO :6所示PB2反向引物的序列如SEQ ID NO :7所示， PA基因的引物有PAForward即PA正向引物和PA Reverse即PA反向引物，PA正向引物的 序列如SEQ ID NO :8所示，PA反向引物的序列如SEQ ID N0:9所示。引物序列劃有下劃線 的表示為該引物所對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
步驟二酵母雙雜交重組質(zhì)粒的構(gòu)建分別以A/PR8/34毒株P(guān)B2基因T載體質(zhì)粒DNA、PBl基因T載體質(zhì)粒DNA、PA基 因T載體質(zhì)粒DNA為模板，在上述PB2基因、PBl基因和PA基因的正反向引物和PrimeSI1AR TAQ酶條件下，利用PCR擴(kuò)增PB2、PBl和PA基因，反應(yīng)條件為95°C，5min ； [94°C、15sec， 58°C、20sec，72°C、2. 5min], 35cycles ；72°C, IOmin ；4°C, forever。割膠回收PB2基因、PBl基因和PA基因，將2yg的PB2基因、PA基因回收產(chǎn)物以 及2 μ g的pGADT7分別進(jìn)行Sfi I和BamH I雙酶切，將2 μ g的PBl基因回收產(chǎn)物和2 μ g 的PGBKT7分別進(jìn)行Sf i I和Xma I雙酶切。分別割膠回收上述PB2基因、PBl基因、PA基因、pGADT7、pGBKT7雙酶切產(chǎn)物，將 PB2酶切產(chǎn)物與pGADT7酶切產(chǎn)物連接、PA酶切產(chǎn)物與pGADT7酶切產(chǎn)物連接、PBl酶切產(chǎn)物 與pGBKT7酶切產(chǎn)物連接，得到PB2-pGADT7質(zhì)粒DNA、PBl_pGBKT7質(zhì)粒DNA、PA_pGADT7質(zhì)粒 DNA，構(gòu)建PB2-pGADT7、PA_pGADT7和PBl_pGBKT7酵母雙雜交重組質(zhì)粒。將上述PB2-pGADT7酵母雙雜交重組質(zhì)粒、PA_pGADT7酵母雙雜交重組質(zhì)粒，分別 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后經(jīng)Amp+LB培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，上述PBl_pGBKT7酵母雙雜交重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后經(jīng)Kana+LB培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)。本步驟中流感病毒PB2、PB1、PA基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果請(qǐng)參閱圖1，圖1顯示了步驟二中以PB2-T、PB1-T、PA-T質(zhì)粒DNA為模板，分別以 PB2、PB1、PA基因正反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)^ ο其中，Ml為IOOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；11為PB2基因PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶； 12為PBl基因PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶；13為PA基因PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶；14 為陰性對(duì)照。A/PR8/34 毒株 PB2、PB1、PA 基因全長(zhǎng)分別為 2280bp、2274bp 和 2151bp。從圖 1 可 以看出，利用所設(shè)計(jì)的雙雜交引物，成功擴(kuò)增了流感病毒A/PR8/34PB2、PBl、PA基因。本步驟中PB2、PBl、PA基因酵母雙雜交重組質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果請(qǐng)參閱圖2，圖2顯示了 PB2-pGADT7、PA_pGADT7和PBl_pGBKT7酵母雙雜交重組 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果。其中，M2為IOOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；21為PB2_pGADT7經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電 泳條帶圖；22為PBl-pGBKT7經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶；23為PA_pGADT7經(jīng)過(guò)PCR后 瓊脂糖凝膠電泳條帶；24為PB2基因陽(yáng)性對(duì)照；25為PBl基因陽(yáng)性對(duì)照；26為PA基因陽(yáng)性 對(duì)照；27為陰性對(duì)照。PCR結(jié)果表明，構(gòu)建的PB2-pGADT7、PA_pGADT7和PBl_pGBKT7重組質(zhì)粒均擴(kuò)增 出了目的條帶，條帶分別與陽(yáng)性對(duì)照一致。由此說(shuō)明，構(gòu)建的PB2-pGADT7、PA_pGADT7和 PBl-pGBKT7重組質(zhì)粒是成功的。本步驟中酵母雙雜交陽(yáng)性克隆的鑒定分別隨機(jī)挑取10 個(gè) PB2-pGADT7 (Amp+)、PA_pGADT7 (Amp+)和 PBl_pGBKT7 (Kana+) 轉(zhuǎn)化克隆，接種到篩選培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA并分別用克隆引物進(jìn)行 PCR鑒定，反應(yīng)條件同本步驟的PCR反應(yīng)。將PCR陽(yáng)性質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測(cè)定，陽(yáng)性克隆質(zhì) 粒DNA用于步驟三酵母轉(zhuǎn)化。
