一種比伐盧定的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域,具體設(shè)及一種新的比伐盧定的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 比伐盧定(Bivalirudin)屬于直接凝血酶抑制劑(directthrombin inhibitor,DTI),由20個氨基酸殘基組成。其膚序結(jié)構(gòu)如下:
比伐盧定結(jié)構(gòu)如下:
CAS# :128270-60-0 ;分子式:CgsHi3sN24〇33;分子量:2180. 29。
[0003] 比伐盧定為水賠素衍生物,包括20個氨基酸殘基的多膚。本品為凝血酶 (t虹ombin)直接的、特異的、可逆性抑制劑。無論凝血酶處于血循環(huán)中還是與血栓結(jié)合,本 品均可與其催化位點(diǎn)和陰離子結(jié)合位點(diǎn)(又稱底物識別位點(diǎn))發(fā)生特異性結(jié)合,從而直接 抑制凝血酶的活性。主要用于預(yù)防血管成型介入治療不穩(wěn)定性屯、絞痛,前后的缺血性并發(fā) 癥。
[0004] 比伐盧定的制備方法,國內(nèi)外已有文獻(xiàn)和專利報道。CN102816208A、 CN102264757A、CN103864895A、CN103864894A、CN101475631AChem.曲arm.Bull. 1996, 44:1344 ~1350)和化r.J.Biochem. 1999, 265:598 ~605)報道 了比伐盧定的Fmoc 固相合成法,采用王樹脂為開始的載體樹脂,依次接入保護(hù)氨基酸,所得膚樹脂采用 =氣醋酸酸解而得比伐盧定。由于比伐盧定結(jié)構(gòu)中含有5個Gly,在固相法依次接 入Fmoc-Gly過程中,由于Gly自身的特性,產(chǎn)品在合成中易產(chǎn)生Bivalirudin+IGly、 Bivali;rudin±2Gly等雜質(zhì),而運(yùn)些雜質(zhì)與比伐盧定的極性相近,在純化的時候很難完全 純化掉,影響產(chǎn)品收率和純度,從而影響藥的安全性。為了解決比伐盧定合成中加Gly 和減Gly問題,專利W02010117725A,在接膚中使用Fmoc-Gly-Gly-OH為原料,但此方法 僅僅解決了Bivalirudin+IGly雜質(zhì)的產(chǎn)生,而無法解決Bivalirudin±2Gly雜質(zhì)的產(chǎn) 生。為了解決比伐盧定合成中Bivalirudin+lGly和Bivali;rudin±2Gly雜質(zhì),專利CN102286076A、CN102532274A和CN102260323A都在比伐盧定膚樹脂合成過程中使用四膚 片段Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH;專利CN104031127A在比伐盧定膚樹脂合成過程中使用六 膚片段Fmoc-Arg任bf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH;專利CN10324243IA在比伐盧定膚樹脂 合成過程中使用五膚片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。采用運(yùn)些小膚片段,雖然對控 審IjBivalirudin+IGly和Bivalirudin±2Gly雜質(zhì)有效果,但運(yùn)些片段也有自身缺陷,片段 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH溶解性較差,會給接膚反應(yīng)帶來困難;六膚片段Fmoc-Argfbf )-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和五膚片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH,運(yùn)兩個片段因鏈 長較長,偶聯(lián)反應(yīng)活性較差是一方面,另一方面要得到高純度片段本身也比較困難。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明旨在提供一種新的比伐盧定的制備方法,該制備方法使用了新的小膚片 段,能有效避免Bivalirudin+IGly和Bivali;rudin±2Gly雜質(zhì)的產(chǎn)生,提高了產(chǎn)品收率和 純度,反應(yīng)效率高,有利于規(guī)?;a(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明比伐盧定的制備方法,(1)、W保護(hù)氨基酸、片段和樹脂為原料,采用多膚 固相合成法依次偶聯(lián)得到比伐盧定膚樹脂Ri-D-Phe-Pro-Arg任bf) -X-Y-Gly-Asp(0巧U )-Phe-Glu(01:Bu)-Glu(01:Bu)-Ile-Pro-Glu(01:Bu)-Glu(01:Bu)-Tyr(tBu)-Leu-樹脂,其 中Ri為H、Boc、Fmoc;X為Pro-Gly-Gly,Y為Gly-Gly-Asnad)或X為Pro-Gly,Y為 Gly-Gly-Gly+Asn燈的)。(2)、加入酸解試劑燈FA/TIS/EDT/UO)酸解,用乙酸沉淀并收集 得到比伐盧定粗品;(3)、將比伐盧定粗品通過Cis柱分離純化,獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0007]本發(fā)明義用 了片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-Asn(T;rt)-OH 或Fmoc-Pro-Gly-OH、Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH,能有效解決比伐盧定合成中的雜質(zhì) 度ivalirudin+IGly和Bivali;rudin±2Gly)問題,產(chǎn)品純度可達(dá)99. 5% [^上,具有產(chǎn)業(yè)化 前景。
