專利名稱：比伐盧定的液相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種20肽，具體說(shuō)涉及比伐盧定的合成，尤其是比 伐盧定的液相合成方法，屬于多肽合成技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
比伐盧定(bivalirudin)是2000年12月美國(guó)食品藥物管理局FDA 批準(zhǔn)上市的直接凝血酶抑制劑之一 (商品名Angiomax，由Medicines 制藥公司出品)，它來(lái)源于水蛭素衍生物，是一種合成的含20個(gè)氨基 酸的多肽，是凝血酶直接的、特異的、可逆性抑制劑。其相對(duì)分子質(zhì) 量為2180，氨基酸序列為D畫(huà)Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ash -Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro隱Glu-G 1 u-Tvr-Leu 。
比伐盧定氨基端的D-Phe-Pro-Arg-Pro區(qū)域是與凝血酶活性點(diǎn)相 互作用的位點(diǎn)，它可與游離型或與結(jié)合型凝血酶催化位點(diǎn)和底物識(shí)別 位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，從而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解 本品多肽順序中Arg3和Pro4之間的肽鍵，使本品失活，所以比伐盧 定對(duì)凝血酶的抑制作用是可逆而短暫的。比伐盧定與水蛭素相反，經(jīng) 腎排泄不是其主要的清除途徑，它可能是被內(nèi)源性多肽酶降解，可安 全用于腎損害患者，腎功能正常時(shí)，比伐盧定的半衰期為25min?；?于比伐盧定的以上特點(diǎn)與生物學(xué)活性，用比伐盧定作為防治血栓的藥 物有諸多優(yōu)點(diǎn)(O專一性強(qiáng)，特異性直接抑制凝血酶活性，且對(duì)血 栓結(jié)合的凝血酶也有抑制作用；(2)半衰期短，且對(duì)凝血酶的抑制作 用是可逆性的，故而抗凝效果可以被預(yù)測(cè)，不需要實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)；(3) 可安全用于腎損害患者。
4比伐盧定在藥理學(xué)上克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺點(diǎn)，
用于抗凝防栓安全有效。諸多臨床試驗(yàn)研究表明，它可替代肝素安全、
有效地用于冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PCI)、不穩(wěn)定型心絞痛以及急性心
肌梗死溶栓輔助治療，尤其在肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥Hf的抗栓治
療中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，且在外周動(dòng)脈介入治療PPI、心肺移植手術(shù)及腎
功能不全患者防栓抗栓治療中亦顯示出良好的作用。因此，比伐盧定 是一種有著很好臨床應(yīng)用前景的藥物，目前已經(jīng)被歐美和其它地區(qū)，
如加拿大、以色列、新西蘭、阿根廷等國(guó)家批準(zhǔn)，允許其上市。2005 年全球銷(xiāo)售1.5億美元，2006年全球銷(xiāo)售2.1億美元，2007年全球銷(xiāo) 售2.55億美元，其市場(chǎng)應(yīng)用正在不斷擴(kuò)大。然而，比伐盧定在我國(guó) 尚未上市，Medicines公司也沒(méi)有在亞洲地區(qū)的上市計(jì)劃，這在很大 程度上延誤了我國(guó)心血管醫(yī)療事業(yè)——尤其是冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù) 的發(fā)展。實(shí)現(xiàn)比伐盧定的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，能夠很好地促進(jìn)比伐 盧定藥物在我國(guó)醫(yī)療事業(yè)的應(yīng)用，提高心臟手術(shù)的醫(yī)療水平。
比伐盧定作為一個(gè)很有合成難度的多肽藥物，其高昂的合成成本 限制了大規(guī)模生產(chǎn)和市場(chǎng)應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)使用液相合成法制 備比伐盧定的文獻(xiàn)和專利報(bào)道。己有的主要研究論文及專利如下
美國(guó)專利US5196404是比伐盧定的化合物專利，最早報(bào)導(dǎo)了比 伐盧定的制備方法(1990年7月6日申請(qǐng))，以BOC保護(hù)的氨基酸 為原料，采用固相合成，最后用強(qiáng)刺激、劇毒的HF，在特殊的聚四 氟乙烯裝置中切肽樹(shù)脂。此方法不適合規(guī)模化合成。隆薩股份公司于 2006年3月4日申請(qǐng)的WO2006045503專利，與EP1737889、 CN 200580043573.1是同族專利，采用對(duì)酸不穩(wěn)定的樹(shù)脂，得到脫保護(hù)肽 或部分保護(hù)肽，后者經(jīng)純化再脫保護(hù)得到目的肽。此法可以減少9位天冬酰胺變?yōu)樘於彼岬母狈磻?yīng)，能夠得到純度大于99%的目的肽。
上海子能2006年3月10日申請(qǐng)的CN200610024611.5專利，名稱為 "固相多肽合成比伐盧定的制備方法"，系用Wang樹(shù)脂或CTC樹(shù)脂 合成；Novetide公司2007年3月22日申請(qǐng)的WO2007033383專利， 與EP1805204、 US2007093423是同族專利，名稱為Process for production of Bivalirudin，也是采用CTC樹(shù)脂進(jìn)行合成。
上述文獻(xiàn)報(bào)道的比伐盧定的固相合成方法，需采用昂貴的特殊樹(shù) 脂和大過(guò)量的特殊保護(hù)氨基酸及縮合試劑，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模合成，生 產(chǎn)成本高。有的工藝需要用到劇毒的氟化氫，需要特殊的反應(yīng)裝置， 也很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一種生產(chǎn)成 本相對(duì)較低、適宜規(guī)?；a(chǎn)的比伐盧定的液相合成方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
