專利名稱：：積聚單萜和/或倍半萜的轉(zhuǎn)化的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的植物。具體地涉及積聚單薛和/或倍半萜的轉(zhuǎn)化的植物。該植物被轉(zhuǎn)化使其過量表達(dá)HMG-CoA還原酶(HMGR)和薛合酶(TS)以及非強(qiáng)制性選擇的異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(PRT)，或使其含有編碼這些酶的額外基因。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及制備該植物的方法，改變植物中特定碎含量的方法，生產(chǎn)辟的方法和上述基因在轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在大部分有機(jī)體中都發(fā)現(xiàn)有薛和薛類化合物。它們不斷增加的重要的商業(yè)價(jià)值與圍繞不同格的生物活度和功能性的多變范圍相聯(lián)系。因此，許多維生素、荷爾蒙、驅(qū)蟲劑、藥物、調(diào)味料和香料都被發(fā)現(xiàn)包含在這樣巨大種類的化合物中，所有這些化合物的生成都是來(lái)源于稱為異戊二烯單元的5碳單元。碎可通過存在于它們的結(jié)構(gòu)中的異戊二烯單元的數(shù)目來(lái)分類單萜(do),倍半萜(C"),二萜(C20),三萜(C30)，四萜(C40)和多萜(Cn,n>45)。植物界含有高度多樣的代表眾多不同結(jié)構(gòu)的單萜和倍半辟。較高級(jí)辟例如倍半辟的化學(xué)合成是非常復(fù)雜的，并且至今還沒有實(shí)現(xiàn)用于其制備的環(huán)境可接受的方法。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供避免多步化學(xué)合成而有效生產(chǎn)或積聚特定萜的方法。關(guān)于萜的生物合成路徑的研究揭示了所有萜的共同的C5前體為二磷酸異戊烯酯(IPP)。兩種不同的IPP生物合成的路徑共存于植物中。在細(xì)胞溶膠中發(fā)現(xiàn)的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)系的甲羥戊酸酯路徑(MVA)和在高等植物的質(zhì)體發(fā)現(xiàn)的非曱羥戊酸酯路徑(還稱為脫氧木酮糖路徑或磷酸曱基-D-赤蘚醇酯路徑(DOXP/MEP))。在兩種路徑中起始產(chǎn)物、所涉及的酶和催化反應(yīng)都不同，并且它們?cè)诟叩戎参锏募?xì)胞中平行運(yùn)轉(zhuǎn)并且相互補(bǔ)充。因此，在細(xì)胞質(zhì)中的MVA;洛徑負(fù)責(zé)甾醇、倍半萜和多碎的生物合成，而質(zhì)體(MEP路徑)提供用于單薛，二辟例如貝殼杉烯(C20),和多薛例如類胡蘿卜素(C40)和質(zhì)體醌-9(C45)合成的Cs單元。在IPP的合成之后，通過異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(PRT)的多次濃縮形成脂肪族的二磷酸異戊二烯酯碎前體用于各自的薛，即用于單碎的二磷酸香葉酯(GPP)和用于倍半萜的二磷酸法呢酯(FPP)。這些前體依次用作辟合酶或環(huán)化酶的底物，該底物對(duì)于每一種類的萜合酶(例如單辟，倍半蔣或二薛的合酶)是特定的。萜合酶可催化復(fù)雜多步驟的環(huán)化反應(yīng)以形成眾多的薛化合物的碳骨架。業(yè)已進(jìn)行了眾多的嘗試來(lái)分離特定的薛合酶并且WO2004/031376報(bào)道了編碼蓽澄茄醇合酶，朱欒倍半薛合酶和大根香葉烯合酶的基因的分離。當(dāng)將含有這些基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中時(shí)，可在培養(yǎng)介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的香味化合物。通常，考慮到現(xiàn)有技術(shù)中涉及萜合酶的異源表達(dá)，目的是提供積聚更多量的特定碎的手段和方法。在US5,589,619，US5,365,017，US5,349,126和US5,349,126中，公開了在轉(zhuǎn)基因植物中增加角鯊烯和甾醇積聚的方法。然而這些文獻(xiàn)對(duì)于怎樣增加其它種類的辟例如單碎和倍半辟的積聚沒有^己^1。轉(zhuǎn)基因植物的制備也是US6,841,717的主題，其涉及關(guān)于MEP路徑的基因。該文獻(xiàn)教示了編碼HMBPP-合酶(GCPE蛋白)的DNA分子，該分子與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽相關(guān)聯(lián)并且因此用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物。雖然該文獻(xiàn)涉及生育酚底物的積聚，其對(duì)于如何有效積聚其它碎化合物沒有提及。本發(fā)明的發(fā)明人提出生產(chǎn)或積聚特異的、選擇的萜的問題。優(yōu)選提供一種方法，該方法不僅適合于生產(chǎn)預(yù)先確定的萜，而且適合于任何感興趣的薛。因此，目的是提供一個(gè)系統(tǒng)，例如該系統(tǒng)中允許任何上述的倍半辟(如蓽澄茄醇、朱欒倍半萜、大根香葉烯、廣藿香醇)的積聚，然而其同樣適合于積聚其它的萜，特別是單薛。現(xiàn)有技術(shù)到目前為止還未解決這個(gè)問題，后者主要暗示了在MVP或MEP路徑中具有改變的特性的重組生物體，并且觀察到特定薛終產(chǎn)物的積聚。本發(fā)明的另一目的是以立體化學(xué)的純凈形式并通過可靠和節(jié)
發(fā)明內(nèi)容(TS)和非調(diào)控形式的HMG-CoA還原酶(HMGR)并且獲得了高產(chǎn)量的由TS合成的辟。令人驚奇的是，在異源體(編碼單獨(dú)基因的TS)轉(zhuǎn)化的植物中，檢測(cè)到碎的積聚，但卻非常有限并且與TS蛋白表達(dá)水平不相關(guān)。本發(fā)明的一個(gè)重要的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)編碼選擇辟的合酶的核苷酸序列已知或可被常規(guī)分離時(shí)，任何期望的碎都能在任意的植物中積聚。通過將至少兩種基因產(chǎn)物——即HMGR和能夠合成萜的酶，TS——定位于植物的細(xì)胞溶膠中，上述優(yōu)點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)是可能的。因此，第一方面，本發(fā)明提供了表達(dá)編碼HMG-CoA還原酶(HMGR)的轉(zhuǎn)基因和編碼辟合酶(TS)的轉(zhuǎn)基因的植物。第二方面，本發(fā)明提供了被轉(zhuǎn)化以含有額外基因的植物，所述基因編碼至少HMGR和TS。第三方面，本發(fā)明提供了含有編碼至少一種PRT和/或至少一種TS的核苦酸序列的載體。第四方面，本發(fā)明提供了制備轉(zhuǎn)化的植物的方法，該方法包含以下步驟轉(zhuǎn)化植物材料使其含有額外基因，所述額外基因編碼HMGR和TS;和從所述植物材料中再生出轉(zhuǎn)化的植物。第五方面，本發(fā)明提供了如本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書中詳述的另一用于制備轉(zhuǎn)化的植物的方法。另一方面，本發(fā)明提供了改變植物中薛含量的方法，該方法包含轉(zhuǎn)化植物的方法的步驟。又一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)薛的方法，該方法包含分離本發(fā)明植物中或由制備轉(zhuǎn)化的植物的方法中獲得的碎的步驟。再一方面，本發(fā)明提供了至少一種編碼HMGR和TS的基因在具有改變的辟含量的植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。在附圖中，圖1A、圖1B、圖1C和圖1D顯示在A部分和B部分中，對(duì)照煙草品系(B部分)和用編碼HMG-CoA還原酶(HMGR)和倍半萜(廣藿香醇)合酶(PTS)的轉(zhuǎn)基因兩者轉(zhuǎn)化的煙草品系(A部分)的GC-MS分析。C部分顯示了在色i普?qǐng)DA中的峰10用MS分析并且通過與可信的廣藿香醇(D)比較被鑒定為廣藿香醇。峰3作為內(nèi)標(biāo)(3-a-;^香烯)。圖2定量地顯示了在過量表達(dá)二磷酸法呢酯合酶(FPS)、倍半萜(廣藿香醇)合酶(PTS)或者過量表達(dá)兩者的再生轉(zhuǎn)基因植物品系中mRNA的表達(dá)水平。圖3顯示了在轉(zhuǎn)基因植物中通過對(duì)再生轉(zhuǎn)基因植物的免疫檢測(cè)測(cè)量的廣藿香醇合酶(PTS)、二磷酸法呢酯合酶(FPS)和FPS-PTS蛋白的融合蛋白的蛋白表達(dá)水平(westernblotting)。圖4顯示了在用不同構(gòu)造轉(zhuǎn)化的植物的葉子中的廣藿香醇的含量。該比較顯示出高產(chǎn)量的廣藿香醇(>500ng每克的新鮮葉子FW)積聚于表達(dá)轉(zhuǎn)基因HMGR和PTS(8PTS)兩者的植物中。