基因的重組表達(dá)與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種干酪乳桿菌來源的磷脂酶4基 因的重組表達(dá)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酶A2，英文名為phospholipaseA2，簡(jiǎn)寫為PLA2，它可催化磷脂甘油分子二位 酰基水解生成溶血卵磷脂和游離脂肪酸，而溶血卵磷脂在食品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域中有重 要應(yīng)用，日本已將其作為天然食品添加劑。因此，它是工業(yè)生產(chǎn)中一種重要的酶。
[0003]磷脂酶A2廣泛存在于各種生物體內(nèi)。其最早是由生物組織中直接提取，但存在提 取率低、操作復(fù)雜等問題。一些哺乳類動(dòng)物磷脂酶A2基因已經(jīng)被嘗試在大腸桿菌、曲霉等 宿主菌中進(jìn)行重組表達(dá)，但存在形成包涵體、表達(dá)量低達(dá)不到工業(yè)化應(yīng)用等問題，同時(shí)，利 用這些表達(dá)宿主表達(dá)一些復(fù)雜的哺乳動(dòng)物磷脂酶A2基因會(huì)存在一些限制，如無法完成相應(yīng) 重組蛋白的后加工，這些表達(dá)宿主菌的遺傳背景會(huì)限制重組酶的相關(guān)應(yīng)用等，另外，有研宄 發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)磷脂酶A2會(huì)對(duì)大腸桿菌，酵母等表達(dá)宿主發(fā)生毒害作用，從而限制了相應(yīng)的 重組表達(dá)及應(yīng)用。而將微生物來源的磷脂酶A2基因在乳酸克魯維酵母中進(jìn)行重組表達(dá)，可 以有效改善上述問題。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外沒有關(guān)于將微生物來源磷脂酶A2基因在乳酸克魯維酵 母中進(jìn)行重組表達(dá)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請(qǐng)人提供了一種干酪乳桿菌磷脂酶a2基因的 重組表達(dá)與應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)克隆到的干酪乳桿菌磷脂酶a2基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，利 用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了干酪乳桿菌磷脂酶a2基因，并研宄了不同發(fā)酵條件對(duì)重組菌株生長(zhǎng) 及產(chǎn)酶影響。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006]干酪乳桿菌磷脂酶a2基因的重組表達(dá)方法，依次包括基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)、重組載體 的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵；
[0007] 所述表達(dá)載體的構(gòu)建是：根據(jù)NCBI公布的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因序列， signalP進(jìn)行基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)，利用特異性引物在成熟肽兩端引入限制性酶切位點(diǎn)，將其亞 克隆到載體PKLAC1中，得到表達(dá)載體pKLACl-pla2.;
[0008] 所述轉(zhuǎn)化與篩選是：用構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母，篩選重組乳酸克 魯維酵母菌株實(shí)現(xiàn)重組磷脂酶4的表達(dá)；
[0009] 所述表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)是：收集重組乳酸克魯維酵母發(fā)酵上清液，卵黃平板初步檢 測(cè)酶活；
[0010] 所述重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵發(fā)酵是：對(duì)重組乳酸克魯維酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條 件是：葡萄糖為1% -3%、酵母粉為1% -2%、蛋白胨為1% -3%、KH2P04S0. 1% -0. 3%、 接種量為1%-4%以及裝液量70-100ml。優(yōu)化的發(fā)酵條件是：葡萄糖為3%、酵母粉為2%、 蛋白胨為3 %、KH2P04S0. 3 %、接種量為2 %以及裝液量90ml。
[0011] 干酪乳桿菌磷脂酶4基因在乳酸克魯維酵母中的重組表達(dá)為分泌表達(dá)。
[0012] 所述的特異性引物是：
[0013] 以干酪乳桿菌基因組為模板，pla2-F/pla2_R為引物，引物兩端分別引入XhoI 和BglII酶切位點(diǎn)，并在基因上游同時(shí)引入Kex酶切位點(diǎn)基因序列，擴(kuò)增出未包含信號(hào)肽 的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因，即所述引物；
[0014] 所述引物序列為：
[0015] pla2-F:5, -CCGCTCGAGAAAAGAACGACTAAGACTGAGTTTAATG-3,；
[0016] pla2-R:5' -GGAAGATCTTCAACCACCAAACAACTTATATG-3'。
[0017] 本重組磷脂酶A2應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。
