專利名稱:一種比伐盧定的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域,特別涉及一種比伐盧定的制備方法。
背景技術(shù):
比伐盧定(Bivalirudin),氨基酸序列如SEQ ID No. 3 所不,即 D-Phe-Pro-Arg-Prο-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-I Ie-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH,是一種應(yīng)用于臨床的凝血酶抑制劑,早期的臨床研究表明比伐盧定抗凝治療效果確切,且出血事件的發(fā)生率較低,和傳統(tǒng)的肝素抗凝治療相比使用更為安全。比伐盧定可通過結(jié)合于催化劑位點(diǎn)和循環(huán)及凝血酶血塊的陰離子輸出位點(diǎn)而直接抑制凝血酶的作用。關(guān)于比伐盧定的制備方法,國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道。中國(guó)專利CN101475631B報(bào)道了采用全液相方法合成比伐盧定。首先合成三條分別含有6,6,8個(gè)氨基酸全保護(hù)片段,然后在液相中將三個(gè)片段依次偶聯(lián)。同時(shí),專利CN102164609A和專利CN102264757A中亦報(bào)道了類似的全液相合成方法,只是將片段分別分為了 4條和5條。US20070093423報(bào)道了一種比伐盧定的制備方法,其采用的是片段縮合方法得到粗品,經(jīng)HPLC純化得到比伐盧定精肽的純度大于98. 5%,總雜小于I. 5%,單雜小于I. 0%,[Asp9-比伐盧定]小于O. 5%。中國(guó)專利200910051311公開了一種比伐盧定的Fmoc固相順序合成方法,采用王樹脂為起始樹脂,依次接入保護(hù)氨基酸,所得肽樹脂采用三氟乙酸酸解得到比伐盧定粗品。W091/02750報(bào)道了一種采用Boc方法制備比伐盧定的方法,采用Merrifiled樹脂為固相載體進(jìn)行合成,最終采用HF酸解。目前的合成方法有的采用液相合成,但由于比伐盧定的結(jié)構(gòu)屬于多肽類似物,肽序長(zhǎng),液相反應(yīng)較為繁瑣,不易純化,合成起來(lái)花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),收率低;此外,所述部分專利雖采用固相合成比伐盧定,但比伐盧定結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)-Gly-Gly-Gly-Gly片段,在依次偶聯(lián)-Gly過程中,由于Gly自身特性,極易在主峰前后產(chǎn)生BivalirudinilGly和Bivalirudin±2Gly的雜質(zhì),這些雜質(zhì)在后續(xù)分離時(shí)很難去除,且部分專利固相合成時(shí),裂解用到HF,設(shè)備性能要求高,條件較為苛刻,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。此外,比伐盧定肽序中含D-Phe,合成過程會(huì)產(chǎn)生其異構(gòu)體L-Phe。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明提供了一種比伐盧定的制備方法。該方法采用固相合成的多肽片段 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 為原料,避免了 Bivalirudin土 IGly和Bivalirudin±2Gly的問題;此外,本發(fā)明采用特定偶聯(lián)試劑使該異構(gòu)體L-Phe的量大大降低;同時(shí)提高了產(chǎn)品的收率和純度,操作簡(jiǎn)便,條件溫和,有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的制備。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種比伐盧定的制備方法,包括如下步驟步驟I :取甘氨酸與氯樹脂經(jīng)第一偶聯(lián)獲得甘氨酸-氯樹脂,取氨基酸依次經(jīng)第二偶聯(lián)獲得第一肽樹脂,經(jīng)第一裂解獲得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段;步驟2 :取亮氨酸與固相載體經(jīng)第三偶聯(lián)獲得亮氨酸-樹脂,取氨基酸依次經(jīng)第四偶聯(lián)獲得序列如SEQ ID No. 2所不的第_■妝樹脂; 步驟3 :取第一片段與序列如SEQ ID No. 2所示的第二肽樹脂固相偶聯(lián)獲得比伐盧定肽樹脂,經(jīng)第二裂解、純化,即得;第二偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HOBt與DIC的混合物,HOBt、PyBOP與DIPEA的混合物,HOAt、PyAOP與DIPEA的混合物,HBTU, HOBt與DIPEA的混合物,HATU, HOAt與DIPEA的混合物。比伐盧定結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)-Gly-Gly-Gly-Gly片段,在依次偶聯(lián)-Gly過程中,由于Gly自身特性,極易在主峰前后產(chǎn)生Bivalirudin± IGly和Bivalirudin±2Gly的雜質(zhì),這些雜質(zhì)在后續(xù)分離時(shí)很難去除。本發(fā)明采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 為原料,避免了 Bivalirudin+ IGly 和 Bivalirudin±2Gly 的問題。比伐盧定肽序中含D-Phe,合成過程會(huì)產(chǎn)生其異構(gòu)體L-Phe,采用特定偶聯(lián)試劑能夠使該異構(gòu)體L-Phe的量大大降低。在本發(fā)明提供的比伐盧定的制備方法中,步驟I中第二偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HOBt、PyBOP與DIPEA的混合物。作為優(yōu)選,氯樹脂為2-CTC-樹脂。作為優(yōu)選,步驟I中第一裂解所用裂解劑為三氟乙醇和二氯甲烷的混合試劑,混合試劑中三氟乙醇與二氯甲烷的體積比為1:4。作為優(yōu)選,步驟3中固相偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為DIC與HOBt的混合物,HBTU, HOBt與DIPEA的混合物或HATU、HOAt與DIPEA的混合物。作為優(yōu)選,步驟3中固相偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HATU、HOAt與DIPEA的混合物。作為優(yōu)選,步驟3中第二裂解的裂解劑為三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1,2_乙二硫醇、水和二異丙基娃燒的混合試劑。作為優(yōu)選,裂解劑中三氟乙酸占裂解劑的體積百分?jǐn)?shù)為81-89%,苯甲硫醚占裂解劑的體積百分?jǐn)?shù)為2-6%,苯酚占裂解劑的體積百分?jǐn)?shù)為2-6%,三異丙基硅烷占裂解劑的體積百分?jǐn)?shù)為1_3%,1,2_乙二硫醇占裂解劑的體積百分?jǐn)?shù)為2-6%,余量為水。作為優(yōu)選,步驟I中第一肽樹脂替代度為O. 5^1. Ommol/g,優(yōu)選的步驟I中第一肽樹脂替代度為O. 7mmol/go作為優(yōu)選,步驟2 中固相載體選自 PAM Resin、HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin或者 Wang Resin,優(yōu)選 Wang Resin。作為優(yōu)選,步驟2中亮氨酸-樹脂的替代度為O. 4"O. 8mmol/g,優(yōu)選O. 5mmol/g。作為優(yōu)選,步驟I具體為取甘氨酸與氯樹脂經(jīng)第一偶聯(lián)獲得甘氨酸-氯樹月旨,去保護(hù)后,依次偶聯(lián) Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-0H>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,得到 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC 妝樹脂,即第一肽樹脂,再經(jīng)第一裂解獲得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段。作為優(yōu)選,步驟2具體為取亮氨酸與固相載體經(jīng)第三偶聯(lián)獲得亮氨酸-樹月旨,去保護(hù)后,依次偶聯(lián) Fmoc-Tyr (tBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) _0H、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-OH 獲得序列如 SEQ ID