僅表達(dá)轉(zhuǎn)基因PTS(2PTS)的植物通常積聚少于500ng/g的廣藿香醇。圖5顯示了適合于根癌土壤桿菌04.^me/flc/e"s)介導(dǎo)的植物的轉(zhuǎn)化的載體("pBDON")的組成，其中在attp2和attpl序列之間的區(qū)域(cmccdB)可以在體外和位點(diǎn)特異地一皮重組以包埋HMGR、TS和非強(qiáng)制性選擇的PRT。該載體含有植物轉(zhuǎn)化的邊界區(qū)域，啟動(dòng)子，終止子和attpl/2重組序列，其將會(huì)在實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)討論。圖6A和圖6B顯示了輔助載體("pTMON"和"pTDUAL")，其包含位于attp2序列和attp1序列之間的一個(gè)或兩個(gè)基因，分別通過位點(diǎn)特異性重組插入到圖5的pBDON載體中。圖6A顯示了適合一次插入一個(gè)基因到pBDON載體的輔助載體，圖6B顯示了適合于一次插入兩個(gè)基因到pBDON中的輔助載體。所述載體含有啟動(dòng)子，終止子，attB1/2重組體和位置標(biāo)記(place-holder)序歹""基因1"和"基因2",其將會(huì)在實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)討論。圖7顯示了不同植物轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)域的組成。HPT區(qū)域提供了潮霉素抗性，PTS編碼倍半萜(廣藿香醇)合酶，LIS編碼單碎(檸檬烯)合酶，F(xiàn)PS和GPS編碼異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(分別為二磷酸法呢酯合酶和二磷酸香葉酯合酶)。該載體進(jìn)一步含有合適的啟動(dòng)子和終止子序列。圖8以圖解的方式顯示了pBDON載體(圖5)的結(jié)構(gòu)。圖9以圖解的方式顯示了pTMON輔助載體(圖6A)的結(jié)構(gòu)。圖10-1部分和圖10-2部分以圖解的方式顯示了pTDUAL輔助載體(圖6B)的結(jié)構(gòu)。圖11以圖解的方式顯示了轉(zhuǎn)基因植物中用于過量表達(dá)的(A)檸檬烯合酶(LIS)和(B)檸檬烯合酶+二磷酸香葉酯合酶(GPS)表達(dá)載體的構(gòu)造。圖12A和圖12B表明了轉(zhuǎn)基因植物中刪減形式的HMGR的過量表達(dá)協(xié)同PTS和FPS的過量表達(dá)對(duì)廣藿香醇積聚的貢獻(xiàn)。A部分說明在首先用PTS、PTS+FPS或PTS-FPS基因融合設(shè)計(jì)的植物與用刪減的HMGR(AHMGR)基因設(shè)計(jì)的植物之間進(jìn)行的遺傳雜交。B部分顯示出對(duì)后裔植物的廣藿香醇積聚的評(píng)估結(jié)果。通過添加HMGR基因，用在圖表頂部廣藿香醇積聚的平均倍數(shù)改進(jìn)的數(shù)字，將母系中廣藿香醇水平(pg/g鮮重)(用白色表示)以相對(duì)于相應(yīng)的后裔品系(反交-黑色和灰色)顯示出來(lái)。AHMGR母系(P2)沒有積聚任何廣藿香醇。圖13A顯示了生長(zhǎng)于[1-13<:]-葡萄糖中的幼苗通過MEP或MVA路徑生物合成的廣藿香醇的預(yù)測(cè)13C標(biāo)記模式。圖13B比較了通過供給"C-葡萄糖(上圖)植物合成的廣藿香醇的MS母離子和通過對(duì)細(xì)胞質(zhì)(中圖)生物合成或質(zhì)體(下圖)生物合成進(jìn)行工程設(shè)計(jì)的植物從[1-13<:]-葡萄糖合成的廣藿香醇的MS母離子。圖14顯示了用編碼單辟(杵檬烯)合酶(LIS)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的植物中檸檬烯的產(chǎn)量，另外以及在ld和3a抹系中，用編碼二磷酸香葉酯合酶的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的植物中檸檬烯的產(chǎn)量。序列表顯示了在本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物制備中用到的核香酸序列。SEQIDNO:1表示編碼廣藿香醇合酶(PTS)的序列。還可以使用該序列的變體，例如與編碼His-標(biāo)簽的核苷酸序列融合的序列。SEQIDNO:2是編碼禽類二磷酸法呢酯(FPS)的核苷酸序列。SEQIDNO:3表示禽類的與PTS(bp1144-2802)融合的FPS(bpl-1134)核苷酸序列，其包括9bp的連接序列(bpll35-1143)(FPS-PTS)。SEQIDNO:4為編碼來(lái)自于柑橘屬的移除了質(zhì)體定位信號(hào)的檸檬烯合酶(LIS)的核苷酸序列。SEQIDNO:5為編碼來(lái)自于擬南芥(^rfl6k/o;w^Ma//a"fl^》除了質(zhì)體定位信號(hào)的二磷酸香葉酯合酶(GPS)的核苷酸序列。SEQIDNO:6-48是用于本發(fā)明的引物的核苷酸序列。SEQIDNO:49-57分別為用于制備PTS(50-54)和FPS(55-48)的多克隆抗體-抗體的肽序列。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了表達(dá)編碼HMG-CoA還原酶(HMGR)的轉(zhuǎn)基因和編碼薛合酶(TS)的轉(zhuǎn)基因的植物。該植物可為任何植物，優(yōu)選其為適合本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物。優(yōu)選該植物是天生產(chǎn)生大量的萜的植物。例如選自于茄科0So/a"aceae),禾本科(尸oac6fle)或唇形科(丄aw/aceae)的植物。例如選自煙草屬，茄屬，高粱屬，擬南芥屬，苜蓿屬(紫花苜蓿)，棉屬(棉花)，白菜屬(油菜)。優(yōu)選屬于煙草種的植物。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"等，例如"表達(dá)一基因"指的是將基因轉(zhuǎn)錄為mRNA,并且在植物中發(fā)現(xiàn)由被表達(dá)的基因編碼的蛋白的事實(shí)。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"還包括"過量表達(dá)"，后者指的是過量的mRNA、蛋白和/或酶的活性的水平并且高于在非轉(zhuǎn)基因植物中測(cè)量的水平。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"指的是含有從外來(lái)生物體分離的基因的核苷酸序列，該外來(lái)生物體與含有轉(zhuǎn)基因的植物相比，通常為另外類型或種類。術(shù)語(yǔ)"基因"，如存在于詞語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"中，指的是可通過本發(fā)明的植物被翻譯成為具有所述活性的蛋白，例如萜合酶的核苷酸序列。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說，術(shù)語(yǔ)"基因"還可包含非編碼區(qū)，只要表達(dá)于植物中的最終蛋白結(jié)構(gòu)顯示出上述活性。因此，例如編碼一種酶如HMGR的基因，包括轉(zhuǎn)基因，指的是含有對(duì)至少一種多肽的制備有用的信息的核苷酸序列。本發(fā)明還進(jìn)一步提供被轉(zhuǎn)化以含有額外基因的植物，所述基因編碼至少一種HMGR和TS。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化的"，例如轉(zhuǎn)化的植物，指的是植物已經(jīng)進(jìn)行過遺傳設(shè)計(jì)的事實(shí)。"轉(zhuǎn)化的植物"包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的個(gè)體植物的無(wú)性的(植物性的)和有性的來(lái)源的后代。例如當(dāng)后代含有如本發(fā)明所需的額外的基因和/或轉(zhuǎn)基因時(shí)，本發(fā)明還包括通過將已單獨(dú)轉(zhuǎn)化的植物與非轉(zhuǎn)化植物雜交得到的植物。說明書上下文中，詞"包含"被認(rèn)為是"包括，除此之外還包括"的意思，不解釋為"僅由…組成"。術(shù)語(yǔ)被轉(zhuǎn)化以含有"額外基因"的植物指的是這樣一種植物，由于遺傳設(shè)計(jì)其含有插入到植物整個(gè)基因組的任何位置(核、線粒體和質(zhì)體)的新的或外來(lái)的DNA(例如基因)，而在遺傳設(shè)計(jì)之前該位置上不存在該DNA。本發(fā)明的植物含有編碼HMG-CoA還原酶(HMGR)的基因。HMGR是一種能夠催化3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A的還原脫?；饔贸蔀闀趿u戊酸的酶。術(shù)語(yǔ)HMGR包括所有種類的HMGR,特別是種類I和種類II。