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分別將PCR結(jié)果陽(yáng)性的酵母雙雜交重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測(cè)定，PBl基因的正向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 10所示；PBl基因的反向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 11所示；PB2基因的正向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 12所示；PB2基因的反向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 13所示；PA基因的正向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 14所示；PA基因的反向序列測(cè)試結(jié)果如SEQ ID NO 15所示；上述PBl、PB2、PA基因的反向測(cè)序中，測(cè)序結(jié)果所得的序列分別和相應(yīng)的SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中的反向序列互補(bǔ)。例如，PBl反向測(cè)序結(jié)果即SEQ ID NO :11第1位的C對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :1中第2298 位 G，SEQ ID NO 11 第 570 位的 G 對(duì)應(yīng) SEQ ID NO 1 中第 1729 位的 C。分別將DNA檢測(cè)結(jié)果和甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株的PBl基因、PB2基因PA基因進(jìn) 行比對(duì)，表明，構(gòu)建的PB2-pGADT7、PA-pGADT7和PBl_pGBKT7酵母雙雜交重組質(zhì)粒目的基因 插入序列正確，沒(méi)有移碼突變，適用于酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。步驟三、建立酵母雙雜交體系及系統(tǒng)按Clontech公司酵母轉(zhuǎn)化試劑盒的方法，制備AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，將IOOng 的PB2-pGADT7質(zhì)粒DNA和PBl_pGBKT7質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到AH109酵母雙雜交細(xì)胞中，構(gòu)建流 感病毒PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞，得到甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系。該流感病 毒PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞是指轉(zhuǎn)化了流感病毒PBl基因和PB2基因的酵母細(xì)胞；將IOOng的PA_pGADT7質(zhì)粒DNA和PBl_pGBKT7質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到AH109酵母雙雜 交細(xì)胞中，構(gòu)建流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞，得到甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交 體系。該流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞是指轉(zhuǎn)化了流感病毒PA基因和PB 1基因的酵 母細(xì)胞。本發(fā)明實(shí)施例4的酵母雙雜交系統(tǒng)包括上述PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞和PA-PBl 酵母雙雜交細(xì)胞，即甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)包括上述兩種甲型流感病毒藥 物帥選酵母雙雜交體系。同時(shí)共轉(zhuǎn)化各IOOng的pGBKT-53+pGADT-T質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照；并且以未經(jīng)轉(zhuǎn)化 的酵母細(xì)胞為陰性對(duì)照。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的10倍稀釋液涂布SD/-Leu/-Trp篩選平板，30°C培養(yǎng)3_5天。計(jì)算 轉(zhuǎn)化效率并將生長(zhǎng)菌落劃線接種于SD/-Ade/-HiS/-LeU/-Trp/X-a -Gal篩選平板，30°C培 養(yǎng)3-5天。將蘭色菌落接種于液體SD/-Ade/-HiS/-LeU/-Trp培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜， 提取酵母質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)條件同步驟二。根據(jù)下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率transformation efficiency = [cfu X suspensionvolume(ml)]/[vol. plated(ml)X amount of DNA(μ g)上述PB2-pGADT7+PBl-pGBKT7 的轉(zhuǎn)化效率為 1. 4X 104cfu/μ g，上述 PA-pGADT7+PBl-pGBKT7 的轉(zhuǎn)化效率為 1. 6X 104cfu/ μ g,陽(yáng)性對(duì)照 pGBKT_53+pGADT_T 亮的 轉(zhuǎn)化效率為1 X IO4Cfu/μ g。在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X- α -Gal中，缺失組氨酸、亮氨酸和色氨酸，并且缺 失Ade，同時(shí)加入了 X-α -Gal作為顯色底物。轉(zhuǎn)化后的流感病毒ΡΒ2-ΡΒ1酵母雙雜交細(xì)胞、流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞和pGBKT-53+pGADT-T質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照分 別在SD/-Ade/-HiS/-Leu/-Trp/X- α -Gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。菌落呈蘭色即說(shuō)明，酵母細(xì)胞的 基因組能夠表達(dá)，生成了多肽，和顯色底物X- α -Gal相結(jié)合，使得菌落呈藍(lán)色，因此上述細(xì) 胞能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明酵母雙雜交體系或系統(tǒng)構(gòu)建成功。pGBKT-53+pGADT-T質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照 是指，在酵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)化、引入了 pGBKT-53+pGADT-T質(zhì)粒DNA，而沒(méi)有上述甲型流感病毒的 PBU ΡΒ2、PA基因序列；陰性對(duì)照是指在酵母細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)化、引入任何的上述本制備方法中 的質(zhì)粒DNA或甲型流感病毒ΡΒ1、ΡΒ2或PA基因序列。