4No. 2所示的第二肽樹脂。本發(fā)明提供了一種比伐盧定的制備方法。該方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH為原料,在片段合成初始段就開始偶聯(lián)-G-G-G-,區(qū)別于合成比伐盧定時(shí)中間順次偶聯(lián)-G-G-G-G-,能避免片段加減甘氨酸,解決了 Bivalirudin± IGly和Bivalirudin±2Gly的問題;此外,本發(fā)明采用特定偶聯(lián)試劑使該異構(gòu)體L-Phe的量大大降低;同時(shí)提高了產(chǎn)品的收率和純度,操作簡(jiǎn)便,條件溫和,有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?;闹苽?。且提高了產(chǎn)品的收率和純度,操作簡(jiǎn)便,條件溫和,有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?;闹苽洹?br>
圖I示對(duì)比例制得的比伐盧定的HPLC譜圖;圖2示實(shí)施例43制得的比伐盧定精肽的HPLC譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種比伐盧定的制備方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合,來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。PAM Resin、HMPA-AM Resin, HMPA-MBHA Resin、Wang Resin 和 2-CTC 樹脂購(gòu)自天津南開和成有限公司,各種保護(hù)氨基酸購(gòu)自蘇州天馬有限公司,其它溶劑和試劑為普通市售品。說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中
說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義如下
Fmoc9-芴甲氧羰基
2-CTC樹脂 2-三苯甲基氯樹脂
tBu叔丁基
OtBu叔丁氧基
Pbf2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺?;?br>
Trt三苯甲基
DCM二氯甲烷
DBLK20%六氫吡啶/DMF溶液
DIPEAN, N-二異丙基乙胺
TFE三氟乙醇
TIS二異丙基娃燒
DMFN, N-二甲基甲酰胺
DMAP4-二甲氨基吡啶
HPLC高效液相色譜法
EDTI,2-乙_■硫醇
TFA三氟乙酸
下面以具體的實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的技術(shù)說(shuō)明;但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I :替代度為 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的2-CTC樹脂150g (O. 15mmol),加入到固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取66. 9g (O. 225mmol )Fmoc-Gly-0H用DMF溶解,冰水浴下加入58. 2g (O. 45mmol) DIPEA活化后,加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中,反應(yīng)2小時(shí)后,加入182mL無(wú)水甲醇封閉30min。用DMF洗漆3次,DCM洗3次,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Gly-CTC樹脂,檢測(cè)替代度為O. 511mmol/g。實(shí)施例2 :替代度為 I. Ommol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制備稱取替代度為I. 2mmol/g的2-CTC樹脂150g (180mmol ),加入到固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取107. Ig (360mmol) Fmoc-Gly-OH用DMF溶解,冰水浴下加入69. 8g (540mmol)DIPEA活化后,加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中,反應(yīng)2小時(shí)后,加入182mL無(wú)水甲醇封閉30min。用DMF洗滌3次,DCM洗3次,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Gly-CTC 樹脂,檢測(cè)替代度為 0. 986mmol/g。實(shí)施例3 :替代度為 0. 7mmol/g 的 Fmoc-Gly-CTC Resin 的制備稱取替代度為I. 0mmol/g的2-CTC樹脂150g (150mmol ),加入到固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取80. 3g (270mmol) Fmoc-Gly-OH用DMF溶解,冰水浴下加入58. 2g (450mmol)DIPEA活化后,加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中,反應(yīng)2小時(shí)后,加入182mL無(wú)水甲醇封閉30min。用DMF洗滌3次,DCM洗3次,甲醇收縮抽干,得到Fmo-Gly-CTC樹脂,檢測(cè)替代度為O. 711mmol/g。實(shí)施例4 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制備稱取實(shí)施例3制備的替代度為O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC樹脂155g(I IOmmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹Fmoc-Gly-CTC樹脂30分鐘后,用 DBLK 脫除 Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gH0Bt(396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,順次完成Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶聯(lián),得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 264. 25g。用DBLK脫除上述得到的肽樹脂的Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol),61. 7mL DIC (396mmol)溶于 DMF 溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 280. 