術(shù)語(yǔ)HMGR包括具有EC序號(hào)EC1.1.1.34的酶。HMGR存在于所有的真核生物體和許多的細(xì)菌中。本發(fā)明不限于編碼特定HMGR的特定核苷酸序列，相反，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說可選擇任何HMGR。因此從文獻(xiàn)或公共數(shù)據(jù)庫(kù)中技術(shù)人員可以選擇由編碼HMGR的任意的生物體分離出來(lái)的任意基因。另外技術(shù)人員例如可從任意生物體中常規(guī)地分離編碼HMGR的新的基因。已知來(lái)自于各種生物體中的多于60個(gè)的編碼HMGR的核苷酸序列已經(jīng)被分離出來(lái)，并且可輕易為技術(shù)人員所用，在此不必給出詳細(xì)的HMGR的列表。優(yōu)選地，HMGR基因?qū)Ρ景l(fā)明的植物是異源物。更優(yōu)選地，其為非植物HMGR,例如使用從動(dòng)物中分離的HMGR。優(yōu)選地，該基因編碼可溶的并且沒有膜結(jié)合的HMGR。通過刪減由核普酸序列編碼的膜結(jié)合區(qū)域和使用編碼HMGR的不含膜結(jié)合區(qū)域的核苷酸序列獲得。另外，編碼缺少膜結(jié)構(gòu)域的HMGR已經(jīng)/人利什曼原蟲(丄"^w"m'"wfly'o"中分離出來(lái)并且也可用于本發(fā)明的目的。優(yōu)選地，編碼HMGR的基因在強(qiáng)的非調(diào)控組成的啟動(dòng)子的控制下。含有編碼HMGR和/或過量表達(dá)HMGR的額外基因的煙草才直物被公開于例如US5,306,862、US5,349,126、US5,365,017、US5,589,619中，所有的這些在此明確地并入作為參考。這些;f直物可以用于本發(fā)明的目的，并且可被轉(zhuǎn)化以含有編碼TS的額外基因的至少一種轉(zhuǎn)基因和/或一拷貝。本發(fā)明的植物含有至少一種編碼TS的基因。TS是催化由給出的前體化合物至碎的形成的酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，TS為單辟合酶和/或倍半碎合酶。單辟合酶是催化以二磷酸香葉酯作為前體的單薛(do-化合物)形成的酶。倍半蔣合酶是能夠催化來(lái)自二磷酸法呢酯的倍半辟(C!5)形成的酶。因此，相對(duì)于通常產(chǎn)生曱羥戊酸的HMGR,本發(fā)明的TS可選自具有不同反應(yīng)產(chǎn)物的不同的酶。因此，術(shù)語(yǔ)TS指的是能夠總共合成數(shù)千種不同萜化合物的多種不同的TS。本發(fā)明的重要的優(yōu)點(diǎn)是寬泛地選擇任何期望的選擇的TS。依據(jù)技術(shù)人員想要生產(chǎn)或在本發(fā)明的植物中積聚的薛，可以自由選擇能夠合成各自的薛的核苷酸序列。本發(fā)明以這樣的方式提供了用于任何感興趣的萜的生產(chǎn)的節(jié)約成本的平臺(tái)。為了說明本發(fā)明的原理，提供了遺傳信息可用的幾個(gè)TS作為例子單辟合酶的例子是檸檬烯合酶(LS)(Ohara爭(zhēng)，2003)以及S-里哪醇合酶(LIS)(Lucker夢(mèng)2001)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，TS為倍半萜合酶。已知到目前為止已經(jīng)公開了數(shù)千種倍半薛，相應(yīng)數(shù)量的倍半萜合酶可用作一個(gè)庫(kù)，從其中可以選擇編碼倍半碎合酶的基因。因此，編碼倍半薛合酶的基因可選自公共可用的數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)或者選自技術(shù)人員可輕易地由常規(guī)的試驗(yàn)和公知的分離步驟分離的目前未發(fā)現(xiàn)的基因。例如TS能夠合成卩-石竹烯、a-律草烯、大根香葉烯A、大根香葉烯B、大根香葉烯C、大根香葉烯D、朱欒倍半萜、馬兜鈴烯、巖蘭螺旋二烯(vetispiradiene)、廣藿香醇、蓽澄茄醇、y-姜黃烯、(-)-大根香葉烯D、(+)-大根香葉烯D、二環(huán)-大根香葉烯和/或8-杜+>烯合酶。一些能夠合成上述倍半碎的TS的基因公開于國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB/2004/003836和WO2004/031376中。例如可由TS合成的碎為香料、調(diào)味料、藥物、殺蟲劑、殺真菌劑和/或除草劑。優(yōu)選是香料。"萜"是環(huán)狀或無(wú)環(huán)的基于或由異戊二烯單元(CsH8)組成的烴。對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"萜"、"單萜"、"二萜，，和/或"倍半萜"還包括薛衍生物，例如萜類化合物，其包括經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)步驟的羥基化作用、異構(gòu)化作用、氧化還原、二曱基化作用或酰化作用等的官能化的烴。編碼HMGR和TS的基因例如可以編碼具有HMGR和TS兩種活性的融合蛋白的單一基因的形式存在。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的植物還表達(dá)編碼異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(PRT)的轉(zhuǎn)基因，或者被轉(zhuǎn)化以含有編碼PRT的額外的基因。還可稱為聚異戊二烯二磷酸酯合酶或聚異戊二烯焦磷酸酯合酶的異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(PRT)是催化烷基化步驟的酶，該酶包括二磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)和一個(gè)或多個(gè)IPP殘基，例如二磷酸法呢酯(FPP)、二磷酸香葉酯(GPP)或者其它。術(shù)語(yǔ)PRT還包括能夠催化一個(gè)或一系列產(chǎn)生用于各種萜類化合物家族的聚異戊二烯二磷酸酯前體的反應(yīng)的一種或幾種不同的酶。因此，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說，編碼PRT的至少一種核苷酸序列包括編碼具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽的序列，該多肽包含一元蛋白、二元蛋白、三元蛋白、四元蛋白和寡聚蛋白的相同或不同混合物。具體地，PRT可為單體、異型二聚體和/或同型二聚體。來(lái)自于薄荷(MeW/mp/戶er"a)的油腺的二磷酸香葉酯合酶可被作為例子用于本發(fā)明包含的特定PRT的復(fù)雜遺傳生物體，因?yàn)樵撁敢呀?jīng)被純化并且揭示其為異型二聚體，并具有從IPP和DMAPP前體生產(chǎn)GPP所需的兩種亞單位。優(yōu)選地，PRT包括例如在EC序號(hào)EC2.5.1下分類的酶。在優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種編碼PRT的基因?yàn)槎姿嵯闳~酯(GPP)合酶和/或二磷酸法呢酯(FPP)。GPP和FPP分別為單辟和4咅半辟的前體。也稱為二曱基烯丙基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶的二磷酸香葉酯合酶(GPS)是PRT的實(shí)例。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，PRT是二磷酸法呢酯合酶(FPS)。FPS是可用IPP催化如二磷酸香葉酯(GPP)的縮合以產(chǎn)生二磷酸法呢酯的酶。優(yōu)選地，F(xiàn)PS能夠用二磷酸烯丙酯和二磷酸二曱基烯丙酯(DMAPP)然后用合成的二磷酸香葉酯(GPP)來(lái)催化二酸異戊烯酯(IPP)的連續(xù)縮合，得到最終的產(chǎn)物二磷酸法呢酯。優(yōu)選地，在本發(fā)明植物中選擇基因PRT用于獲得所選的TS的前體。例如，當(dāng)該植物含有編碼倍半薛合酶的額外基因時(shí)，它進(jìn)一步包含編碼二磷酸法呢酯合酶的基因。與編碼HMGR和TS的基因相似，編碼PRT的基因也是公共可用的并且可由技術(shù)人員從各種來(lái)源中選擇。獲得編碼HMGR、PRT和/或TS的核苦酸序列的公共可用數(shù)據(jù)庫(kù)舉例來(lái)說有歐洲生物信息研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute)的數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html),EXPASY數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.expasy.org/enzyme/)NCBI凄史凈居庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)和許多其它數(shù)據(jù)庫(kù)。