專利名稱：花粉介導的植物基因轉化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種花粉介導的植物基因轉化方法，特別是指一種利用電穿孔法將外源基因導入植物花粉后，再使花粉經由人工授粉產生帶有外源基因的轉化種子，且具有高轉化率的簡易的植物基因轉化方法。
背景技術：
分子生物學與組織培養(yǎng)的發(fā)展，縮短了植物育種及品種改良的研發(fā)過程，通過遺傳工程學的方法，農業(yè)科學家可以將對疾病具有抵抗力的基因、增加營養(yǎng)成分的基因等轉化進入作物植株內，以期能栽培出不易因疫病而降低收成量或是提升經濟價值的作物。目前常用的植物基因轉化方法有利用微注射法(microinjection)、基因槍(gene gun)、電穿孔(electroporation)等直接將外源基因送至目標細胞的細胞質內的直接法， 也有利用載體(例如農桿菌)將外源基因導入植物細胞的間接方法，然而，這些植物基因轉化法都需要經歷冗長的組織培養(yǎng)與再生過程，而且效率不高，目前，大約只有50種植物可以通過這些方法進行基因轉化。近年有科學家發(fā)展出花粉管路徑法(pollen tube pattway)，將外源基因附著在花粉(雄配子體)表面以進行授粉，外源基因隨著花粉管進入受精卵，以產生具有外源基因的種子，亦有將植物配子體(gamete)或合子(zygote)做為轉化標的，并將含有轉化基因的配子體或合子進行授粉，以此可省略組織培養(yǎng)的程序，而后亦有人嘗試利用花粉做為外源遺傳物質載體的轉化方法。然而，利用這些方法的轉化成功率大多僅維持1_10%，因此轉化率低為其最大的缺點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的主要目的也就是為了解決上述現有技術中存在的問題，進而提供一種利用電穿孔法直接將外源基因導入植物花粉后，再經由授粉以產生轉化種子且具有高轉化率的植物基因轉化方法，本方法不受植物種類與轉化后可否進行組織培養(yǎng)再生的限制、轉化后的植株不易發(fā)生突變且不需藉由組織培養(yǎng)與再生即可獲得具有轉化基因之子代，操作過程亦十分簡單快速。本發(fā)明的花粉介導的植物基因轉化方法是將外源基因與新鮮花粉溶液混合，形成電穿孔(electroporation)制備溶液，對該制備溶液施以特定電壓進行電擊后，花粉壁因電擊作用而產生孔洞，使得外源基因得以導入花粉而產生具有外源基因的轉化花粉，最后利用轉化花粉進行授粉以培育出具有外源基因的種子，該種子萌芽后，即可獲得具有該外源基因的子代植株。本發(fā)明系利用電壓電擊(electroporation)來使花粉壁產生開孔，但電壓太強或孔洞過大時，可能導致花粉的死亡而降低花粉之存活率，進而降低授粉后獲得的種子數，而孔洞過小時，可能使外源基因無法順利導入花粉內而降低外源基因的轉化率，因此，利用本發(fā)明方法進行植物基因轉化時，電壓強度及外源基因片段大小皆為重要的影響參數，本發(fā)明同時以電擊后之花粉存活率(％ )與外源基因導入率(％ )作為本發(fā)明評估植物基因轉化所需使用的最佳導入電壓的判斷依據，當花粉存活率(％ )與外源基因導入率(％ )相乘值為最大時的電壓值即為最佳導入外源基因的電壓值。本發(fā)明的方法可使外源基因經由花粉的遺傳物質一起傳至下一代并且進行表達， 且轉化率與前人的方法比較可以得到有效的提升，此方法不僅不需要冗長的組織培養(yǎng)與再生過程，任何開花植物都可以適用，而操作過程簡單省時更為本發(fā)明的一大優(yōu)點。