在上述SD/-Ade/-HiS/-Leu/-Trp/X- α -Gal培養(yǎng)基中由于缺失了上述氨基酸，陰 性對(duì)照的酵母細(xì)胞不能生長(zhǎng)菌落，沒(méi)有顏色。由于，PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是流感病毒RNA聚合酶PBl亞基的氨基酸序列；ΡΒ2基 因的表達(dá)產(chǎn)物是流感病毒RNA聚合酶ΡΒ2亞基的氨基酸序列；PA基因的表達(dá)產(chǎn)物是流感病 毒RNA聚合酶PA亞基的氨基酸序列；質(zhì)粒PGADT7的表達(dá)產(chǎn)物中包括了酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄 因子的AD (轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列；質(zhì)粒PGBKT7的表達(dá)產(chǎn)物包括了酵母細(xì)胞基因 轉(zhuǎn)錄因子BD(轉(zhuǎn)錄結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列。另外，PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物和ΡΒ2基因的 表達(dá)產(chǎn)物能夠相互結(jié)合形成復(fù)合物，PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物和PA基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠相互結(jié) 合形成復(fù)合物，由此能夠?qū)⒔湍讣?xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的AD區(qū)域和BD區(qū)域在空間上建立了聯(lián)系，形 成了具有活性的酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄因子，能夠啟動(dòng)酵母細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄。由此可知，本發(fā)明實(shí)施例的流感病毒ΡΒ2-ΡΒ1酵母雙雜交細(xì)胞由于轉(zhuǎn)化、引 入了 PB2-pGADT7和PBl_pGBKT7的基因序列，因此該酵母細(xì)胞的基因能夠表達(dá)，在 SD/-Ade/-Hi s/-Leu/-Trp/X- α -Gal培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)，并且顯蘭色，本發(fā)明實(shí)施例的甲 型流感病毒藥物帥選酵母雙雜交體系構(gòu)建成功；本發(fā)明實(shí)施例的流感病毒PA-PBl酵母 雙雜交細(xì)胞由于轉(zhuǎn)化、引入了 PA-pGADT7和PBl-pGBKT7的基因序列，因此能夠該酵母細(xì) 胞的基因能夠表達(dá)，在SD/-Ade/-HiS/-LeU/-Trp/X-a -Gal培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)，并且顯蘭 色，本發(fā)明實(shí)施例的甲型流感病毒藥物帥選酵母雙雜交體系構(gòu)建成功；本發(fā)明實(shí)施例的 酵母雙雜交系統(tǒng)由于轉(zhuǎn)化、引入了 PB2-pGADT7和PBl_pGBKT7的基因序列，PA_pGADT7 和PBl-pGBKT7的基因序列，因此能夠該酵母雙雜交體系的酵母細(xì)胞的基因能夠表達(dá)，在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a -Gal培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)，并且顯蘭色。同時(shí)，由于pGBKT-53和pGADT_T質(zhì)粒DNA的陽(yáng)性對(duì)照的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化、引入了 PGBKT-53和pGADT-T質(zhì)粒DNA，其表達(dá)的產(chǎn)物中含有酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AD區(qū)域的氨基酸序 列和BD區(qū)域的氨基酸序列，并且在空間上能夠建立聯(lián)系，因此能夠形成有效的轉(zhuǎn)錄因子， 能夠啟動(dòng)酵母細(xì)胞基因的表達(dá)，能夠在上述缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。本步驟中酵母雙雜交細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)的結(jié)果請(qǐng)參閱圖3，圖3顯示了上述流感病毒PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞、流感病 毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞、pGBKT-53+pGADT-T質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a -Gal 培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況其中，a為流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；b為流感病毒PB2-PB1酵 母雙雜交細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；c為陽(yáng)性對(duì)照的生長(zhǎng)情況；d為陰性對(duì)照的生長(zhǎng)情況。圖a中，流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞在上述培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)并且呈蘭色，因 此可以說(shuō)明，流感病毒PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞轉(zhuǎn)化、引入PA-pGADT7和PBl_pGBKT7是成功