僅為了說明為技術(shù)人員所用的可用于本發(fā)明目的FPS的多種可能性，可以引用從小蠹蟲(/pp/mV(NCBIAccessionnumber(AN):AY953508.l)分離出來(lái)的二磷酸香葉酯合酶、從弧菌(K/6Wo/^c/ze";;(NCBIAN:YP203660)分離出來(lái)的二磷酸法呢酯合酶和由Tarshis等(1994)報(bào)道的禽類二磷酸法呢酯合酶。當(dāng)然也可從任何數(shù)據(jù)庫(kù)或來(lái)源選擇其它PRT。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，額外基因的產(chǎn)物直接進(jìn)入到植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。通過各種方法基因產(chǎn)物直接進(jìn)入到植物的細(xì)胞溶膠中。例如植物被轉(zhuǎn)化以在核染色體中含有該基因的拷貝，所述基因不含任何質(zhì)體定位序列和/或任何其它細(xì)胞器目標(biāo)信息。例如，對(duì)于多種通常含有質(zhì)體定位序列的已知單辟合酶來(lái)說這是相關(guān)的，它們的活性的主要位點(diǎn)為質(zhì)體。在這種情況下，質(zhì)體定位序列在用其轉(zhuǎn)化植物之前應(yīng)當(dāng)從編碼TS和/或PRT的額外基因和/或轉(zhuǎn)基因中移除。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，基因和/或轉(zhuǎn)基因在植物的核中表達(dá)，它們優(yōu)選是部分植物染色體。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物中由額外基因和/或轉(zhuǎn)基因編碼的基因產(chǎn)物(TS、HMGR,非強(qiáng)制性選擇的PTR)是有活性的。優(yōu)選地，它們?cè)隗w內(nèi)和/或體外都有活性?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)檢測(cè)來(lái)確定轉(zhuǎn)化的植物中酶的活性。在轉(zhuǎn)化的植物中定量檢測(cè)HMGR活性的嘗試公開于US5,349,126,實(shí)施例2,參考Chappell等，PlantPhysiol"85:469-473(1987)中提到的方法。WO04/031376實(shí)施例4中公開了倍半碎合酶的酶功能檢測(cè)。上述文獻(xiàn)中公開的兩種檢測(cè)方法在此并入作為參考。評(píng)估PRT活性的檢測(cè)也可在文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)與天然的未轉(zhuǎn)化的植物相比，本發(fā)明的植物積聚了至少1.2倍的可由轉(zhuǎn)基因和/或額外基因編碼的TS合成的薛。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的植物積聚了至少1.5倍、2倍、3倍更優(yōu)選至少4倍和最優(yōu)選至少6倍的特定的辟。根據(jù)另外的本發(fā)明的實(shí)施方式，轉(zhuǎn)化的植物積聚至少400ng/每克新鮮葉子的可由轉(zhuǎn)基因和/或額外基因編碼的TS合成的萜。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的植物積聚至少500ng,更優(yōu)選至少800ng，甚至更優(yōu)選至少1000ng，還更優(yōu)選至少2000ng,甚至更優(yōu)選至少5000ng,還更優(yōu)選7000ng和另外更優(yōu)選至少8pg的存在于轉(zhuǎn)化植物中的可由TS重組體合成的特定辟。最優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的植物積聚每克鮮葉子中至少10000ng或甚至更多的特定辟。例如，轉(zhuǎn)化的植物積聚了每克新鮮葉子中2~16pg,優(yōu)選412pg的萜。特定萜的量還可用干物質(zhì)的重量來(lái)表示。在這種情況下，干物質(zhì)植物材料(特別是葉子)為對(duì)應(yīng)于鮮重的約10%。因此，每克干葉子中積聚至少4、5、8、10、20、50、70或100pg的辟。如果天然的未轉(zhuǎn)化的植物已經(jīng)產(chǎn)生了可由TS合成的特定的萜，對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物有效的量被加到天然存在于非轉(zhuǎn)化植物中的特定萜的量中。為了確定本發(fā)明植物中特定碎的含量，產(chǎn)生或積聚萜的任何植物器官可以作為參考。優(yōu)選地，分別取自轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的植物上的具有相同年齡的綠色葉子(優(yōu)選成熟的葉片)用于比較。優(yōu)選根據(jù)實(shí)施例中列出的"碎分析，，的流程進(jìn)行分析。優(yōu)選在新鮮葉子從植物上切下后直接進(jìn)行分析。葉子可以在收獲后冷凍并且在冷凍狀態(tài)進(jìn)行分析。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物為轉(zhuǎn)化的珊西煙草WWawfl/aZ)oc訓(xùn)cvXfl^(j，其以樣本名稱"8hsPTS-10,，保藏在ATCC并且ATCC的序號(hào)為ATCCPTA-6706。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的植物可在選擇的野生型的基因中含有敲除、缺失或其它形式的有害突變，該基因可以參與到萜生物合成路徑中適合使碳流動(dòng)從傳統(tǒng)的萜向本發(fā)明的TS偏離。優(yōu)選地，這些傳統(tǒng)的其它辟的路徑是下游調(diào)控的。例如，本發(fā)明的植物可以具有一個(gè)或多個(gè)非還原或還原的功能基因，該基因位于生成甾醇、聚類戊二烯(polyprenoid)、植醇和類胡蘿卜素的FPP、GPP和/或GGPP合酶編碼基因的下游。因此，石友流可更加有效地向特定萜的合成流動(dòng)。本發(fā)明提供了含有編碼至少一種PRT和/或至少一種TS的核苷酸序列的載體。優(yōu)選地，該載體還含有含HMGR編碼基因的核苷酸序列。優(yōu)選地，含有編碼選自由HMGR、TS和/或PRT組成的組中的一種、兩種或所有的核苷酸序列的載體不含連接到HMGR、TS和/或PRT上的質(zhì)體定位序列。優(yōu)選地，載體進(jìn)一步含有啟動(dòng)子和終止子序列，優(yōu)選分別位于包括質(zhì)體定位序列和HMGR、TS和/或PRT的基因的核苷酸序列的上游和下游。優(yōu)選地，該載體含有強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的商業(yè)可用的實(shí)例為FMV(玄參花葉病毒)、ACT2(激動(dòng)蛋白)、MAS(甘露石成合酶)和NOS啟動(dòng)子。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子的選擇與未轉(zhuǎn)化宿主植物的控制和/或反饋調(diào)控機(jī)制無(wú)關(guān)。優(yōu)選地，重組體HMGR和TS具有上游啟動(dòng)序列。更優(yōu)選地，它們具有不同的啟動(dòng)序列。非強(qiáng)制性選擇地，該載體可進(jìn)一步含有適合于抗體結(jié)合的標(biāo)簽，例^口His-才示簽禾口/或myc才示簽。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體還含有適合于選擇轉(zhuǎn)化的植物的標(biāo)記。例如，該載體可含有賦予潮霉素或卡那霉素抗性的基因或適合于選擇已成功轉(zhuǎn)化的植物的其它種類的標(biāo)記。優(yōu)選地，為了促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因向植物的核基因組的轉(zhuǎn)化和整合，本發(fā)明的載體進(jìn)一步含有與HMGR、TS和非強(qiáng)制性選擇的PRT側(cè)面相連并且包括非強(qiáng)制性選擇的啟動(dòng)子、終止子和/或標(biāo)簽序列以及植物抗性標(biāo)記的左側(cè)和右側(cè)的T-DNA邊界區(qū)域。因此，本發(fā)明的載體優(yōu)選含有編碼HMGR、PRT和/或TS的結(jié)構(gòu)基因和選擇轉(zhuǎn)化的植物用的標(biāo)記，兩側(cè)連接到使其易于插入到植物基因組的左側(cè)和右側(cè)邊界區(qū)域。優(yōu)選地，該載體在左側(cè)和右側(cè)的邊界區(qū)域之外還含有用于選擇陽(yáng)性細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記，該轉(zhuǎn)化體用于克隆含有載體的細(xì)菌或用于植物的轉(zhuǎn)化(根癌土壤桿菌)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是質(zhì)粒，其保藏在ATCC,樣本編號(hào)為"pBhsPTS"和ATCC序號(hào)為PTA-6707。