首先，用液相法逐步合成三個(gè)全保護(hù)片段，艮P:
"片段A", N-端全保護(hù)的6肽W-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3，
"片段B"，中段全保護(hù)的6肽Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3，
"片段C"， C-端全保護(hù)的8肽I^-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro -Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;
然后，將"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端全保護(hù)的14肽W-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4)隱Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;接著，將"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐盧定的全保護(hù)
20肽R、D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4) -Phe-Glu ( R4 ) -Glu ( R4 )誦Ile-Pro隱Glu (R4 ) -Glu (R4) -Tyr ( R5) -Leu-OR3;
最后，脫除上述全保護(hù)20肽的所有保護(hù)基團(tuán)Ri R5，得到比伐 盧定的粗品，進(jìn)一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe陽(yáng)Glu-Glu-Ile-Pro國(guó)Glu陽(yáng)Glu畫(huà)Tyr畫(huà)Leu。
本發(fā)明采用液相合成法制備比伐盧定，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，與固相合
成法相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)(1)不需要樹(shù)脂和大過(guò)量的保護(hù)氨基酸及 縮合劑；(2)易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本；(3)不需大 量的洗滌溶劑，常用溶劑可回收再利用；(4)不必使用劇毒的氟化氫 和有一定神經(jīng)毒性的六氫吡啶，易于實(shí)現(xiàn)安全生產(chǎn)，沒(méi)有傳統(tǒng)固相多 肽工藝面臨的巨大環(huán)保壓力。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以液相合成比伐盧定為目的，綜合固相法與液相法合成多 肽的先進(jìn)方法和技術(shù)，通過(guò)對(duì)比伐盧定所含氨基酸的正交保護(hù)策略、 縮合劑和溶劑的選擇、反應(yīng)條件的優(yōu)化、粗產(chǎn)品的純化等多種因素進(jìn) 行全面分析，設(shè)計(jì)出一條新穎的比伐盧定的液相合成路線，能夠在保 證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，最大限度地降低比伐盧定的合成成本。
本發(fā)明的主要技術(shù)路線是——
首先合成三個(gè)較大的全保護(hù)片段"片段A" N-端全保護(hù)的6肽， R^-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3;"片段B"中段全保護(hù)的6 肽，Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3;"片段C"C-端全保護(hù) 的8肽，RLG1u (R4) -Glu (R4)畫(huà)Ile-Pro-Glu (R4)陽(yáng)Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3。然后將"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端
全保護(hù)的14肽:R!-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu畫(huà)OR3。
再將"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐盧定的全保護(hù)20 肽RLD-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly匪Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4)誦Glu ( R4 ) -Ile-Pro-Glu ( R4 ) -Glu (R4 ) -Tyr ( R5) -Leu-OR3 。
最后，脫除上述全保護(hù)20肽的所有保護(hù)基團(tuán)Ri R5，得到比伐 盧定的粗品，進(jìn)一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly畫(huà)Asn-Gly畫(huà)Asp-Phe畫(huà)Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr畫(huà)Leu。
根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案，脫除所述全保護(hù)20肽的所有保護(hù)基團(tuán)的 方法是用堿脫除C-末端保護(hù)，用酸脫除N-末端及所有側(cè)鏈保護(hù)基。 優(yōu)選地，可用TFA-TIS溶液一次性脫除所述全保護(hù)20肽的兩端及側(cè) 鏈的所有保護(hù)基團(tuán)。脫除所有保護(hù)基團(tuán)之后獲得的比伐盧定粗品，可 以采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行純化。
本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述液相法合成比伐盧定的方法中，保護(hù)基 團(tuán)R1 115分別優(yōu)選以下種類——
R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (芐氧羰基)，F(xiàn)moc (9-芴甲氧羰基)；
