一種干酪乳桿菌抗菌肽的合成和抗體制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽及其抗體的制備方法，特別是用于針對干酪乳桿菌抗菌肽和抗干酪乳桿菌抗菌肽多克隆的抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活和健康水平的不斷提高，人們對綠色食品的需求越來越大，食品安全意識也越來越高。而在全球應(yīng)用了半個多世紀(jì)的飼用抗生素，雖然在提高飼料利用率、改善畜產(chǎn)品產(chǎn)量、增加畜牧業(yè)養(yǎng)殖效益等方面發(fā)揮了巨大作用；然而，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用，不僅造成耐藥性菌株的產(chǎn)生，也會造成畜產(chǎn)品的藥品殘留，帶來食品安全隱患。因此，研究開發(fā)安全、高效的新型飼用抗生素替代產(chǎn)品成為熱點(diǎn)。
[0003]隨著研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)具有非常優(yōu)良的特性:如可抑制多種病原微生物，具有較好的選擇性殺菌效果；易被消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶、靡蛋白酶等)所降解，在動物體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積性積累；無毒副作用、無殘留、無抗藥性，避免農(nóng)用抗生素通過食物鏈的傳遞對人體產(chǎn)生的威脅，同時也不污染環(huán)境；總之抗菌肽有類似抗生素飼料添加劑的有益作用，符合畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)的需要，適合在飼料生產(chǎn)中使用，具有作為新一代飼料添加劑的潛質(zhì)。但到目前為止，抗菌肽的作為飼料添加劑大規(guī)模應(yīng)用在飼料業(yè)還是屈指可數(shù)。
[0004]另外，在我國，干酪乳桿菌行業(yè)發(fā)展尚處于起步階段，國內(nèi)干酪乳桿菌行業(yè)生產(chǎn)商或銷售商銷售量較低，其大批量使用的干酪乳桿菌菌種及發(fā)酵劑大都來自國外知名廠商，因此干酪乳桿菌行業(yè)還有較大的發(fā)展空間；目前干酪乳桿菌在食品，特別是乳制品中有一定的應(yīng)用，但在飼料中添加的研究還很少，且國內(nèi)的學(xué)者對干酪乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素(又名抗菌肽)的生產(chǎn)工藝研究及其檢測還在起步階段，而商業(yè)化產(chǎn)品也很有限。
[0005]目前，有關(guān)干酪乳桿菌細(xì)菌素(抗菌肽)專利申請如下:申請?zhí)?201010277557.1，發(fā)明名稱“一種干酪乳桿菌細(xì)菌素及其在飼料中的應(yīng)用”，該專利涉及一種干酪乳桿菌細(xì)菌素及其在飼料中的應(yīng)用，并具體公開了一株干酪乳桿菌所述的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，保藏名稱為干酪乳桿菌LyT-7，其保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為:CCTCC NO:M2010197,以及生產(chǎn)細(xì)菌素的方法，和細(xì)菌素粗提物在飼料中的應(yīng)用；提供了一種干酪乳桿菌細(xì)菌素，它對熱、酸穩(wěn)定，能被蛋白酶降解，抑菌譜廣，具有作為飼料添加劑應(yīng)用的前景。但是對于干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝和作為飼料添加劑的大規(guī)模生產(chǎn)工藝不涉及，也不涉及檢測細(xì)菌素(抗菌肽)快速檢測。
[0006]申請?zhí)?201310162105.2，發(fā)明名稱為“一種干酪乳桿菌發(fā)酵液在飼料中的應(yīng)用”，公開一種干酪乳桿菌LyT-7的發(fā)酵液在飼料中的應(yīng)用，具體公開了該菌株的大規(guī)模發(fā)酵獲得的干酪乳桿菌發(fā)酵液，通過噴霧干燥并經(jīng)加入脫毒后的油菜餅制成的飼料添加劑。但是對于具體的發(fā)酵液的細(xì)菌素(抗菌肽)的快速精確檢測，未有進(jìn)一步的披露；因此為了適應(yīng)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中對于細(xì)菌素(抗菌肽)效價的迫切需要，一種快速檢測細(xì)菌素(抗菌肽)效價的方法研究很有必要。