一方面，本發(fā)明涉及制備轉(zhuǎn)化的植物的方法，該方法包含將植物材料轉(zhuǎn)化使其含有額外基因(所述額外基因編碼HMGR和TS)和從所述植物材料中再生出轉(zhuǎn)化的植物的步驟。對(duì)于轉(zhuǎn)化植物材料的步驟，用本發(fā)明的基因來(lái)轉(zhuǎn)化植物的任何方法都可使用。例如，當(dāng)用一定的膜活性試劑或用電穿孔處理時(shí)，已經(jīng)除去保護(hù)細(xì)胞壁的植物細(xì)胞吸收純的DNA。還可使用非常細(xì)的玻璃針將DNA微量注射到目標(biāo)植物細(xì)胞中。最近新開發(fā)的植物轉(zhuǎn)化的方法——生物射彈方法——包括將用DNA涂覆的非常小的鶴或金顆粒用靜電脈沖、空氣壓力或火藥引爆加速進(jìn)入到細(xì)胞中。本發(fā)明人用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)獲得了很好的結(jié)果。優(yōu)選地，使用含有至少一種本發(fā)明的結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)體結(jié)構(gòu)(載體)，其與允許結(jié)構(gòu)基因整合到植物的核染色體DNA中的核芬酸序列側(cè)面相連，例如上面描述的那些。因此，在該植物的實(shí)例，本發(fā)明的方法或應(yīng)用中，編碼HMGR、TS和PRT(如果存在)的基因?yàn)楹嘶?，?yōu)選不含質(zhì)體定位序列。這些基因優(yōu)選存在于本發(fā)明植物的核染色體中。用DNA結(jié)構(gòu)(例如包含編碼HMGR、TS和/或PRT的基因)進(jìn)行的植物材料的轉(zhuǎn)化可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施，見Schardl等的Gene(1987)6:61:1-11;Berger等的ProcNatlAcadSciUSA(1989)86:8402-8406;和Horsch等的Science(1985)27:1229-1231，后面的方法描述了"葉盤方法，，，其特別適合轉(zhuǎn)化煙草。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含從轉(zhuǎn)化的植物材料再生出轉(zhuǎn)化的植物的步驟。技術(shù)人員通常應(yīng)用從轉(zhuǎn)化的植物材料再生完整植物的方法。例如，可使用Horsch等(1985)公開的方法。通常，通過將含有根癌土壤桿菌的DNA插入而培養(yǎng)的葉子的部分可以在選擇的介質(zhì)中生長(zhǎng)直到出現(xiàn)愈合組織和再生植物的枝條。大小為l~3cm的枝條可以被轉(zhuǎn)移到含有抗生素的T-介質(zhì)(Schardl,1987)中刺激根的生長(zhǎng)。一旦建立起根系統(tǒng)，幼苗可以轉(zhuǎn)移到商業(yè)可得的盆栽土中并在溫室中繁育。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，制備轉(zhuǎn)化的植物的方法進(jìn)一步包含培育轉(zhuǎn)化的植物的步驟。一方面，本發(fā)明提供了制備轉(zhuǎn)化的植物的另一種方法，該方法包含步驟用含有編碼TS的至少一種基因的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化第一植物材料，用含有編碼HMGR的至少一種基因的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化第二植物材料，從第一和第二轉(zhuǎn)化的植物材料中分別再生出第一和第二植物，將第一植物和第二植物雜交并且從植物雜交獲得的后代中選擇含有編碼TS和編碼HMGR的基因兩者的植物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，含有編碼TS或其中基因結(jié)構(gòu)含有編碼HMGR的基因的DNA結(jié)構(gòu)還含有PRT。上述方法是獲得本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物的另外一種方法，其中不同的植物材料分別用編碼HMGR或TS的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的植物被再生為僅含有至少兩種重組基因中的一種。在以下的步驟中，將含有重組的外源和/或轉(zhuǎn)基因的HMGRDNA的植物與含有重組的外源和/或轉(zhuǎn)基因的TSDNA的植物雜交獲得的有性來(lái)源的后代。優(yōu)選地，雜交指的是遺傳雜交，也稱為孟德爾雜交。其通常通過異花授粉來(lái)實(shí)現(xiàn)。在后代中，選擇表達(dá)重組體PRT以及TS兩者的個(gè)體。例如，已過量表達(dá)HMGR的才直物(例3口/>開于US5306862、US5349126、US5365017和US5589619的那些)可與被轉(zhuǎn)化以含有編碼TS的轉(zhuǎn)基因的植物雜交。以相同的方法(孟德爾雜交)，編碼PRT的轉(zhuǎn)基因可被引入。因此，在實(shí)施方式中，該方法還提供了用被轉(zhuǎn)化以含有編碼PRT的基因的植物與第一和/或第二再生植物雜交或與通過雜交第一或第二再生植物獲得的植物雜交的步驟?；蛘?，編碼PRT的額外的轉(zhuǎn)基因可通過用含有編碼PRT的基因的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化已經(jīng)過量表達(dá)HMGR的植物和/或含有額外基因的植物和/或表達(dá)編碼TS的轉(zhuǎn)基因的植物被引入。本發(fā)明的用于制備轉(zhuǎn)化的植物的方法的目的為在轉(zhuǎn)化的植物中獲得期望的萜的積聚。因此轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選用于篩選植物中積聚大量的辟的轉(zhuǎn)化抹。制備轉(zhuǎn)化的植物的方法的步驟因此同樣適合作為改變植物中碎含量的方法，后一種方法代表本發(fā)明另外的優(yōu)選的實(shí)施方式。同樣地，上述公開的方法和植物也說明了本發(fā)明的一個(gè)方面，即，編碼HMGR和/或TS的基因和非強(qiáng)制性選擇的編碼PRT的至少一種另外的基因在具有改變的辟含量、優(yōu)選增加的特定辟含量的植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)萜的方法，該方法包含將萜從本發(fā)明的植物中或從制備轉(zhuǎn)化的植物的方法中獲得的植物中分離的步驟。轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選可以足夠高的產(chǎn)率和/或足夠多的量被培養(yǎng)和收獲，使得該方法在經(jīng)濟(jì)上有利可圖。本發(fā)明的特定的萜可由任何在現(xiàn)有技術(shù)中使用的方法(包括有機(jī)溶劑萃取或蒸餾)來(lái)分離并且可以通過氣相色語(yǔ)(GC)-質(zhì)譜(MS)來(lái)定量和/或鑒定。實(shí)施例以下的實(shí)施例目的是說明本發(fā)明而非限定其范圍。實(shí)施例的方法和流程通常根據(jù)特定材料或試劑盒的制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，或者遵從Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987)完善建立起來(lái)的流程進(jìn)4亍。使用到的所有的引物在隨附的序列表中給出。對(duì)于一些方法或流程步驟，參考文獻(xiàn)(以下將更加詳細(xì)地列舉)在此并入作為參考。實(shí)施例1:植物材料的選擇按照Chappell等(1995)牙口專利US5306862、US5349126、US5365017中描述的方法培養(yǎng)出含有被截?cái)嗟膫}(cāng)鼠羥曱基-戊二酰基-輔酶A還原酶基因的"珊西"煙草品系的純合品系(此后指的是14-8)和缺乏該轉(zhuǎn)基因的F2分離同胞系(此后指的是14-2)?？傊?，首先由Chin等(1984)特征化的倉(cāng)鼠基因通過除去核苷酸28~1023進(jìn)行修飾以獲得該基因的截?cái)嘈问剑傅氖茿-227HMGR。分離截?cái)嗟腍MGRcDNA的BamHl/Sstl片段并將其插入中間體質(zhì)體載體pKYLX61中，并且將該構(gòu)造的EcoRl/Clal片段隨后插入到相應(yīng)的pKYLX71位點(diǎn)以產(chǎn)生pKYLX71-截?cái)嗟腍MGR基因結(jié)構(gòu)中。Schardl等(1987)開發(fā)了Ti-質(zhì)粒系列pKYLX61和pKYLX71。使用標(biāo)準(zhǔn)的三親抹交配步驟(Schardl等，1987)將pKYLX71-HMGR質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到含有卸甲的Ti質(zhì)粒GV3850的根癌土壤桿菌中。