一種構建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及一種構建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的方法。
【背景技術】：
[0002] 酵母雙雜交系統(tǒng)利用了酵母的生長轉錄因子GAL4含有的兩個結構域，DNA結合域 (DNAbindingdomain，BD)及轉錄激活域（activationdomain，AD)，將已知基因（誘館基 因）和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構建在含BD及AD質粒載體上，當這兩種質粒共同 轉化酵母感受態(tài)細胞，若BD結合的誘餌蛋白能夠與AD結合的靶蛋白或文庫中某些cDNA編 碼的蛋白相互作用、彼此間結合時，則會導致位于側翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4 轉錄因子的完全活性，啟動下游的報告基因如Ade、His及Lac等的表達，從而在特定的缺陷 培養(yǎng)基上生長。因此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，還可以研 宄己知蛋白間的相互作用。
[0003] 其中酵母雙雜交cDNA文庫的構建一般在cDNA兩端加上同源重組序列，然后與革巴 蛋白載體如pGADI7-Rec共同轉化革巴蛋白酵母菌株如AH109,在酵母同源重組酶的作用下， cDNA序列整合到載體上，完成cDNA文庫的構建。由于絕大多數(shù)真核細胞mRNA 3'端具有 P〇ly(A)尾，所以提取真核生物的總RNA后可通過使用帶有Oligo(dT)的同源重組序列與其 配對，僅mRNA可被反轉錄，同時反轉錄得到的cDNA已加上同源重組序列。
[0004] 但是細菌的mRNA絕大部分不帶有Poly(A)尾，并且mRNA僅占總RNA的1-4%，若 使用隨機六聚體作為引物，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，合成的cDNA 中96 %來源于rRNA，成分過于復雜?，F(xiàn)有的針對細菌文庫的構建一般是通過使用限制性內 切酶對細菌基因組DNA進行不完全酶切，然后與文庫載體連接后轉化大腸桿菌，無法避免 內切酶對位點的偏向性，大大降低文庫的豐度，因此細菌的cDNA文庫的構建及篩選一直被 限制。

【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能高質量構建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的構建細菌 的酵母雙雜交cDNA文庫的方法。
[0006] 本發(fā)明的酵母雙雜交cDNA文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0007] 提取細菌總RNA，再去除總RNA中的5s rRNA、tRNA及小分子RNA，再對mRNA進行 富集，使用隨機六聚體作為引物對富集的mRNA進行逆轉錄PCR(RT-PCR)合成單鏈的cDNA， 再通過LD-PCR以單鏈的cDNA為模板擴增獲得雙鏈cDNA，再利用同源重組將全長雙鏈cDNA 與文庫載體共同轉化靶蛋白酵母菌株，獲得細菌的cDNA文庫。
[0008] 優(yōu)選，所述的去除總RNA中的5srRNA、tRNA及小分子RNA是利用試劑盒 MEGAclear?Kit去除的。
[0009] 優(yōu)選，所述的對mRNA進行富集是利用試劑盒MICROB ExpressTM Bacterial mRNAEnrichment Kit(Ambion)對mRNA進行富集。
[0010] 優(yōu)選，所述的酵母菌株為酵母菌株AH109。
[0011] 與已有方法相比，本發(fā)明提出了一種以細菌mRNA作為模板，反轉錄合成cDNA后 構建酵母雙雜交cDNA文庫的方法。由于是以mRNA為模板，不僅避免了以總RNA反轉錄時 rRNA產生干擾，也可以避免使用限制性內切酶對細菌基因組DNA的位點偏向性，文庫的開 放性閱讀框的正確性更高，質量非常好。
【附圖說明】：
[0012] 圖1是細菌總RNA的電泳檢測圖；
[0013] 圖2是去除5srRNA、tRNA及小分子RNA的RNA樣品的電泳檢測圖；
[0014] 圖3是富集的mRNA的電泳檢測圖；
[0015] 圖4是擴增獲得的雙鏈cDNA的電泳檢測圖；
[0016] 圖5是用BD CHROMA SPIN TE-400濾柱純化回收雙鏈cDNA的電泳檢測圖；
[0017] 圖6是酵母雙雜交菌株Y2HG0LD的SD/-Leu平板涂布生長圖；
[0018] 圖7是cDNA文庫質量檢測的電泳檢測圖。
【具體實施方式】：
[0019] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0020] 實施例1 :細菌總RNA的提取