圖1為電擊電壓與花粉存活率和外源基因導入率關系圖。圖2為花粉存活率染色檢測結果。圖3為本發(fā)明轉化方法所使用的pCAMBIA質粒DNA圖譜。圖4為外源基因導入率染色檢測結果。主要組件符號說明A 不同電擊電壓下花粉存活率。B 不同電擊電壓下外源基因導入率。
具體實施例方式本發(fā)明的花粉介導的植物基因轉化方法，包括下列步驟(1)制備新鮮花粉溶液；(2)構建外源基因；(3)將該新鮮花粉溶液與該外源基因混合，形成電穿孔制備溶液；(4)對該電穿孔制備溶液施以電壓進行電擊(electroporation)以形成轉化花粉；及 (5)利用該轉化花粉進行人工授粉以培育具有外源基因的轉化種子。其中，該外源基因的形態(tài)可為質粒、載體或裸露DNAOiaked DNA)。因花粉在不同電壓電擊下會有不同的存活率(％)，且不同大小片段的外源基因在不同電壓電擊下也會有不同的導入率(％)，該最佳導入電壓即花粉存活率與外源基因導入率的相乘值為最大值時的電擊電壓值。下面就以實施例進行具體說明。實施例在本實施例中，以具有潮霉素(Hygromycin)抗性基因的質粒做為外源基因，并將其轉化進入玉米花粉中。1.玉米基因轉化(1)制備新鮮花粉溶液本發(fā)明可適用于任何開花植物，在本實施例中選用玉米花粉做為花粉來源，為維持花粉活性為最佳狀態(tài)，在玉米花期開始時，于第一天傍晚將玉米株雄花上已開花的花藥除去，以采收第二天早晨的新鮮花粉，將該新鮮花粉利用低溫 (40C )花粉萌芽液(pollen germination medium, PGM)進行清洗及提純，并保存于新鮮的花粉萌芽液中，所擷取的花粉活性可以透過熒光二乙酸(fluoresccein diacetate，后簡稱為FDA)進行花粉染色后利用熒光顯微鏡觀察(如附圖2所示)。
(2)構建外源基因在本實施例中，以一 pCAMBIA質粒DNA(其質粒DNA圖譜如附圖3)做為測試外源基因，該pCAMBIA質粒以電穿孔法轉化至大腸桿菌XLl-Blue表達系統(tǒng)中進行大量表達，并提取出該pCAMBIA質粒DNA，該pCAMBIA質粒DNA具有植物基因轉化常用的報告基因O^poter gene) β-葡萄糖醛酸苷酶基因(β-glucuronidase gene，后簡稱為uidA基因)，還有在轉化細菌中表達的篩選標志新霉素磷酸轉移酶基因(Neomycin phosphotransferase gene，后簡稱為nptll基因)及在轉化植物細胞表達的潮霉素抗性基因(Hygromycin resistance gene,后簡禾爾為 hptll 基因)。(3)形成電穿孔制備溶液將10 μ g的pCAMBIA質粒DNA加入200 μ 1的新鮮花粉溶液中(花粉含量為0. 5 μ g/ μ 1)，混合均勻后形成電穿孔制備溶液。(4)形成轉化花粉將該電穿孔制備溶液置于一電擊管中，導入一電壓進行電擊， 并將進行電擊后的該電穿孔制備溶液進行快速過濾干燥，以取得轉化花粉，并以錐蟲紅 (trypan red，后簡稱TR)染色觀察外源基因轉化結果(如附圖4所示)，其中電擊時所使用的電壓依不同大小的外源基因DNA片段及花粉結構或活性可以設定為250、500、750、1000 伏特(V)，電容設定為25yF，不同電壓下之花粉存活率(A)及外源基因導入率(B)之關系如附圖1所示，當電擊電壓為1000伏特、電容為25 μ F時，其花粉存活率約為60%，外源基因導入率約為38 %，其相乘值約為23 %，表示在1000伏特的電擊電壓下，利用本發(fā)明方法進行基因轉化的成功機率約為23%，而與其它電擊電壓比較，該1000伏特的電擊電壓即為玉米花粉的最佳導入電壓。