用珊西煙草的葉盤作為植物材料和用攜帶pKYLX71-HMGR結(jié)構(gòu)的根癌土壤桿菌接種并且使用Schardl等(1987)和Horsch等(1985)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化和再生步驟再生轉(zhuǎn)基因植物。將原始轉(zhuǎn)化的和再生的植物(RO代)進(jìn)行種植并使其自花授粉隨后收集種子(R1代)。在標(biāo)準(zhǔn)的溫室條件下以單植抹種植Rl種子，使其自花授粉并收集R2種子代。隨后篩選存在HMGR轉(zhuǎn)基因的R2種子代。存在HMGR轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的篩選最初基于卡那霉素抗性標(biāo)記的存在，該標(biāo)記被設(shè)計(jì)到植物中作為pKYLX71-HMGR結(jié)構(gòu)的一部分(Chappell等，1995)。被置于含有100mg的卡那霉素/L萌發(fā)培養(yǎng)基中的種子劃分為顯示出光致褪色的發(fā)芽的幼苗(所有的白色幼苗，它們?nèi)狈敲顾乜剐詷?biāo)記，因此純合品系缺乏轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu))和所有綠色幼苗(包含卡那霉素抗性標(biāo)記的綠色幼苗，因此純合品系含有轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu))。隨后將來(lái)自鑒別出的品系的種子在溫室中(不含卡那霉素選擇)繁育并且通過甾醇的化學(xué)分析(Chappell等，1995)篩選設(shè)計(jì)的HMGR結(jié)構(gòu)的存在。品系14-8顯示出為對(duì)照植物2-10倍的甾醇水平，并且所有的幼苗在卡那霉素存在下生長(zhǎng)正常，而品系14-2含有的甾醇水平相當(dāng)于非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物并且在卡那霉素存在下發(fā)育的幼苗全部都是光致褪色的白色。植物品系14-8(HMGR過量表達(dá))和14-2(對(duì)照)被用于全部的之后的轉(zhuǎn)化工作中。實(shí)施例2-5:重組體的構(gòu)建和植物轉(zhuǎn)化載體選擇潮霉素選擇標(biāo)記(Hajdukiewicz等，1994)用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物的選擇標(biāo)記。新的載體用如Hartley等(2000)所述的合適的重組體克隆位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)施例2:pBDON載體的形成圖8中，pBI101載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)用限制性酶Sphl和Sstl消化并且通過瓊脂糖凝膠純化(Sambrook等，1989)來(lái)分離對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒載體(不包括RB邊界和NPTII基因盒)的DNA片段(l)。同時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件以引物Attpl-SstI-FW和Attp2-Sphl-RV將包括ccdb基因和氯霉素抗性基因的attp重組體盒/人pDON221載體(Invitrogen，Carlsbad,CA)中擴(kuò)增出來(lái)(2)。PCR擴(kuò)增的DNA片段用Sphl/Sstl酶切，凝膠純化并連接到相應(yīng)的上述相似的消化的pBI101載體的相應(yīng)位點(diǎn)上以生產(chǎn)中間體pBattp載體(3)。潮霉素基因盒使用兩步法制備。首先用PCR引物HPT-NotI-FD和HPT-Xbal-RV將潮霉素基因(HPT)和CaUTR(終止序列)從pCAMBIA1301(Cambia,Canberra,AU)載體中通過PCR擴(kuò)增出來(lái)，并且將T/A克隆(直接從PCR反應(yīng)混合物通過T叫擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物)到pT7Blue載體(Novagen,Madison，WI)中以生產(chǎn)pTHPT(4)。^吏用PCR引物TB-SphI-FD和TB-NotI-RV將右邊界(RB)和NOS-啟動(dòng)子(P-NOS)區(qū)域從pBI101中擴(kuò)增出來(lái)(5)。然后將T/A克隆到pT7Blue載體中獲得載體pTRBP(6)。通過用Notl/Xbal消化將潮霉素抗性基因盒從載體pTHPT中釋放出來(lái)(7),并且將其克隆到同樣消化后的pTRBP載體中，得到載體pTRBPHPTT(8)。然后使用引物TB-Sphl-FD和HPT-SphI-R將NOS啟動(dòng)子-潮霉素-CaUTR盒從該載體中擴(kuò)增出來(lái)(9)。擴(kuò)增產(chǎn)物用Sphl消化并連接到pBattp的相應(yīng)位點(diǎn)獲得pBDON載體(IO)。pBDONTi-載體(圖5,圖9)含有用于選擇細(xì)菌的NPTII選擇標(biāo)記(在T-DNA區(qū)域之外)和用于植物轉(zhuǎn)化選擇的潮霉素基因(HPT)。因此植入的attp盒為使與attB位點(diǎn)側(cè)面相連的目標(biāo)基因結(jié)構(gòu)容易地插入到pBDON載體中。具有attB位點(diǎn)的輔助載體的形成根據(jù)在圖9和圖10中給出的流程構(gòu)建兩個(gè)不同的attB輔助載體。一個(gè)用于單一基因插入(pTMON,圖6A),另一個(gè)用于兩個(gè)目標(biāo)基因插入pBDON載體(pTDUAL,圖6B)。實(shí)施例3:pTMON載體的產(chǎn)生(圖9)首先通過用含有Ndel限制位點(diǎn)和植入到引物CSMV陽(yáng)ATTB1陽(yáng)SGFI-FD的attBl序列的正向PCR引物和含有EcoRl位點(diǎn)的反向引物CSMV-ECORI-RV將木薯花葉病毒(Pcv)啟動(dòng)子從修改的pBI101載體中擴(kuò)增出來(lái)，從而構(gòu)建pTMON載體(ll)。將PCR片段T/A克隆到pGem-Teasy載體(Promega,Madison,WI)中(12),然后作為Ndel/EcoRl消化產(chǎn)物被再次分離。將分離的消化產(chǎn)物(13)連接到pECVS載體(含有非強(qiáng)制性選擇的占位基因("基因1")、NCBI檢索號(hào)為CQ813508的pET28a衍生物)的相應(yīng)的限制位點(diǎn)以產(chǎn)生pEPCVS(14)。同時(shí)，4吏用正向引物Tnos-XhoI-FW和反向引物Tnos-attB2-RV擴(kuò)增pBIlOl的NOS終止子(TNOS)序列，其在TNOS序列的下游合并了attB2重組體位點(diǎn)。PCR片段被T/A克隆到pGEM-Teasy載體中，獲得pTTNOS載體(15)。隨后將pEPCVS的Ndel/Xhol消化片段(16)連接到pTTNOS的相應(yīng)位點(diǎn)來(lái)產(chǎn)生pTMON(17)(圖6A，圖9)。構(gòu)建pTMON載體用于在木薯花葉病毒啟動(dòng)子(Pcv)(Frey等2001)之后插入單一的目標(biāo)基因并且隨后為NOS終止子序列。在某些情況下，通過EcoRl消化而將His-標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)到pTMON中，之后用引物對(duì)His-EcoF和His-EcoR進(jìn)行接頭/連接。隨后的突變被設(shè)計(jì)為廢除His-標(biāo)簽開放閱讀框序列，而保留附近的Ascl和EcoRl限制性位點(diǎn)。使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件用引物mHisPTS-F和mHisPTS-R完成該操作并且將PCR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中以恢復(fù)變異的pTMON質(zhì)粒。實(shí)施例4:pTDUAL載體的生成(圖101和II)用多步法構(gòu)建pTDUAL載體(圖10,部分1和2)。首先，使用引物PCaMV-XbaI-FW和PCaMV-SpeI-RV將花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(Pca)(Benfy等1990)從pBI121載體(Invitrogen)中擴(kuò)增出來(lái)，并且T/A克隆到pT7Blue載體中(18)。隨后該啟動(dòng)子元件從該載體中通過Xbal和Spel的消化被釋放出來(lái)(19)。同時(shí)，用引物7120D-Spel-FW和7120D-Kpnl-RV將非強(qiáng)制性選擇的占位基因("基因2")從由激發(fā)子處理的細(xì)胞培養(yǎng)物(PCT/US06/02265)獲得的黑萊菪(/^c^cya/77Msww〃cws)的cDNA庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)，P逭后用Spel/Kpnl消化并連4^到pT7Blue載體的相應(yīng)的位點(diǎn)獲得pTHPO(20)。