[0007]而免疫學(xué)的檢測方法因特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。但目前針對干酪乳桿菌細(xì)菌素(抗菌肽)的研究所用的抗體，市場上尚無商業(yè)化產(chǎn)品。因此，如何獲得特異性強(qiáng)、效價比高的抗體就成了研究中亟待解決的問題，但是受天然細(xì)菌素本身的理化性質(zhì)，高純度目的細(xì)菌素獲得并非易事，從而影響了相應(yīng)多克隆抗體的獲得；基于以上原因，我們擬人工合成干酪乳桿菌抗菌肽，并制備相關(guān)的干酪乳桿菌抗菌肽多克隆抗體，對進(jìn)而干酪乳桿菌抗菌肽的快速檢測提供基礎(chǔ)。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個目的在于提供一種干酪乳桿菌抗菌肽的合成。本發(fā)明利用該菌株產(chǎn)生的一種對熱、酸堿穩(wěn)定，具有廣譜抑菌性的天然細(xì)菌素(又名抗菌肽)，對該細(xì)菌素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后，人工合成。
該干酪乳桿菌的保藏單位是:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏時間是:2010年08月09號，保藏號是:CCTCC NO:M2010197，其分類命名為:干酪乳桿菌 lyT-7 (Lactobacillus casei lyT-7) ο
[0010]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)實(shí)現(xiàn):
步驟一:所述天然細(xì)菌素按照以下方法得到:用于培養(yǎng)干酪乳桿菌lyT-7的培養(yǎng)基為:葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%。所述培養(yǎng)溫度為30°C，靜置培養(yǎng)48h ;得到的發(fā)酵液離心取上清。
[0011]步驟二:向該上清液加入硫酸銨至終飽和度50%進(jìn)行鹽析；然后離心取沉淀，將沉淀物裝入流量為1000的透析袋中在純水中透析，并用聚乙二醇濃縮，得到細(xì)菌素粗提物；將該細(xì)菌素粗提物進(jìn)一步進(jìn)行經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱純化；將收集到的細(xì)菌素樣品進(jìn)行RP-HPLC分離，得到最終的有抑菌活性的細(xì)菌素。
[0012]步驟三:采用質(zhì)譜儀對最終得到的細(xì)菌素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。此細(xì)菌素包含16個氨基酸殘基，其全序列為:MDSLKTLLVANRGEIV (N-C)。
[0013]步驟四:采用固相化學(xué)合成法，用多肽自動合成儀合成人工干酪乳桿菌抗菌肽。在合成所述多肽序列時，在其C端增加一個半胱氨酸，以方便與載體蛋白偶聯(lián)。
[0014]步驟五:將合成的多肽使用高效液相色譜進(jìn)行純度測定，并使用電噴射質(zhì)譜法對合成多妝進(jìn)彳丁鑒定，完成多妝的制備。
[0015]本發(fā)明的另一目的在于提供一種特異性好、純度高、可與天然的干酪乳桿菌細(xì)菌素(抗菌肽)特異識別的多肽多克隆抗體及其制備方法。
[0016]所述的干酪乳桿菌抗菌肽多克隆抗體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
步驟一:將純化后的抗菌肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH )偶聯(lián)制備得到免疫原，與牛血清蛋白(Bovine albumin，BSA)偶聯(lián)制備得到包被原。
[0017]步驟二:得到的免疫抗原與福氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，對新西蘭白兔進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射，初次免疫后，每2周免疫I次，進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。
[0018]步驟三:最后一次加強(qiáng)免疫10天后，將兔子處死，頸動脈取血。收集、分離得到含有兔抗干酪乳桿菌抗菌肽抗體的血清。
[0019]步驟四:將抗血清通過用親和層析法進(jìn)行肽親和純化，得到干酪乳桿菌抗菌肽抗體。
[0020]步驟五:對干酪乳桿菌抗菌肽抗體進(jìn)行ELISA效價檢測。
[0021]
【附圖說明】
[0022]圖1:顯示了干酪乳桿菌抗菌肽合成的純度分析的HPLC檢測結(jié)果。其中表示目的峰，縱坐標(biāo)表示洗脫峰在220nm的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時間。
[0023]圖2:顯示了干酪乳桿菌抗菌肽合成的一級結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜圖。其中縱坐標(biāo)表示相對豐度(％)，橫坐標(biāo)表示質(zhì)荷比(m/z )。
[0024]
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0026]實(shí)施例1:干酪乳桿菌抗菌肽的設(shè)計(jì)和合成