R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?，Pmc (2,2,5，7,8-五甲 基苯并二氫吡喃-6-磺?；?，Pbf (2，2,4,6,7-五甲基苯并二氫呋喃-5-磺?；?，N02 (硝基)，Z (芐氧羰基)，Z2 (雙芐氧羰基)；
R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分別為乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (芐基)；
R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)；
R5=Bzl (節(jié)基)，tBu (叔丁基)。下面以具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明液相法制備比伐盧定的過(guò)程， 其僅為典型范例，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
1、"片段A" N-端全保護(hù)6肽的合成。工藝過(guò)程如下
Boc-Gly-OHH-Gly-OMe.HC l
I_1
j DCC-HOBt-NMM
Boc-Gly匿Gly-OMe
J 4N HC1 in Dioxine Boc-Pro-OH H-Gly-Gly-OMe.HCl
j DCC-HOBt匿N(xiāo)MM Boc-Pro-Gly-Gly扁OMe
j 4N HC1 in Dioxine Z-Arg(Pbf)-OH H-Pro-Gly-Gly-OMe
I__I
J PyBOP-NMM Z-Arg(Pbf)-Pro-GIy-Gly-OMe j H2-Pd/C Z-Pro-OH H匿Arg(Pbf)-Pro畫(huà)Gly-Gly-OMe
+ PyBOP-NMM Z-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe j H2-Pd/C
Boc-D-Phe-OH H-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe
j PyBOP-畫(huà)M Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro匿Gly-Gly-OMe j 2N NaOH/H + Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH
1.1 H-Gly-Gly-OMe HC1的制備
將Boc-Gly-OH (30克，181.5mmol)溶于200ml THF中，室溫 下依次加入H-Gly-OMe'HCl (22.6克，181.5mmol)， DCC(37.4克， 200mmol)禾n HOBt (24.5克，200mmol)，攪拌下滴加NMM (18.3 克，181.5mmol)，滴加完畢，室溫?cái)嚢?0分鐘。TLC跟蹤反應(yīng)，反 應(yīng)完畢后，濾除固體，減壓蒸去THF，加入150ml乙酸乙酯溶解殘 余物，分別用10%的檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶 液洗滌乙酸乙酯溶液，分離有機(jī)相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑， 減壓蒸去乙酸乙酯，加入200ml石油醚，冰浴冷卻，析出固體。濾集固體，干燥后得32克Boc-Gly-Gly-OMe，收率76%,產(chǎn)物Rf = 0.5 (甲醇乙酸乙酉旨=1:20)。將32克Boc-Gly-Gly-OMe與150ml、 4N 的HCl/二氧六環(huán)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)析出固體，濾集固體， 干燥后得17.5克H-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+lT): 147.00 (分 子量146.14)。
1.2 H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1的制備
冰浴下，將Boc-Pro-OH (17.5克，70mmo1)和12.7克(70mmo1) H-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入DCC (15.86克， 70mmol)， HOBT (10.4克，77mmo1)， NMM (7.86g， 77mmo1)，緩 慢升溫至室溫反應(yīng)l小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收 集濾液，減壓除去溶劑，殘余物用100ml乙酸乙酯溶解，分別用10% 擰檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌， 無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得22.3 克Boc-Pro匿Gly畫(huà)Gly隱OMe，收率93%。將22.3克Boc-Pro-Gly隱Gly陽(yáng)OMe 與100ml、 4N的HCl/二氧六環(huán)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)析出固體， 濾集固體并干燥，得18.0克H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+H^: 244.13 (分子量:243.27)。
1.3 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe的制備
冰浴下，將Z-Arg (Pbf) -OH (16克，28.5mmo1)和6.93克 (28.5mmo1) H畫(huà)Pro-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入 PyBOP (14.1克，27mmol)， NMM (2.3克，28.5mmo1)，緩慢升溫 至室溫反應(yīng)1.5小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng))。反應(yīng)完畢后，減壓除去溶劑， 剩余物經(jīng)硅膠柱層析純化得20克Z-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe， 收率90% 。室溫下，將Z-Arg( Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe( 20克，25.4mmo1)和10。/。Pd/C (2克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)2小時(shí)， 減壓除去溶劑后，得固體16.5克，收率99%， ESI-MS(M+lT): 652.30 (分子量651.47)。