[0008] 本發(fā)明所述的樹脂,可選CTC-樹脂、Wang-樹脂,優(yōu)選為Wang-樹脂。
[0009] 進(jìn)一步地,所選樹脂取代值為0. 5~1. 5mmol/g樹脂,優(yōu)選為0. 6~1. Ommol/g樹 脂。
[0010] 本發(fā)明所述的保護(hù)氨基酸為Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Tyr(tBu)-0H、 化〇。-6111 (OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、化〇。-116-〇山F'moc-Phe-OHFmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Arg(Pbf) -OH、Ri-D-Phe。其中Ri為Boc或Fmoc。
[0011]本發(fā)明所述的片段為Fmoc-X-OH、Fmoc-Y-OH,其中X為Pro-Gly-Gly,Y為 Gly-Gly-Asnad);或X為Pro-Gly,Y為Gly-Gly-Gly+Asnad);具體片段分別為 Fmoc-Pr〇-Gly-Gly-〇H、Fmoc-Gly-Gly-Asn(Trt) -0H,或Fmoc-Pr〇-Gly-〇H、Fmoc-Gly-Gly-G 1廠OH+Fmoc-Asn燈的)-OH(片段加保護(hù)氨基酸)。
[0012]其中,片段Fmoc-Pro-Gly-Gly-OH結(jié)構(gòu):
其中,片段Fmoc-Pro-Gly-OH結(jié)構(gòu):
其中,片段Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH結(jié)構(gòu):
其中,片段Fmoc-Gly-Gly-Asn燈的)-OH結(jié)構(gòu):
本發(fā)明第一個保護(hù)氨基酸Fmoc-Leu-OH與樹脂的偶聯(lián)方式為:當(dāng)載體樹脂為CTC-樹脂 時,F(xiàn)moc-Leu-OH的簇基與樹脂中的氯在堿作用下發(fā)生醋化反應(yīng)而接入保護(hù)氨基酸;當(dāng)載 體樹脂為Wang-樹脂時,F(xiàn)moc-Leu-OH的簇基與Wang-樹脂中的徑基在活化劑和堿催化劑 的作用下發(fā)生醋化反應(yīng)而接入保護(hù)氨基酸。
[0013] 作為本發(fā)明優(yōu)選的方案,當(dāng)載體樹脂為Wang樹脂時,F(xiàn)moc-Leu-OH與其的偶聯(lián)方 法為:Fmoc-Leu-OH的簇基與Wang樹脂中的徑基在活化劑和堿催化劑的作用下發(fā)生醋化反 應(yīng)而接入保護(hù)氨基酸。醋化反應(yīng)時間為10~20小時,優(yōu)選為15小時。堿催化劑為4-N,N-二 甲基化晚(DMP),用量為所投料樹脂總摩爾數(shù)的10%。
[0014] 本發(fā)明接入片段X和片段Y方式為: (1)、分2次偶聯(lián)方式依次接入,第一次為Fmoc-Gly-Gly-Asn燈的)-OH,第二次為Fmoc-Pro- Gly-Gly-OH;或 似、分3次偶聯(lián)方式依次接入,第一次為Fmoc-Asn府t)-〇H,第二次為Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH,第S次為Fmoc-Pro-Gly -OH。
[0015] 本發(fā)明所述的偶聯(lián)合成法具體包含=步反應(yīng):(I)、保護(hù)氨基酸、片段的活化反應(yīng): 將保護(hù)氨基酸、片段,加溶劑攬拌溶解,在攬拌冰水冷卻下加入偶聯(lián)劑,反應(yīng)0. 25~2小時, 得保護(hù)氨基酸、片段的活化醋溶液。(2)、保護(hù)氨基酸、片段與樹脂的偶聯(lián)反應(yīng):將保護(hù)氨基 酸、片段的活化醋溶液加入氨基樹脂或前一步反應(yīng)得到的去Fmoc保護(hù)的膚樹脂中,室溫攬 拌偶聯(lián)反應(yīng),用巧=酬檢測反應(yīng)情況,每隔1小時監(jiān)測1次,直至完全(巧=酬檢測樹脂呈 無色),反應(yīng)完全后,用溶劑洗涂6次,抽干。(3)、Fmoc基團(tuán)的脫除反應(yīng):加入脫除保護(hù)基團(tuán) Fmoc的試劑的溶液,攬拌反應(yīng)0. 25~1小時,抽干;用溶劑洗涂6次,抽干,得膚樹脂。
[0016] 本發(fā)明所述偶聯(lián)所用的偶聯(lián)劑為DCC/H0Bt、DCC/H0At、DIC/H0Bt、DIC/H0At、皿TU/ DIPEA、皿TU/NMM、皿TU/TEA、TBTU/DIPEA、TBTU/NMM、TBTU/TEA、HATU/DIPEA、HATU/ NMM、HATU/TEA中的一種。優(yōu)選為DIC/冊Bt。
[0017] 本發(fā)明所述的偶聯(lián)反應(yīng),其反應(yīng)物的摩爾比為樹脂:Fmoc-氨基酸或片段=1: 1. 5-5,優(yōu)選為 1 :3。
[0018] 本發(fā)明所述的保護(hù)氨基酸、片段的活化反應(yīng),其反應(yīng)物的摩爾比為Fmoc-氨基酸 或片段:DIC:H0Bt=l:1. 05-1. 3 :1. 1 ~1. 5,優(yōu)選為 1 :1. 05 :1. 2。反應(yīng)時間為 0. 25-2 小時, 優(yōu)選為0. 5小時。反應(yīng)溶劑為DMF、DCM、NMP、THF,優(yōu)選為DMF。
[0019] 本發(fā)明所述的偶聯(lián)反應(yīng),其偶聯(lián)反應(yīng)時間為1~8小時,優(yōu)選為2~3小時。
[0020] 本發(fā)明所述的偶聯(lián)反應(yīng),脫除保護(hù)基團(tuán)Fmoc的試劑為10~30%PIP/DMF(體積百 分?jǐn)?shù))溶液,優(yōu)選的為20%。用量為每克料樹脂5~15ml,優(yōu)選為每克投料樹脂8~12ml。 去保護(hù)反應(yīng)時間為10~60分鐘,優(yōu)選為20~35分鐘。
[0021] 本發(fā)明所述的偶聯(lián)