然后用Xbal/Spel消化pTHPO并且與同樣釋放自pTPCa的CaMV啟動(dòng)子片段連接到一起得到pTPHPO(21)。在構(gòu)建pTPHPO的同時(shí)，^f吏用引物Tnos-KpnI-FW和Tnos-attB2-RV3將NOS終止子序列從pGTNOS載體中擴(kuò)增出來(lái)并且T/A克隆到pGem-Teasy載體中(22),之后用Kpnl和Sacl消化pGTNOSK質(zhì)粒對(duì)該片段進(jìn)行重分離(23)。然后將該片斷克隆到pTPHPO的相應(yīng)限制性位點(diǎn)獲得pTDUAL載體(圖10部分1)(24)。構(gòu)建pTDUAL載體的最終步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR條件擴(kuò)增橫跨attB1位點(diǎn)到插入的薛合酶基因下游的nos終止子序列的pTMON載體的片段(25)。用引物CsMV-attBl-SgfI-FD和TNOS-XbaI-RV獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中同樣在該片斷上設(shè)計(jì)了末端的Sphl和Xbal位點(diǎn)。消化該P(yáng)CR片段并連接到pT7Blue載體相應(yīng)的Sphl/Xbal位點(diǎn)產(chǎn)生pTPCVST(26)。最后，將來(lái)自pTPHPOT的Xbal到Sacl的消化片l殳(27)連接到pTPCVST的相應(yīng)位點(diǎn)以產(chǎn)生pTDUAL載體(27),其允許在強(qiáng)的組成型表達(dá)啟動(dòng)子下游的兩個(gè)基因序列的插入(圖10部分2)。消化pTDUAL載體(圖6B)使兩個(gè)基因插入到轉(zhuǎn)基因植物中。第一基因的表達(dá)由木薯花葉病毒啟動(dòng)子(Frey等2001)來(lái)控制，而第二基因的表達(dá)由花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(Benfey等1990)來(lái)控制。類似于上述對(duì)pTMON結(jié)構(gòu)所做的修改，在某些情況下His-標(biāo)簽序列通過用EcoRl消化被設(shè)計(jì)到pTDUAL載體中，之后用引物對(duì)His-EcoF和His-EcoR進(jìn)行接頭/連接。同樣設(shè)計(jì)隨后的突變i文棄His-標(biāo)簽開放閱讀框序列，而保留附近的Asc1和EcoR1限制位點(diǎn)。使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件用引物mHisPTS-F和mHisPTS-R完成這一步驟，并將PCR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中以恢復(fù)變異的pTDUAL質(zhì)粒。實(shí)施例5:廣藿香醇合酶(PTS)和廣藿香醇合酶+二磷酸法呢酯合酶(FPP)的過量表達(dá)載體的構(gòu)建PTS和PTS+FPS過量表達(dá)載體的產(chǎn)生可通過與pTMON、pTDUAL和pBDON載體相連的合適的重組體克隆位點(diǎn)而得到4艮大的促進(jìn)。分別使用引物對(duì)PTS-AscF和PTS-XhoR,或FPP-SpeFW和FPP國(guó)KpnRV擴(kuò)增PTS(WO2004/031376)或FPS基因(Tarshis等1994),用Ascl/Xho1或Spel/Kpnl消化并連4妄到pTMON或pTDUAL載體的相應(yīng)位點(diǎn)上。通過用引物FPS-AscF和FPS-AscR擴(kuò)增FPS基因，用Ascl消化得到的PCR片段并將該片段連接到pTMON和pTDUAL載體中的PTS基因相應(yīng)的Ascl位點(diǎn)的5'端來(lái)產(chǎn)生FPS-PTS基因融合。然后通過標(biāo)準(zhǔn)的重組體克隆(Hartley等2000)將得到的質(zhì)4立用于j吏相應(yīng)的PTS、PTS+FPS和FPS-PTS基因盒進(jìn)入到pBDON載體中以獲得Ti-質(zhì)粒的家族(圖7)。與圖7的第一基因盒相應(yīng)的、含有編碼具有His-標(biāo)簽的基因的PTS的質(zhì)粒pBDON載體以保藏號(hào)ATCCPTA-6707保藏。實(shí)施例6:植物的轉(zhuǎn)化和再生通過電穿孔(Mersereau等，1990)和為卡那霉素抗性而選擇的轉(zhuǎn)化抹將單獨(dú)的pBDON載體的結(jié)構(gòu)(圖5和圖7)轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌菌抹GV3850中。通過限制性DNA測(cè)序并且隨后在含有100mg/L卡那霉素的50mL的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來(lái)為轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)所選擇的菌落。通過離心的方法將具有等于0.6~0.8的OD6oo的過夜培養(yǎng)物濃縮，重新懸浮于30mL的新鮮LB培養(yǎng)基(不含抗生素)中并且用于接種上述的葉子外植體(Chappell等，1995;Horsch等，1985)。簡(jiǎn)言之，來(lái)自于在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)植物的葉子被置于根癌土壤桿菌培養(yǎng)物中，切成約lcm的段，并且葉子段覆于非選擇性培養(yǎng)基板(Murashige和Skoog,1962)上。3天之后，將葉子外植體轉(zhuǎn)移到含有15pg/mL的潮霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)和500pg/mL的頭孢漆將(Bioworld,Dublin,OH)的培養(yǎng)基板上，隨后每周轉(zhuǎn)移到相同的選擇培養(yǎng)基中直至愈合組織和再生的植物的枝條變得明顯。然后將大小為13cm的枝條轉(zhuǎn)移到T-培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)(含有相同的抗生素)上以刺激根的發(fā)育。一旦根系統(tǒng)建立起來(lái)，幼苗被轉(zhuǎn)移到商業(yè)可得的盆栽土中在溫室中培育。實(shí)施例7:辟的分4斤通過GC-MS分析對(duì)由實(shí)施例6獲得的轉(zhuǎn)化植物葉子材料提取的倍半碎進(jìn)行鑒定和量化。200500mg的冷凍的葉子樣本于液氮中磨碎，然后用3mL的含有200ng的a-柏木烯作為外標(biāo)的正己烷乙酸乙酯(v/v85:15)的混合物萃取，通過將樣本在硅土柱中用相同的85:15的乙酸乙酯正己烷的混合物洗提對(duì)提取物進(jìn)行部分純化。在氮?dú)饬飨聦⑾刺嵛餄饪s至30|iL,然后由GC-MS(TakahashiS,2005)將lpL的等份樣本進(jìn)行分析。將樣本注射到裝有RestecRtx-5毛細(xì)柱(30mX0.32mm,0.25,相厚度)的TraceGC-MS(The畫Fi皿igan,Somerset,NJ)中，以無(wú)分流模式運(yùn)4亍，注射溫度為250°C并且最初的爐溫為70。C持續(xù)一分鐘，然后每分鐘4'C升至230°C。在70eV時(shí)記錄質(zhì)譜，從35300原子質(zhì)量單位掃描并且與庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)(NIST庫(kù))和可信標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比用于檢驗(yàn)。對(duì)廣藿香醇量的評(píng)估是基于由檢測(cè)廣藿香醇和內(nèi)標(biāo)的由總離子監(jiān)測(cè)獲得的峰值面積的比率。a-柏木烯和廣藿香醇的應(yīng)答因子由共注射相同量的相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算并且得到的校正因子包括在計(jì)算之內(nèi)。使用相同的方法量化檸檬烯和其它萜分子。圖1顯示了對(duì)照煙草品系(WT)和對(duì)于倍半辟含量用HMGR和PTS基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的品系的辟分析的結(jié)果。在圖1中用HisPTS基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的HMGR過量表達(dá)品系的總離子色譜(圖1A)與對(duì)照植物(僅用HMGR轉(zhuǎn)化)(圖1B)的總離子色譜進(jìn)行比較。通過可用的標(biāo)準(zhǔn)與它們的質(zhì)子光譜比較或通過在NIST庫(kù)中可用的光譜配色來(lái)識(shí)別峰。