1.4 H-Pro-Arg (Pbf)隱Pro-Gly-Gly隱OMe的制備
冰浴下，將Z-Pro-OH(11.9克，47.6mmol)和31.0克(47.6mmo1) H-Arg (pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe溶于100ml THF中，加入PyBOP (23.5 克，45.2mmol)， NMM (4.8克，47.6mmo1)。緩慢升溫至室溫反應(yīng)3 小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng) 硅膠柱層析純化得40克Z-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe，收率 96%。室溫下，將Z畫(huà)Pro畫(huà)Arg (Pbf)畫(huà)Pro畫(huà)Gly-Gly畫(huà)OMe (16克，18mmo1) 和10%Pd/C (1.6克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)2小時(shí)， 減壓除去溶劑后，得產(chǎn)物13.0克，收率99%， ESI-MS (M+I^): 749.47 (分子量748.43)。
1.5 Boc-D-Phe-Pro畫(huà)Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH的制備 冰浴下，將Boc誦D-Phe-OH (11.5克，43.5mmo1)和H-Pro陽(yáng)Arg
(Pbf)國(guó)Pro畫(huà)Gly-Gly畫(huà)OMe (32.5克，43.5mmo1)溶于150mlTHF中， 加入PyBOP (21.5克，41.5mmol)， NMM (4.4克，43.5mmo1)，緩 慢升溫至室溫，反應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢，減壓 蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得41.0克Boc-D-Phe-Pro-Arg
(Pbf)國(guó)Pro-Gly國(guó)Gly-OMe，收率98%。將Boc國(guó)D-Phe-Pro國(guó)Arg (Pbf) -Pro隱Gly-Gly國(guó)OMe (10克，lOmmol)禾B NaOH (400毫克，lOmmol) 溶于50mlMeOH中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，減壓除去溶劑，剩余物用水 溶解，用1NHCl調(diào)pH值到1-2，有固體析出，過(guò)濾干燥得9.4克產(chǎn) 物，收率950/0， ESI-MS (M-H) 980.65 (分子量:981.63)。2、"片段B"中段全保護(hù)的6肽的合成。工藝過(guò)程如下:
Z-Asp(OtBu)-OH H隱Phe隱OMe.HCl
Z-Gly-OH H-Gly-OMe.HCl
DCC-HOBt-麗M
Z-Gly-Gly-OMe
j 2N NaOH/H+
Z-Gly,Gly-OH
'(I) HOSu-DCC r (2; H-Asn(Trt)-OH/NaHC03
Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH
j DCC-HOBt-麗M Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe j H2-Pd/C Z-Gly-OH H-Asp(OtBu)-Phe-OMe
+ HBTU-HOBt-NMM Z-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
I H2-Pd/C H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
HBTU-HOBt-NMM
Z-Gly-Gly-Asn-GIy-Asp(OtBu)-Phe-OMe I 2NNaOH/H+
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH
2.1 H-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制備
冰浴下，將Z-Asp (OtBu) -OH.H20 (30克，88mmol)和18.96 克(88mmol)的H-Phe-OMe HCl溶于250ml THF中，依次加入DCC
(18.12克，88.0mmol)、 HOBT (11.88克，88mmol)、 NMM (8.88 克，88mmol)，緩慢升溫至室溫反應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。 反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩余物用150ml乙酸 乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、 飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓 蒸去乙酸乙酯，得50克Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率88%。
室溫下，將Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe (50克，103.2mmol)和 10%Pd/C (3.75克)加入至150ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)2小時(shí)， 減壓除去溶劑，得27克產(chǎn)物，收率99%， ESI-MS (M+lT): 351.10
(分子量:349.85)。2.2 H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制備
冰浴下，將Z-Gly-OH (12.9克，57,lmmol)和H國(guó)Asp (OtBu) -Phe-OMe (20克，57. lmmol)溶于250ml THF中，加入HBTU(21.67 克，57.1mmol)， NMM (5.77克，57.1mmol)，緩慢升溫至室溫，反 應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，減壓除去溶劑，剩余 物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳酸 氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干 燥劑，減壓除去溶劑，剩余物柱層析純化得27克Z-Gly-Asp (OtBu) 畫(huà)Phe-OMe，收率90%。