25g。實(shí)施例5 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制備稱取實(shí)施例3制備的替代度為O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC樹脂155g(I IOmmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹Fmoc-Gly-CTC樹脂30分鐘后,用 DBLK 脫除 Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gH0Bt(396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,順次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶聯(lián),得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 263. 75g。 用DBLK脫除上述得到的肽樹脂的Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將127. 8gFmoc-D-Phe-0H(330mmol),53.5g H0Bt(396mmol),171.6g PyBOP(396mmol),115.2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 282. 21g。實(shí)施例6 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制備稱取實(shí)施例3制備的替代度為O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC樹脂155g(I IOmmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹Fmoc-Gly-CTC樹脂30分鐘后,用 DBLK 脫除 Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5gHOBtC396mmol ),50. Og DIC(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,順次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf) -OH和 Fmoc-Pro-OH 的偶聯(lián),得到 Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 265. 05g。用DBLK脫除上述得到的肽樹脂的Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將127. 8gFmoc-D-Phe-0H(330mmol),53. 5g H0At(396mmol), 171. 6g PyAOP(396mmol), 115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 279. 27g。實(shí)施例7 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制備稱取替代度為O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC樹脂155g( IlOmmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹Fmoc-Gly-CTC樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol), 50. OgDIC (396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,順次完成 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH 和 Fmoc-Pro-OH 的偶聯(lián),得至IJFmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 263. 85g。用DBLK脫除上述得到的肽樹脂的Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol),53. 5g HOBt (396mmol), 125. Ig HBTU (396mmol),115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 278. 36g。實(shí)施例8 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 的制備
稱取替代度為O. 711mmol/g的Fmoc-Gly-CTC樹脂155g( IlOmmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹Fmoc-Gly-CTC樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 98. Ilg Fmoc-Gly-OH (330mmol), 53. 5g HOBt (396mmol), 50. OgDIC (396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-Gly-Gly-CTC Resin。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,順次完成 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH 和 Fmoc-Pro-OH 的偶聯(lián),得至IJFmoc-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 265. 15g。用DBLK脫除上述得到的肽樹脂的Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將127. 8gFmoc-D-Phe-OH (330mmol),53. 5g HOAt (396mmol), 125. Ig HATU (396mmol), 115. 2mLDIPEA(396mmol)溶于DMF溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。得到Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTC Resin 278. 54g。實(shí)施例9 :替代度為 O. 4mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的Wang樹脂120g( 120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取84. 8g Fmoc-Leu-OH,38. 9g HOBt,36. 3g DIC、2. 93gDMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-Wang樹脂,檢測(cè)替代度為 O. 408mmol/go實(shí)施例10 :替代度為 O. 8mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的Wang樹脂120g( 120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取 127. 2g Fmoc-Leu-OH,58. 4g HOBt,54. 5g DIC、4. 4gDMAP溶于體積比為I: I的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-Wang樹脂,檢測(cè)替代度為 O. 807mmol/go實(shí)施例11 :替代度為 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的Wang樹脂120g(120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取 101. 