[0021] 將已活化的變形賴氨酸芽胞桿菌（Lysinibacillusvarians.)[其由賴氨酸芽孢 桿菌（Lysinibacillussp. )GY32(該菌于2011年9月7日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，地址：中國武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCCNO:M2011307,公開于中國專利： ZL201110300903. 8)改名而來]轉接到LB液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，8000rpm 4°C離心2min，棄上清。加入lmLTRIZ0L提取液，搖勾，漩禍振蕩lOmin，加200iiL氯仿，混 勾5min，室溫放置5min，4°C，13000rpm離心lOmin。吸取上清于另一干凈的離心管中（約 600yL)，加入400yL異丙醇，_20°C沉淀lOmin，12000rpm離心lOmin。倒掉上清，加入lmL 75%乙醇，輕彈，8000rpm離心5min，倒掉上清，重復2次。RNA室溫風干，加入20-30yLDEPC 處理水溶解，電泳檢測如圖1所示，_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，得到總RNA。
[0022] 實施例2 :純化并去除5srRNA、tRNA及小分子RNA，對mRNA進行富集；
[0023] 2. 1純化并去除5srRNA、tRNA及小分子RNA
[0024]使用Ambionk'公司的MEGAclear?Kit處理總RNA。往RNA樣品添加Elution Solution至體積為 100yL，混勾；添加 350yL的BindingSolution，混勾；添加 250yL100%的乙醇，混勾；把FilterCartridge套入CollectionandElutionTube中，將上述混 合液轉移至FilterCartridge，lOOOOrpm離心lmin，倒掉廢液；往FilterCartridge添加 500yLWashSolution，lOOOOrpm離心 30sec，倒掉廢液，重復一次；把FilterCartridge 套入新的Collection/ElutionTube，往FilterCartridge中心添加 50yLElution Solution，65-70°C處理10min，離心收集溶液并電泳檢測，如圖2所示，總RNA樣品已去除 5srRNA、tRNA及小分子RNA，由此得到去除5srRNA、tRNA及小分子RNA的RNA樣品。
[0025]2. 2對mRNA進行富集
[0026]選擇Ambinn?-公司的MICROBExpressTMBacterialmRNAEnrichmentKit 對mRNA進行富集，該體系對總RNA的質量和純度要求是：A260/A280>1. 7,最大量不超過 10yg，并且最大體積不超過15yL;要求EDTA濃度大于ImM，以螯合二價陽離子防止在加 熱過程中RNA水解。200yLBindingBuffer加到1. 5mLEppendorf管中（試劑盒提供）， 然后加入 2-10ygTotalRNA(〈10yg，〈15yL)(步驟 2. 1 中得到的去除 5srRNA、tRNA及 小分子RNA的RNA樣品），小心混勾。加4yLCaptureOligoMix，小心混勾，低速離心， 將液體收集到管底。70°C加熱10min，使rRNA變性破壞其二級結構，以便rRNA與capture Oligonucleotide充分雜交。37°C退火 15min，rRNA與captureoligonucleotide雜交。 延長退火時間對雜交充分有一定的幫助作用。在1.5mLEppendorf管加入所需的Oligo MagBeads，每個樣品需要50yL。將1.5mLEppendorf管至于磁力架上，使OligoMagBeads 完全吸附到有磁性的一面，然后，小心地吸取上清并棄掉。加入等體積的Nuclease-free Water，小心地混勾，清洗OligoMagBeads，然后同上操作。加入等體積的BindingBuffer， 小心地混勾，平衡OligoMagBeads，同上操作。加入等體積的BindingBuffer，小心地混勾， 然后放入37°C水浴。向RNA/CaptureOligoMix中加入50yL處理好的OligoMagBeads， 小心混勻，輕輕離心收集到管底。然后37°C溫育15min。使用磁力架吸附OligoMagBeads， 然后小心地將上清（含有富集的mRNA)轉移到已置于冰上預冷的CollectionTube中。向 OligoMagBeads加入100yL預熱到37°C的WashSolution，小心地混勾。然后使用磁力 架吸附OligoMagBeads，最后小心地將上清轉移到已經含有mRNA的CollectionTube中。 在已獲得的350yL洗脫液中加入1/10體積的3MSodiumAcetate(醋酸鈉，35yL)，1/50 體積的5M的Glycogen(糖原，7yL)。加入3倍體積的冰冷的無水乙醇（1175yL)，充分混 勻，-20°C沉淀至少lh。13000rpm離心30min，小心吸去上清。加入70%的乙醇750yL洗滌 沉淀，13000rpm離心10min，再洗絳一次。室溫下放置5min后加入50yL的Nuclease-free Water重新溶解沉淀。取出部分進行電泳檢測如圖3所示，mRNA已被富集，將其余的mRNA 放于-70°C備用，由此得到富集的mRNA。
[0027] 實施例3獲得雙鏈cDNA
[0028] 3. 1使用隨機六聚體作為引物合成單鏈cDNA
[0029] 滅菌離心管加1-2yLRNA(0. 025-1. 0ygmRNA)(實施例2中的富集的mRNA)、 1. 0yL⑶SIII/6引物，加入滅菌去離子超純水至總體積為4. 0yL;混勻，72°C水浴2分鐘； 冰水中冷卻2分鐘，輕微離心；加入以下試劑：2. 0yL5XFirs