[0018] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0019] 本發(fā)明利用克隆到的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，以提供磷脂 酶A2的重組表達(dá)與應(yīng)用。重組磷脂酶A2可應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。本發(fā)明通 過DNA重組技術(shù)，將干酪乳桿菌磷脂酶A2基因擴(kuò)增出來，構(gòu)建重組表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了干酪乳 桿菌磷脂酶A2基因在乳酸克魯維酵母中的重組表達(dá)，并研宄了不同發(fā)酵條件對(duì)重組菌株 生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響，為磷脂酶A2的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0020] 本發(fā)明在乳酸克魯維酵母中表達(dá)了干酪乳桿菌來源磷脂酶A2,卵黃平板初步檢測(cè) 酶活，酸堿滴定法測(cè)定酶活大小，SDS-PAGE顯示重組蛋白條帶，說明表達(dá)成功。另外，通過 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，重組磷脂酶A2酶活達(dá)可達(dá)到6. 56U/ml，為磷脂酶A2的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基 礎(chǔ)。
[0021] 本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物可應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :是干酪乳桿菌磷脂酶A2氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖；
[0023] 圖2 :是重組表達(dá)載體酶切驗(yàn)證圖；
[0024] 圖3 :是卵黃平板法檢測(cè)重組菌發(fā)酵上清磷脂酶A2酶活性圖；
[0025] 圖4 :是重組菌發(fā)酵上清表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
[0026] 圖5 :是重組菌GG799/pKLACl-pla2發(fā)酵生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線；
[0027] 圖6 :是鈣離子濃度對(duì)重組酶磷脂酶A2酶活影響圖；
[0028] 圖7 :是碳源對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖；
[0029] 圖8 :是氮源對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖；
[0030] 圖9 :是無機(jī)鹽對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖；
[0031] 圖10 :是接種量對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖；
[0032] 圖11 :是初始pH對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖；
[0033] 圖12 :是裝液量對(duì)GG799/pKLACl-pla2生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。其中重組磷脂酶A2購自江南大學(xué)中國(guó)高 校工業(yè)微生物資源和信息中心，乳酸克魯維酵母購自紐英倫生物技術(shù)有限公司。
[0035] 利用Kluyveromyces lactis GG799表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組磷脂酶A2。
[0036] (1)干酪乳桿菌磷脂酶A2基因信號(hào)肽的預(yù)測(cè)：
[0037] NCBI上查得干酪乳桿菌磷脂酶^基因序列及相應(yīng)編碼的氨基酸序列，SignalP 4. lserver(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)， 預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1所示。
[0038] (2)重組表達(dá)載體pKLACl_pla2的構(gòu)建：
[0039] 根據(jù)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果，以干酪乳桿菌基因組為模板，pla2-F/pla2_R為引物，弓丨 物兩端分別引入Xho I和BglII酶切位點(diǎn)位點(diǎn)，并在基因上游同時(shí)引入Kex酶切位點(diǎn)基因 序列，擴(kuò)增出未包含信號(hào)肽的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因。將載體pKLACl和目的基因用Xho I和BglII分別酶切，膠回收，于16°C過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109。然后，提取JM109/ pKLACl-pla2菌株質(zhì)粒，XhoI和BglII酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，篩選出JM109/pKLACl-pla2陽性菌株。
[0040] (3)線性化質(zhì)粒pKLACl_pla2電轉(zhuǎn)化Kluyveromyces lactis GG799以及轉(zhuǎn)化子的 篩選：