7g Fmoc-Leu-OH,46. 7g HOBt,43. 6g DIC、3. 5gDMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-Wang樹脂,檢測(cè)替代度為 O. 498mmol/g0實(shí)施例12 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 肽樹脂的制備稱取實(shí)施例11制備的替代度為O. 498mmol/g的Fmoc-Leu-wang樹脂120. 5g(60mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 4 次,DCM 洗 2 次。將 82. 7gFmoc-Tyr (tBu)-OH (180mmol),29. IgHOBt (216mmol),27. 3g DIC (216mmol)溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,樹脂真空干燥過夜,稱重NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-Wang 樹脂 248. 7g。實(shí)施例13 :替代度為 O. 4mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的PAM Resin 120g (120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF 洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 84. 8g Fmoc-Leu-OH,38. 9g HOBt,36. 3g DIC、2. 93g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-PAMResin,檢測(cè)替代度為O. 409mmol/go實(shí)施例14 :替代度為 O. 8mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的PAM樹脂120g (120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取 127. 2g Fmoc-Leu-OH,58. 4g HOBt,54. 5g DIC,4. 4gDMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-PAM Resin,檢測(cè)替代度為O. 809mmol/g。實(shí)施例15 :替代度為 O. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-PAM Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的PAM樹脂120g (120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,取 101. 7g Fmoc-Leu-OH,46. 7g HOBt,43. 6g DIC,3. 5gDMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-PAM Resin,檢測(cè)替代度為O. 495mmol/g。實(shí)施例16 :替代度為 O. 4mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的HMPA-AM Resin 120g (120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用 DMF 洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 84. 8gFmoc-Leu_0H、38. 9g HOBt、36. 3gDIC、2.93g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗漆4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-AMResin,檢測(cè)替代度為O. 398mmol/g。
實(shí)施例17 :替代度為 O. 8mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制備稱取替代度為I. Ommol/g的HMPA-AM樹脂120g( 120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF 洗漆 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 127. 2gFmoc-Leu-0H,58. 4g HOBt,54. 5g DIC、4. 4g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗漆4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin,檢測(cè)替代度為0. 802mmol/go實(shí)施例18 :替代度為 0. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin 的制備稱取替代度為I. 0mmol/g的HMPA-AM樹脂120g( 120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF 洗漆 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 101. 7gFmoc-Leu_0H、46. 7g HOBt,43. 6g DIC、3. 5g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗漆4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-AM Resin,檢測(cè)替代度為0. 502mmol/go實(shí)施例19 :替代度為 0. 4mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制備稱取替代度為I. 0mmol/g 的 HMPA-MBHA Resin 120g (120mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用 DMF 洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 84. 8gFmoc-Leu_0H、38. 9g HOBt、36. 3gDIC、2.93g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗漆4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin,檢測(cè)替代度為0. 403mmol/g。實(shí)施例20 :替代度為 0. 8mmoI /g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制備稱取替代度為I. 0mmol/g的HMPA-MBHA樹脂120g( 120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用 DMF 洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 127. 2gFmoc-Leu_0H、58. 4g HOBt、54. 5gDIC、4. 4g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin,檢測(cè)替代度為0. 806mmol/g。實(shí)施例21 :替代度為 0. 5mmol/g 的 Fmoc-Leu-HMPA-MBHA Resin 的制備稱取替代度為I. 