室溫下，將Z畫(huà)Gly隱Asp (OtBu) -Phe隱OMe (27克，51.4mmo1) 和10%Pd/C (2.7克)加入至150ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)2小時(shí)， 減壓除去溶劑，得20.5克產(chǎn)物，收率99%， ESI-MS (M+Na+): 430.10 (分子量407.36)。
2.3 Z-Gly-Gly-OH的制備
冰浴下，將Z-Gly-OH (10克，48mmo1)和H-Gly-OMe HC1 (6 克，48mmol)溶于250ml THF中，依次加入DCC( 10.83克，53mmo1)、 HOBT (7.1克，53mmo1)和NMM (9.66克，96mmo1)。緩慢升溫至 室溫反應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾 液，減壓除去溶劑，剩余物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽 和氯化鈉溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用 無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物柱層析純化 得14克Z-Gly-Gly-OMe，收率93%。
將Z-Gly-Gly-OMe (4.9克，17.42mmo1)和NaOH (1.05克，26.1 mmol)，溶于50ml MeOH中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，1NHCl調(diào)pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)， 合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑，干燥后 得4.2克產(chǎn)物，收率90%。
2.4 Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH的制備
室溫下，將Z-Gly-Gly畫(huà)OH (8克，30.14mmo1)， HOSu (3.63克， 31.55mmol)， DCC (6.5克，31.55mmo1)溶于150mlTHF，攪拌反應(yīng) 2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾液。
室溫下，將H-Asn (Trt) -OH (14.53克，38.8mmol)， NaHC03 (6.52g， 77.6mmo1)溶于50mlTHF和50ml水的混合溶劑中，將上 一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)。減壓除去溶 劑，用1NHCI調(diào)pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)，合并有機(jī) 相，無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得20.9克產(chǎn) 物，收率87%。
2.5 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)畫(huà)Gly畫(huà)Asp (OtBu)國(guó)Phe-OH的制備 冰浴下，將Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH (8.42克，13.52mmo1)和
H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe (5.51克，13.52mmo1)溶于150mlTHF 中，依次加入DCC(2.93克，M.2mmo0、 HOBT(1.92克，14.2mmo1) 和NMM(1.34克，13.52mmo1)。緩慢升溫至室溫，反應(yīng)2小時(shí)(TLC 跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩 余物用乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、飽和碳 酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除 干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物柱層析純化得11.94克 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)畫(huà)Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率87%。
將Z-Gly畫(huà)Gly畫(huà)Asn (Trt) -Gly畫(huà)Asp (OtBu)誦Phe-OMe (IO克，10mmol)， NaOH(1.2克，30mmol)，溶于100ml MeOH中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，用1NHCl調(diào)pH至3-4， 析出白色固體，濾集固體，干燥后得產(chǎn)物9.2克，收率91%， ESI-MS (M-H-): 999.25 (分子量1000.12)。
3、"片段C" C-端全保護(hù)8肽的合成。工藝過(guò)程如下
Z-Glu(OtBu)-OSu H-Glu(OtBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH j DCC-HOSu
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H-Tyr(tBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-OH H-Leu-OMe
+ DCC-HOBt Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)隱Leu-OMe ,H2-Pd/C
Z-Pro-OH H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