10的。圖b中，流感病毒PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞在上述培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)并且呈蘭色，因 此可以說(shuō)明，流感病毒PB2-PB1酵母雙雜交細(xì)胞轉(zhuǎn)化、引入PB2-pGADT7和PBl_pGBKT7是成 功的。本步驟中酵母雙雜交細(xì)胞及體系PCR結(jié)果請(qǐng)參閱圖4，圖4顯示以提取的上述雙雜交酵母質(zhì)粒DNA為模板，分別以 PB2+PB1、PB2、PBl和PA+PB1、PBl、PA的正反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR的反應(yīng)條件和 上述步驟二相同，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。同時(shí)以酵母雙雜交體系陽(yáng)性對(duì)照 (pGBKT-53+pGADT-T)和AH109酵母為陰性對(duì)照，以PB2、PBU PA基因T載體質(zhì)粒DNA為相 應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照。其中，M3為IOOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為PB2-PB1雙基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶；2為PB2基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶圖；3為PBl基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶圖；4為PA-PBl雙基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶圖；5為PBl基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶圖；6為PA基因經(jīng)過(guò)PCR后瓊脂糖凝膠電泳條帶圖；7為PB2基因陽(yáng)性對(duì)照；8為PBl基因陽(yáng)性對(duì)照；9為PA基因陽(yáng)性對(duì)照；10為酵母雙雜交陽(yáng)性對(duì)照；11為陰性對(duì)照。圖4結(jié)果表明，在PB2-PB1、PA-PBl酵母雙雜交細(xì)胞及體系，PB2、PBl基因和PA、 PBl基因均分別共轉(zhuǎn)化到酵母AH109中。本制備方法使用甲型流感病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株作為樣本試驗(yàn)，但是甲型流感病毒的其 他變種，也可以用本試驗(yàn)方法，得到的試驗(yàn)結(jié)果相似，在此不詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)用實(shí)施例5將制備的甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系(PB2-PB1、PA-PB1)凍存菌液 50 μ 1分別接種至5ml SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。分 別將培養(yǎng)液10 μ 1接種至96孔深孔板中(每孔含lmlSD/-Ade/-HiS/-Leu/-Trp液體培養(yǎng) 基)，將待篩選藥物按不同濃度加入至每孔，30°C震蕩培養(yǎng)18小時(shí)，對(duì)每孔培養(yǎng)物進(jìn)行0D_ 測(cè)定，以酵母AH109作為對(duì)照。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算候選藥物對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，以 反映候選藥物抗甲型流感病毒的藥物作用效果。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
1權(quán)利要求
一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，其特征在于，所述靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括甲型流感病毒的PB1基因和PB2基因，所述甲型流感病毒PB1基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，所述甲型流感病毒PB2基因的表達(dá)產(chǎn)物是獵物蛋白。
2.一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系，其特征在于，所述靶點(diǎn)特 異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系包括甲型流感病毒的PBl基因和PA基因，所述 甲型流感病毒PBl基因的表達(dá)產(chǎn)物是誘餌蛋白，所述甲型流感病毒PA基因的表達(dá)產(chǎn)物是獵 物蛋白。
3.—種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)，其特征在于，所述靶點(diǎn)特 異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)包括如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的靶點(diǎn)特 異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系。
4.如權(quán)利要求1或2所述的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系在篩選 抗甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3所述的靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交系統(tǒng)在篩選抗 甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明適用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系、系統(tǒng)及應(yīng)用，該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系、系統(tǒng)包括甲型流感病毒PB1基因和PB2基因、PB1基因和PA基因、PB1和PB2及PA基因。利用該靶點(diǎn)特異性甲型流感病毒藥物篩選酵母雙雜交體系、系統(tǒng)的藥物篩選具有特異性高、篩選通量高和目標(biāo)藥物作用機(jī)理明確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101921713SQ201010228429
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者何建凡, 張仁利, 房師松 申請(qǐng)人:深圳市疾病預(yù)防控制中心