0mmol/g的HMPA-MBHA樹脂120g( 120mmol ),加入固相反應(yīng)柱中,用 DMF 洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 101. 7gFmoc-Leu_0H、46. 7g HOBt,43. 6gDIC、3. 5g DMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入189. 8g吡啶和245. 04g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin,檢測(cè)替代度為0. 498mmol/g。實(shí)施例22 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 月太樹脂的制備稱取實(shí)施例15制備的替代度為0. 495mmol/g的Fmoc-Leu-PAM Resin樹脂120. 5g(60mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 4 次,DCM 洗 2 次。將 82. 7gFmoc-Tyr (tBu)-OH (180mmol),29. Ig HOBt (216mmol ),27. 3g DIC(216mmol)溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,樹脂真空干燥過夜,稱重NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 樹脂 244. 2g。實(shí)施例23 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 妝樹脂的制備稱取實(shí)施例18制備的替代度為O. 502mmol/g的Fmoc-Leu-HMPA-AMResin樹脂120. 6g(60mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除 Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 4 次,DCM 洗 2 次。將 82. 7g Fmoc-Tyr (tBu) -0H( 180mmol),29. Ig HOBt (216mmol ),27. 3g DIC(216mmol)溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH>Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Glu (OtBu) -0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,樹脂真空干燥過夜,稱重 NH2_Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 樹脂 241. 7g。實(shí)施例24:NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-MBHA Resin 肽樹脂的制備稱取實(shí)施例21制備的替代度為O. 498mmol/g的Fmoc-Leu-HMPA-MBHAResin樹脂120. 6g(60mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除 Fmoc 保護(hù),然后用 DMF 洗滌 4 次,DCM 洗 2 次。將 82. 7g Fmoc-Tyr (tBu) -0H( 180mmol),29. IgHOBt (216mmol),27. 3gDIC (216mmol)溶于體積比為 1:1 的 DCM 和 DMF 混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)步驟,按照片段順序,依次完成Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Glu (OtBu) -OH> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Gly-OH。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,樹脂真空干燥過夜,稱重
NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin 樹脂 243. 3g。實(shí)施例25 :由以HOBt/DIC為偶聯(lián)劑合成得到的多肽片段A :Fm0C-D-Phe-Pr0-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 的制備將實(shí)施例4 制備的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽樹脂置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFE DCM=20 :80(V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量DCM洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即多肽片段A粗肽124. 21g。重量收率為101. 7%, HPLC純度為96. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 純度為 O. 03%。實(shí)施例26 :由以HOBt/PyBOP/DIPEA為偶聯(lián)劑合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制備將實(shí)施例5 制備的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽樹脂置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFE DCM=20 :80(V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量DCM洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即多肽片段A粗肽127. 27g。重量收率為106. 5%, HPLC純度為98. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 純度為 0.05%,本法使得 L-Phe 含量最低。實(shí)施例27 :由以HOAt/PyAOP/DIPEA為偶聯(lián)劑合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制備將實(shí)施例6 制備的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽樹脂置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFE DCM=20 :80(V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量DCM洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即多肽片段A粗肽125. 13g。重量收率為104. 3%, HPLC純度為96. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 純度為 O. 06%。實(shí)施例28 :由以HBTU/HOBt/DIPEA為偶聯(lián)劑合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制備將實(shí)施例7 制備的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽樹脂置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFE DCM=20 :80(V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量DCM洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即多肽片段A粗肽126. 