丄 DCC-HOBt
Z隱Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H國(guó)Ile-OH T
I i Z-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
H2-Pd/C
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile"OH H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
+ DCC-HOBt
Z-Glu(O氾u)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(Otfiu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
j H2-Pd/C
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
3.1 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH的制備
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -OH (101克，300mmol)， HOSu (44.5 克，300mmol)， DCC (68.0克，330mmol)溶于300ml THF,攪拌反 應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾液。
室溫下，將H畫(huà)Glu (OtBu)陽(yáng)OH (60.9克，300mmol)， NaHC03(50.4克，600mmol)溶于200ml THF和200ml水的混合溶劑中，將 上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)。減壓除去 溶劑，用IN HCl調(diào)pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得142.9 克產(chǎn)物，收率92%。
3.2 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH的制備 室溫下，將Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(105.2克，200mmol)，
HOSu (33克，200mmol)， DCC (45.3克，220mmol)溶于200ml THF， 攪拌反應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾 液。
室溫下，將H-Tyr (tBu) -OH (57.46克，200mmol)， NaHC03 (33.6g， 400mmol)溶于150ml THF和150ml水的混合溶劑中，將 上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)。減壓除去 溶劑，用1NHCl調(diào)pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得129.1 克產(chǎn)物，收率87%。
3.3 H國(guó)Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)畫(huà)Leu-OMe的制備 冰浴下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH (111.3
克，150mmo1)和H-Leu-OMe . HC1 (27.3克，150mmo1)溶于100ml THF,依次加入DCC(30.9克，150mmol)、 HOBT (20.2克，150mmo1) 和NMM(15.5克，150mmo1)。緩慢升溫至室溫，反應(yīng)4小時(shí)(TLC 跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾液，減壓除去溶劑，剩 余物用150ml乙酸乙酯溶解，分別用10%檸檬酸、飽和氯化鈉溶液、 飽和碳酸氫鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，剩余物經(jīng)柱層析純化得110.6克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率85%。
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (86.9克，lOOmmol)和腦Pd/C (3.6克)加入至150ml甲醇中，
氫氣保護(hù)下反應(yīng)2小時(shí)，減壓除去溶劑后，得固體69.8克，收率95%,
ESI-MS (M+HO: 736.15 (分子量734.93)。
3.4 H-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe的
制備
冰浴下，將Z畫(huà)Pro-OH (12.5克，50mmo1)和H- Glu (OtBu)陽(yáng)Glu (OtBu) -Tyr (tBu)隱Leu-OMe (36.7克，50mmo1)溶于100mlTHF 中，加入PyBOP (26克，50mmo1)， NMM (5克，50mmo1)。緩慢 升溫至室溫反應(yīng)6小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)。反應(yīng)完畢后，減壓蒸 去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得45.8克Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率94%。
室溫下，將Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (35克，36mmo1)和10% Pd/C (3.2克)加入至150ml甲醇中，氫 氣保護(hù)下反應(yīng)3小時(shí)，減壓除去溶劑后，得產(chǎn)物28.7克，收率96%， ESI-MS (M+H"): 832.87 (分子量832,05)。
3.5 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH的制備
室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH (26克，5Ommo1)， HOSu (5.75克，50mmol)， DCC (U.3克，55mmo1)溶于100mlTHF， 攪拌反應(yīng)2小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，收集濾 液。