[0041] 提取JM109/pKLACl-pla2陽性菌株質(zhì)粒，經(jīng)Sac II線性化后電轉(zhuǎn)化 Kluyveromyces lactis GG799,涂布YCB平板，乙酰胺篩選，3-4天挑取單菌落。通過玻璃珠 法提取重組菌染色體基因組，利用整合引物（見表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選出成功整合目的 基因的多拷貝重組菌。
[0042] 表1引物
[0043]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 干酪乳桿菌磷脂酶A2基因的重組表達(dá)方法，其特征在于：依次包括基因信號(hào)肽預(yù) 測(cè)、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與篩選、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵； 所述表達(dá)載體的構(gòu)建是：根據(jù)NCBI公布的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因序列，SignalP進(jìn) 行基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)，利用特異性引物在成熟肽兩端引入限制性酶切位點(diǎn)，將其亞克隆到載 體pKLACl中，得到表達(dá)載體pKLACl_pla2 ; 所述轉(zhuǎn)化與篩選是：用構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母，篩選重組乳酸克魯維 酵母菌株實(shí)現(xiàn)重組磷脂酶4的表達(dá)； 所述表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)是：收集重組乳酸克魯維酵母發(fā)酵上清液，卵黃平板初步檢測(cè)酶 活； 所述重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵發(fā)酵是：對(duì)重組乳酸克魯維酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件是： 葡萄糖為1% -3%、酵母粉為1% _2%、蛋白胨為1% -3%、KH2P04S〇. 1% -0. 3%、接種量 為1% -4%以及裝液量70-100ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：干酪乳桿菌磷脂酶A 2基因在乳酸克魯維 酵母中的重組表達(dá)為分泌表達(dá)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的特異性引物是： 以干酪乳桿菌基因組為模板，pla2-F/pla2-R為引物，引物兩端分別引入Xho I和 Bgl II酶切位點(diǎn)，并在基因上游同時(shí)引入Kex酶切位點(diǎn)基因序列，擴(kuò)增出未包含信號(hào)肽的干 酪乳桿菌磷脂酶A2基因，即所述引物； 所述引物序列為： pla2-F :5' -CCGCTCGAGAAAAGAACGACTAAGACTGAGTTTAATG-3' ； pla2-R :5' -GGAAGATCTTCAACCACCAAACAACTTATATG-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌磷脂酶A 2基因的重組表達(dá)方法，其特征在于： 所述重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵的發(fā)酵條件是：葡萄糖為3%、酵母粉為2%、蛋白胨為3%、KH 2PO4S 0. 3%、接種量為2%以及裝液量90ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因的重組表達(dá)方法，其特征在于：重 組磷脂酶A2應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域。
【專利摘要】干酪乳桿菌磷脂酶A2基因的重組表達(dá)方法，依次包括基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)、重組載體的構(gòu)建﹑轉(zhuǎn)化與篩選﹑表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，重組菌產(chǎn)酶發(fā)酵；首先根據(jù)干酪乳桿菌磷脂酶A2基因序列，signalP進(jìn)行基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)，利用特異性引物在成熟肽兩端引入限制性酶切位點(diǎn)，將其亞克隆到載體pKLAC1中，得到表達(dá)載體pKLAC1-pla2；然后篩選重組乳酸克魯維酵母菌株實(shí)現(xiàn)重組磷脂酶A2的表達(dá)；接著收集發(fā)酵上清液，卵黃平板初步檢測(cè)酶活；最后對(duì)酵母進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明根據(jù)克隆到的干酪乳桿菌磷脂酶A2基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了干酪乳桿菌磷脂酶A2基因，并研究了不同發(fā)酵條件對(duì)重組菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響。
【IPC分類】C12N15-81, C12N9-18, C12N15-66
【公開號(hào)】CN104651391
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510078380
【發(fā)明人】張梁, 王輝, 李由然, 顧正華, 丁重陽, 石貴陽
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日