21g。重量收率為105. 2%, HPLC純度為96. 2%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 純度為 O. 07%。實(shí)施例29 :由以HATU/HOAt/DIPEA為偶聯(lián)劑合成得到的多肽片段A =Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-GIy-Gly-Gly-OH 的制備將實(shí)施例8 制備的 270g Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-CTCResin肽樹脂置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFE DCM=20 :80(V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量DCM洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即多肽片段A粗肽123. 23g。重量收率為102. 7%, HPLC純度為97. 4%。其中Fmoc-L-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 純度為 O. 09%。實(shí)施例30 :以 DIC/HOBt 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 肽樹脂的制備稱取由實(shí)施例12 的方法制備的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將194. 2g實(shí)施例25制備的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol),76. 5g HOBt (566. 6mmol),71. 5gDIC (566. 6mmol)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝樹脂為 498. 2g。實(shí)施例31 :以 HBTU/HOBt/DIPEA 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-GIu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝樹脂的制備稱取由實(shí)施例12 的方法制備的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將194. 2g實(shí)施例26制備的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol),76. 5gH0Bt (566. 6mmol), 179. Ig HBTU (566. 6mmol),73. 2gDIPEA (566. 6mmol)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝樹脂為 497. 3g。實(shí)施例32 :以 HATU/HOAt/DIPEA 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝樹脂的制備稱取由實(shí)施例12 的方法制備的 316g (157. 4mmol)的 NH2-Gly-Asn(Trt)-Gly-AsP (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-ffang肽樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將194. 2g實(shí)施例27制備的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(472. 2mmol),76. 5gH0At (566. 6mmol), 179. Ig HATU (566. 6mmol),73. 2g DIPEA (566. 6mmol)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu(OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-ffang Resin 妝樹脂為 498. 7g。實(shí)施例33 :以 HATU/HOAt/DIPEA 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAMResin 妝樹脂的制備稱取實(shí)施例22 制備的 244. 2g (BOmmoI )的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 妝樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用 DMF 洗滌 6 次。將 209. 34g 實(shí)施例 28 制備的 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol),29. 18gH0At (180mmol),68. 2g HATU (180mmol),62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-PAM Resin 妝樹脂為 313. 8g。實(shí)施例34 :以 HATU/HOAt/DIPEA 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-AM Resin 妝樹脂的制備稱取實(shí)施例23 制備的 241. 7g (60mmol)的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin肽樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將209. 34g實(shí)施例29制備的Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol),g29. 18gH0At (180mmol), 68. 2g HATU (180mmol), 62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin 肽樹脂為 311. 8g。實(shí)施例35 :以 HATU/HOAt/DIPEA 為偶聯(lián)的試劑,進(jìn)行 Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin 妝樹脂的制備稱取實(shí)施例24 制備的 243. 3g(60mmol)的 NH2-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHA Resin肽樹脂,加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用DBLK脫除Fmoc保護(hù),然后用DMF洗滌6次。將實(shí)施例25制備的209. 34gFmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-OH 粗品(180mmol),g29. 18gH0At (180mmol), 68. 2g HATU (180mmol), 62. 8mlDIPEA(180mmoI)溶于DMF中,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h (反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh,用DBLK脫除Fmoc保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,肽樹脂真空干燥過夜,稱重H-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-HMPA-MBHAResin 肽樹脂為 308. 9g。