室溫下，將H-Ile-OH(6.6克，50mmol)， NaHC03(8.4g， lOOmmol)溶于30ml THF和30ml水的混合溶劑中，將上一步得到的濾液緩慢滴加至該體系中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)。減壓除去溶劑，用IN HC1調(diào)pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(80mlX3)，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥。濾除干燥劑，減壓除去溶劑后，得28.5克產(chǎn)物，收率90%。
3.6 H-Glu ( OtBu ) -Glu (OtBu ) -Ile-Pro-Glu ( OtBu) -Glu ( OtBu)-Tyr (tBu) -Leu-OMe的制備
冰浴下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH (12.7克，20mmo1)和H-Pro-Glu (OtBu)國(guó)Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu扁OMe (16.6克，20mmo1)溶于50ml DMF中，加入PyBOP (10.4克，20mmol)， NMM
(2克，20mmo1)。緩慢升溫至室溫反應(yīng)12小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化后得24.3克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -lie-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)國(guó)Tyr
(tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室溫下，將Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)畫(huà)Tyr (tBu)誦Leu-OMe (20克，13.8mmol)禾卩10%Pd/C
(1.6克)加入至100ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)6小時(shí)，減壓除去溶劑后，得產(chǎn)物16.5克，收率91%， ESI-MS (M+2lT): 658.67 (分子量1315.65)。
4、"片段B"與"片段C"縮合形成"片段D"。工藝過(guò)程如下
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH —H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe-l pyBop NMM
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-GIu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
,,HrPd/C
H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(O但u)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe冰浴下，將Z-Gly國(guó)Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)國(guó)Phe-OMe (8.2克，8.2mmo1)和H-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (10.8克，8.2mmol)溶于30ml DMF中，加入PyBOP (4.2克，8.2mmol)，菌M (0.8克，8.2mmol)。緩慢升溫至室溫反應(yīng)24小時(shí)(TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化后得15.8克Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (OtBu)畫(huà)Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室溫下，將Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)-Leu-OMe， (14克，6mmo1)和10% Pd/C (0.8克)加入至30ml甲醇中，氫氣保護(hù)下反應(yīng)8小時(shí)，減壓除去溶劑后，得產(chǎn)物11.9克，收率92%， ESI-MS (M+3H^): 722.27 (分子量:2163.62)。
5、"片段A"與"片段D"縮合。工藝過(guò)程如下
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH—H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-ne-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(氾u)-Leu-OMe」 p^op.薩
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
2N歸H/lT
Boc-D-Phe-Pra-Arg(Pbf)-PrO"Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe"Glu(OtBu>Glu(OtBu>Ile-PrO"Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(ffiu)-Leu-OH
TFA-TIS
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
冰浴下，將Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH (4.8克，4.9mmol)和H-Gly國(guó)Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe(10.6克，4.9mmol)溶于25ml DMF中，加入PyBOP (2.5克，，4.9mmol)。緩慢升纟顯至室溫反應(yīng)24小時(shí) (TLC跟蹤反應(yīng)過(guò)程)，反應(yīng)完畢后，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠 柱層析純化后得12.2克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly 陽(yáng)Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) - Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)曙Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率80%。