(5)授粉選擇柱頭長度小于一厘米的玉米雌花并剪去其柱頭，套紙袋以防其它花粉落于柱頭上，待兩天后，將在1000伏特電擊電壓下進行電穿孔所得的轉化花粉涂布于該柱頭上受粉，授粉后發(fā)育成具有pCAMBIA質粒DNA的玉米種子，在32穗授粉雌花中，共可取得535粒玉米種子。2.轉化成功率試驗將經由本發(fā)明之轉化方法取得之535粒玉米種子進行萌芽，取其中56株健康的幼苗(子株)，就篩選標志hptll基因及報告基因uid A的基因表達情況，檢測利用本發(fā)明方法進行基因轉化的成功率(結果如表1所示)。(1)篩選標志hptll基因將經過轉化的玉米種子進行發(fā)芽產生子株，將子株葉片取下放置于含有50mg/L潮霉素的V2MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，觀察葉面顏色變化情形，葉面無黃化現象或黃化面積小于1/2者視為對潮霉素有抗性，其余黃化者皆為不具抗性，在56 個發(fā)芽子株中有23株對潮霉素產生抗性，轉化成功的比例約為41%。(2)報告基因uid A基因經過轉化的玉米種子進行發(fā)芽產生56個子株，將子株發(fā)芽后的根尖組織以GUS染色法進行染色，若根尖組織呈現藍色表示報告基因uid A已成功經由本發(fā)明的方法轉化進入花粉，花粉于受精發(fā)育為種子后，該uid A基因會隨著玉米母株原有的遺傳物質(DNA)遞送到新的子株中被表達，轉化成功的比例約為30%。(3)篩選標志hptll基因及報導基因uid A基因在56株發(fā)芽子株中，同時具有篩選標志hptll基因及報導基因UidA基因表達能力的子株共有16株，轉化成功的比例接近 29%。表1、轉化植株初步篩選結果(n = 56)
權利要求
1.一種花粉介導的植物基因轉化方法，包括下列步驟(1)制備新鮮花粉溶液；(2)構建外源基因；(3)將該新鮮花粉溶液與該外源基因混合，形成電穿孔制備溶液；(4)對該電穿孔制備溶液施以電壓進行電擊，形成轉化花粉；及(5)利用該轉化花粉進行授粉以培育具有外源基因的種子；其中該電壓為花粉經過電擊后存活率與外源基因經電擊后導入花粉的導入率相乘值為最大時的電壓值。
2.如權利要求1所述的花粉介導的植物基因轉化方法，其中該外源基因的形態(tài)為質粒、載體或裸露DNA。
3.一種花粉介導的植物基因轉化方法，包括將外源基因通過電壓電擊導入植物花粉中，形成轉化花粉，并將所述轉化花粉經由授粉受精發(fā)育為種子。
4.如權利要求3所述的花粉介導的植物基因轉化方法，其中所述電壓為花粉經過電擊后存活率與外源基因經電擊后導入花粉的導入率相乘值為最大時的電壓值。
5.如權利要求4所述的花粉介導的植物基因轉化方法，其中該外源基因形態(tài)為質粒、 載體或裸露DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種花粉介導的植物基因轉化方法，包括將外源基因與新鮮花粉溶液混合，形成制備溶液，對該制備溶液施以電壓進行電擊后，讓花粉壁因電擊作用而產生孔洞，使得該外源基因得以導入花粉而產生具有外源基因的轉化花粉，最后將轉化花粉進行人工授粉以培育具有外源基因的種子，該種子經萌芽后，即可獲得具有該外源基因的子代植株，本方法不需通過組織培養(yǎng)或外源基因載體即可獲得具有轉化基因的子代，操作過程也十分簡單快速。
文檔編號C12N15/63GK102311967SQ20101022831
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月8日
發(fā)明者古森本, 顏永福 申請人:古森本, 顏永福