實(shí)施例36 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例30 制備的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=80 :6 :5 :5 :3 :1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,S卩比伐盧定粗肽314. 3g。重量收率為101.9%,HPLC 純度為 85. 9%。實(shí)施例37 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例31 制備的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=89 3 3 2 2 1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽315. 2g。重量收率為102. I %,HPLC 純度為 84. 9%。實(shí)施例38 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例32 制備的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=85 :5 :4 :3 :2 :1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽316. 5g。重量收率為102. 6%,HPLC 純度為 85. 9%。實(shí)施例39 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例30 制備的 450gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-Wang肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽319. 3g。重量收率為103. 5%,HPLC 純度為 88. 9%。實(shí)施例40 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例33 制備的 245gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-PAM Resin肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚:苯甲硫醚EDT 7jC TIS=82 :5 :5 :4 :3 :1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽129. Sg。重量收率為99. 2%, HPLC 純度為 76. 2%。實(shí)施例41 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例34 制備的 245gH-D-Phe-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-AM Resin肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA 苯酚苯甲硫醚EDT 7jC TIS=82 :5 :5 :4 :3 :1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽131. 5g。重量收率為 100. 6%, HPLC 純度為 77. 9%。實(shí)施例42 比伐盧定粗肽的制備將實(shí)施例35 制備的 245gH-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu-HMPA-MBHA Resin肽樹脂置于裂解反應(yīng)其中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽129. 6g。重量收率為99. 0%, HPLC純度為79. 2%。實(shí)施例43 比伐盧定粗肽純化稱取實(shí)施例36制備得到的12. 75g比伐盧定粗肽用400ml水溶解后,采用NOVASEPRP-HPLC系統(tǒng),波長(zhǎng)230nm,色譜柱為50 X 250mm反相C18柱,常規(guī)O. 2%TFA/乙腈流動(dòng)相純化,收集目的峰餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干得到比伐盧定精肽4. 45g,HPLC純度99. 63 %,其中,bivalirudin-Gly 為 O. Ol %, bivalirudin+Gly 為 O. 05%, bivalirudin(L-Phe)為 O. 03%。精肽譜圖見圖2。實(shí)施例44 比伐盧定粗肽純化稱取由實(shí)施例40肽樹脂為載體制備得到的14. 75g比伐盧定粗肽用400ml水溶解后,采用NOVASEP RP-HPLC系統(tǒng),波長(zhǎng)230nm,色譜柱為50X250mm反相C18柱,常規(guī)O. 2%TFA/乙腈流動(dòng)相純化,收集目的峰餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干得到比伐盧定精肽4. 85g, HPLC 純度 99. 1%。實(shí)施例45 比伐盧定粗肽純化稱取由實(shí)施例41肽樹脂為載體制備得到的13. 45g比伐盧定粗肽用400ml水溶解后,采用NOVASEP RP-HPLC系統(tǒng),波長(zhǎng)230nm,色譜柱為50X250mm反相C18柱,常規(guī)O. 2%TFA/乙腈流動(dòng)相純化,收集目的峰餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干得到比伐盧定精肽4. 55g, HPLC 純度 99. 3%。實(shí)施例46 比伐盧定粗肽純化稱取由實(shí)施例42肽樹脂為載體制備得到的13. 35g比伐盧定粗肽用400ml水溶解后,采用NOVASEP RP-HPLC系統(tǒng),波長(zhǎng)230nm,色譜柱為50X250mm反相C18柱,常規(guī)O. 2%TFA/乙腈流動(dòng)相純化,收集目的峰餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干得到比伐盧定精肽4. 37g, HPLC 純度 99. 2%。
對(duì)比例稱取替代度為I. Ommol/g的Wang樹脂12g (12mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌 2 次,用 DMF 溶脹樹脂 30 分鐘后,取 8. 5g Fmoc-Leu-OH,3. 9g HOBt,3. 6g DIC,O. 30gDMAP溶于體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌4次,DCM洗2次。然后加入18. 9g吡啶和24. 5g乙酸酐混合液封閉樹脂6h。用DMF洗滌4次,DCM洗滌2次后,甲醇收縮抽干,得到Fmoc-Leu-Wang樹脂15. Og,檢測(cè)替代度為O. 502mmol/go稱取替代度為O. 502mmol/g 的 Fmoc-Leu-Wang 樹脂 3. 98g (2mmol),加入固相反應(yīng)柱中,用DMF洗滌2次,用DMF溶脹樹脂30分鐘后,用20%DBLK溶液脫保護(hù)5+7分鐘,用 DMF 洗滌 6 次。將 2. 76gFmoc-Tyr (tBu)-OH (3. Ommol),O. 97g HOBt (3. 6mmol),0. 99gDIC (3. 9mmol)溶于體積比為I: I的DCM和DMF混合溶液,加入固相反應(yīng)柱中,室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn),如果樹脂無(wú)色透明,則反應(yīng)完全,樹脂顯色,表示反應(yīng)不完全,需再偶聯(lián)反應(yīng)lh)。