在室溫下，將Boc誦D畫(huà)Phe-Pro-Arg(Pbf)國(guó)Pro畫(huà)Gly國(guó)Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe國(guó)Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)畫(huà)Tyr (tBu) -Leu畫(huà)OMe (10克，3.2mmol)和 NaOH (0.256克，6.4mmol)，溶于20ml MeOH中，室溫?cái)嚢?小時(shí)， 減壓除去溶劑，剩余物用水溶解，用1NHCl調(diào)pH至3-4，析出白色 固體，濾集固體，干燥后得9.3克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly隱Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)陽(yáng)Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)畫(huà)Leu-OH，收率93%， ESI-MS (M-H'): 777.61 (分子量3113.74)。
將Boc-D-Phe-Pro國(guó)Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OH (6.3克，2mmo1)溶于冰浴冷卻的 200ml TFA/TIS (95:5)中，攪拌，逐漸升溫至室溫，反應(yīng)2小時(shí)后 減壓除去溶劑，加入冰浴冷卻的500ml乙醚，得白色固體沉降，即為 比伐盧定粗品。經(jīng)HPLC純化和冰凍干燥，得3.4克干粉比伐盧定， 純度98.5%，收率78%， ESI-MS (M+3tf): 778.31 (分子量2180.33)。
權(quán)利要求
1、比伐盧定的液相合成方法，其特征在于依次包含下列步驟首先，用液相法逐步合成三個(gè)全保護(hù)片段，即“片段A”，N-端全保護(hù)的6肽R1-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-OR3，“片段B”，中段全保護(hù)的6肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-OR3，“片段C”，C-端全保護(hù)的8肽R1-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；然后，將“片段B”和“片段C”縮合，得到“片段D”，即C-端全保護(hù)的14肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；接著，將“片段A”和“片段D”縮合，得到比伐盧定的全保護(hù)20肽R1-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；最后，脫除上述全保護(hù)20肽的所有保護(hù)基團(tuán)R1～R5，得到比伐盧定的粗品，進(jìn)一步純化得到比伐盧定純品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比伐盧定的液相合成方法，其特征在于所述保護(hù)基團(tuán)W RS優(yōu)選——R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (芐氧羰基)，F(xiàn)moc (9-芴甲氧羰基)； R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?，Pmc (2，2，5，7，8-五甲 基苯并二氫吡喃-6-磺?；?，Pbf (2,2，4,6,7-五甲基苯并二氫呋喃-5-磺酰基)，N02 (硝基)，Z (芐氧羰基)，Z2 (雙芐氧羰基)；R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分別為乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (芐基)； R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)； R5=Bzl (節(jié)基)，tBu (叔丁基)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的比伐盧定的液相合成方法，其特 征在于脫除所述全保護(hù)20肽的所有保護(hù)基團(tuán)的方法是，用堿脫除 C-末端保護(hù)，用酸脫除N-末端及所有側(cè)鏈保護(hù)基。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的比伐盧定的液相合成方法，其特征在 于用TFA-TIS溶液一次性脫除所述全保護(hù)20肽的兩端及側(cè)鏈的所 有保護(hù)基團(tuán)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的比伐盧定的液相合成方法，其特 征在于采用高效液相色譜對(duì)所述比伐盧定粗品進(jìn)行純化。
全文摘要
本發(fā)明提供一種比伐盧定的液相合成方法。首先逐步合成三個(gè)全保護(hù)的片段N-端全保護(hù)的6肽、中段全保護(hù)的6肽、C-端全保護(hù)的8肽，然后將這三個(gè)片段依次縮合得到全保護(hù)的比伐盧定，最后脫除所有保護(hù)基團(tuán)得到比伐盧定粗品，再經(jīng)過(guò)高效液相色譜純化，得到比伐盧定純品。該方法不需要樹(shù)脂和大過(guò)量的保護(hù)氨基酸及縮合劑，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，且生產(chǎn)成本相對(duì)較低。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101475631SQ20091002879
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者王良友, 黃仰青 申請(qǐng)人:蘇州中科天馬肽工程中心有限公司