重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟,按照片段的順序,依次完成 Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH> Fmoc-Asp(OtBu)-0H>Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH 和 Fmoc-D-Phe-OH 的偶聯(lián),并脫除最后的Fmoc保護(hù)基團(tuán),用DMF洗6次,反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮,樹脂真空干燥過夜,稱重得比伐盧定肽樹脂8. 58g。將上述得到的比伐盧定肽樹脂8. 58g置于裂解反應(yīng)瓶中,以10ml/g樹脂的比例加入裂解試劑(TFA :苯酚苯甲硫醚=EDT :水TIS=82 5 5 4 3 1 (V/V)),室溫?cái)嚢?. 5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾,收集濾液,樹脂再用少量TFA洗滌3次,合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無(wú)水乙醚沉淀,用無(wú)水乙醚洗滌3次,真空干燥得到白色粉末固體,即比伐盧定粗肽4. 24g。重量收率為97. 2%,HPLC純度為76. 5%。稱取制備得到的比伐盧定粗肽4. 24g比伐盧定粗肽用120ml水溶解后,采用NOVASEP RP-HPLC系統(tǒng),波長(zhǎng)230nm,色譜柱為50X250_反相C18柱,常規(guī)O. 2%TFA/乙腈流動(dòng)相純化,收集目的峰餾分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凍干得到比伐盧定精肽I. 48g,HPLC純度 96. 54%,其中,bivalirudin-Gly 為 O. 62%, bivalirudin+Gly 為 O. 93%, bivalirudin(L-Phe)為I. 61%。譜圖見圖I。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種比伐盧定的制備方法,其特征在于,包括如下步驟 步驟I :取甘氨酸與氯樹脂經(jīng)第一偶聯(lián)獲得甘氨酸-氯樹脂,取氨基酸依次經(jīng)第二偶聯(lián)獲得第一肽樹脂,經(jīng)第一裂解獲得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段; 步驟2 :取亮氨酸與固相載體經(jīng)第三偶聯(lián)獲得亮氨酸-樹脂,取氨基酸依次經(jīng)第四偶聯(lián)獲得序列如SEQ ID No. 2所不的第_■妝樹脂; 步驟3 :取所述第一片段與所述序列如SEQ ID No. 2所示的第二肽樹脂固相偶聯(lián)獲得比伐盧定肽樹脂,經(jīng)第二裂解、純化,即得; 所述第二偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HOBt與DIC的混合物,HOBt、PyBOP與DIPEA的混合物,HOAt、PyAOP與DIPEA的混合物,HBTU, HOBt與DIPEA的混合物,HATU, HOAt與DIPEA的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟I中所述第二偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HOBt、PyBOP 與 DIPEA 的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,所述氯樹脂為2-CTC-樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟I中所述第一裂解所用裂解劑為三氟乙醇和二氯甲烷的混合試劑,所述混合試劑中三氟乙醇與二氯甲烷的體積比為1:4。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟3中所述固相偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為DIC與HOBt的混合物,HBTU, HOBt與DIPEA的混合物或HATU、HOAt與DIPEA的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟3中所述固相偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為HATU, HOAt與DIPEA的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟3中所述第二裂解的裂解劑為三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、I,2-乙二硫醇、水和三異丙基硅烷的混合試劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于,以體積百分?jǐn)?shù)計(jì),所述裂解劑中包括三氟乙酸81-89%,苯甲硫醚2-6%,苯酚2-6%,三異丙基硅烷1_3%,1,2-乙二硫醇2_6%,余量為水。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟I中所述第一肽樹脂替代度為O.5 L 0mmol/go
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟2中所述固相載體選自PAMResin> HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin 或者 Wang Resin。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟2中所述亮氨酸-樹脂的替代度為 O. 4 O. 8mmol/g0
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟I具體為取甘氨酸與氯樹脂經(jīng)第一偶聯(lián)獲得甘氨酸_氯樹脂,去保護(hù)后,依次偶聯(lián)Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (Pbf) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH,獲得第一妝樹脂,再經(jīng)第一裂解獲得序列如SEQ ID No. I所示的第一片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法,其特征在于,步驟2具體為取亮氨酸與固相載體經(jīng)第三偶聯(lián)獲得亮氨酸-樹脂,去保護(hù)后,依次偶聯(lián)Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-0H>Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-OH 獲得序列如 SEQ ID No. 2 所不的第二妝樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域,特別涉及一種比伐盧定的制備方法。該方法采用固相合成的多肽片段Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-OH為原料,避免了Bivalirudin±1Gly和Bivalirudin±2Gly的問題;此外,本發(fā)明采用特定偶聯(lián)試劑使該異構(gòu)體L-Phe的量大大降低;同時(shí)提高了產(chǎn)品的收率和純度,操作簡(jiǎn)便,條件溫和,有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化的制備。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102924575SQ20121042801
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者朱日成, 宓鵬程, 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司