例如，峰12(C)的MS與可信的廣藿香醇(D)進(jìn)行比較。其它的峰的鑒定l-P-廣藿香烯；2-p-欖香烯；3-ot-柏木烯(內(nèi)標(biāo))；4-石竹烯；5-a-愈創(chuàng)木烯；6-未知；7-a-廣藿香烯；8-賽切烯；9-未知，10-5-愈創(chuàng)木烯；ll-藍(lán)桉醇；和12-廣藿香醇。圖1為GC-MC分析的結(jié)果并且說明了，用編碼感興趣的特定的、細(xì)胞溶膠定位的辟(廣藿香醇)合酶和HMGR的基因特定轉(zhuǎn)化的植物(A)(除由相同的廣藿香醇合酶合成的其它辟之外)具有與野生型(B)相比改變的辟含量和過量積聚的廣藿香醇。圖4是用由編碼PTS的重組體基因轉(zhuǎn)化的植物的葉子中倍半萜(廣藿香醇)含量的定量分析，其中"PTS"單獨(dú)指的是含有編碼PTS的重組體基因的轉(zhuǎn)化體，"FPS-PTS"指的是與編碼PTS的基因融合的編石馬FPS的基因，"FPS+PTS"指的是分離的編石馬PTS和FPS的基因。14-8+PTS(8PTS)指的是過量表達(dá)本發(fā)明HMGR基因的植物，而14-2+PTS植物(2PTS、2FPS-PTS、2PTS+FPS)不過量表達(dá)HMGR。圖4中植物8PTS10的種子保藏為ATCCPTA-6706。在圖4中可以看出通過用單獨(dú)編碼TS(PTS)的基因來(lái)轉(zhuǎn)化植物，觀察到蛋白的可檢測(cè)的表達(dá)并且其與蛋白表達(dá)水平相關(guān)，但是廣藿香醇積聚是少量的。通過共表達(dá)FPS和TS，廣藿香醇的積聚適度地增加。相反，與圖4中的相同抹系相比，在14-8的品系的PTS的表達(dá)(HMGR過量表達(dá))中觀察到高廣藿香醇水平，其與PTS蛋白表達(dá)水平(圖3中抹系IO)直接相關(guān)聯(lián)。這一結(jié)果清楚地證明HMGR對(duì)于薛積聚的較大的貢獻(xiàn)。實(shí)施例8:獲得本發(fā)明植物的孟德爾雜交由于用14-8品系很難獲得轉(zhuǎn)化的植物，傳統(tǒng)的孟德爾雜交被用于產(chǎn)生過量表達(dá)單獨(dú)的PTS(PTS)、具有FPP合酶的PTS(PTS+FPS)或用作具有FPP合酶的融合蛋白(FPS-PTS)并過量表達(dá)HMGR的植物品系。設(shè)計(jì)用于表達(dá)PTS、PTS+FPS或FPS-PTS的轉(zhuǎn)基因植物品系開始在潮霉素(15mg/L)存在的條件下培育并且只有抗生素抗性植物(含有期望結(jié)構(gòu)的)可以生長(zhǎng)(親代品系Pl)。親代品系P2對(duì)于截?cái)嗟腍MGR基因(14-8)(Chappell等，1995)是純合子并且無(wú)選擇地培育和生長(zhǎng)。反交(在兩個(gè)親代品系中相互授粉)產(chǎn)生Fl后代種子，該種子在卡那霉素(50mg/L)和潮霉素(15mg/L)存在的條件下進(jìn)行培育，并且對(duì)所得到的抗性植物如以上實(shí)施例7所述評(píng)估廣藿香醇的積聚。這些雙重抗性植物含有編碼截?cái)嗟腍MGR的第一結(jié)構(gòu)和編碼如圖12(部分A)所說明的PTS、FPS+PTS或者FPS-PTS的第二結(jié)構(gòu)的雙重插入。然后將得到的后代植物——F1代植物——通過GC-MS評(píng)估其廣藿香醇的積聚。在圖12部分B中，在親代品系中廣藿香醇的水平(白色表示)相對(duì)于相應(yīng)的后代品系表示出來(lái)(反交-黑色和灰色)?！鱄MGR的親代品系(P2)不積聚任何廣藿香醇。以下表l顯示出前述評(píng)估的數(shù)值。結(jié)果顯示出在細(xì)胞溶膠中設(shè)計(jì)的廣藿香醇生物合成通過同時(shí)設(shè)計(jì)未調(diào)控形式的HMGR而被明顯增強(qiáng)。對(duì)于由雜交生成的所有后代植物來(lái)說，觀察到1.5~15倍的廣藿香醇產(chǎn)量的增加。表1:在不同的轉(zhuǎn)化的植物中和進(jìn)行遺傳雜交之后的廣藿香醇的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例9:RNA的提取和定量RT-PCR分析從500mg的嫩葉子中用制造商的Trizol試劑(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)分離每種品系的總RNA。在反應(yīng)緩沖液中，用5pg的總RNA，200ng的oligodT12-16引物和反轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptII,InvitrogenLifeTechnologies)的20pL的反應(yīng)體系并且以制造商4,薦的條件合成第一鏈的cDNA。接下來(lái)將l^L的RNaseH加入到cDNA制備液中并在37°C溫育1小時(shí)除掉互補(bǔ)RNA。應(yīng)用定量RT-PCT的方法確定不同轉(zhuǎn)基因品系中的mRNA的水平。通過改變添加的cDNA的模板的量和使用的PCR循環(huán)數(shù)(IO,15,20,25和30)來(lái)確定線性PCR擴(kuò)增的最佳濃度。使用引物PTS-8F和PTS-160R來(lái)擴(kuò)增PTS基因，而FPP-IF和FPP-160R用于FPS基因。另一對(duì)引物RBCS-FW和RBCS-RV用于擴(kuò)增作為內(nèi)標(biāo)的RUBisCO小亞單位基因。常規(guī)PCR條件由1xT叫緩沖液(按制造商提供原樣使用)，1.5mMMgCl2,0.2mMdNTP混合物，每種引物0.5pM,L25iiLcDNA和1單位的TaqDNA聚合酶組成，總共25pL的混合物。PCR擴(kuò)增進(jìn)行20個(gè)溫度循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)由94°C變性30秒，6(TC退火30秒和72'C延伸60秒組成。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠染色并且拍照。PTS和FPSmRNA分析的結(jié)果顯示在圖2中。該圖顯示了源自從植物中分離的mRNA的RT-PCR產(chǎn)物，該植物轉(zhuǎn)化自含有廣藿香醇合酶(PTS)基因或含有廣藿香醇合酶和FPS基因(PTS+FPS)的結(jié)構(gòu)，或編碼FPS和PTS的融合蛋白(PTS+FPS)的結(jié)構(gòu)。RBCS為源自存在于野生型(WT)植物和轉(zhuǎn)基因植物中作為內(nèi)標(biāo)的Rubisco小亞單位mRNA的RT-PCR產(chǎn)物。可以看出野生型(WT)植物不表達(dá)PTS或FPS。包含PTS,PTS+FPS和PTS-FPS的結(jié)構(gòu)的許多品系表達(dá)易于沖全測(cè)水平的PTSmRNA，但是廣藿香醇的積聚相對(duì)較少并且與PTSmRNA表達(dá)水平的相關(guān)較小。實(shí)施例10:WesternBlotting分才斤45條合成肽的混合物用作抗原來(lái)制備PTS和FPS的抗體。通過免費(fèi)軟件(http:〃bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)予貞觀'J抗原肽并且通過對(duì)FPS的3D結(jié)構(gòu)分析(PDB:1FPS)或?qū)TS的可用結(jié)構(gòu)的EAS(PDB:5EAS)的同源物模型比對(duì)來(lái)選擇抗原肽。我們?cè)O(shè)計(jì)5種PTS的抗原肽(PTS46:EELKVEL;PTS108:HATALSFRLLRQHGYRVSCE;PTS353:DEELIKLGAPYRA;PTS462:HVRTAVECYME.,PTS475:KVGKQEVVSE)和4種FPS的抗原肽(FPP41:EFVGFFPQIVR;FPP59:GHPEVGDAVARLKEVLQY;FPP218:YKAIVKYKTAF陽(yáng)YSFYLPVAA;FPP320:PEKVAKVKELYEA)。所有的肽都通過Sigma-Genosys(TheWoodland,TX，US)以免疫級(jí)別的10mg大小來(lái)合成。然后將每種肽混合物結(jié)合到KLH(KeyholeLimpetHemocyanin)載體蛋白上并通過StrategicBiosolutions(Windham,ME)注射到兔子體內(nèi)。PTS和FPS的多克隆抗體根據(jù)制造商手冊(cè)用與純化的PTS或FPS蛋白結(jié)合的CNBR激活的瓊脂糖4B樹脂制備的制備性抗原結(jié)合柱進(jìn)一步純化(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,England)。為了測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物材料中PTS和FPS蛋白的水平，將lOOmg的嫩葉子材料于液氮中磨碎，然后用800pL的80mM的磷酸鉀(pH7.0),10%的甘油，10mM的焦亞石克酸鈉，15mMMgCl2,10mM的抗壞血酸鈉，1%聚乙烯吡咯烷酮和14mM的a-巰基乙醇進(jìn)行提取。粗蛋白提取物于4'C在臺(tái)式微量離心機(jī)上全速離心20分鐘，得到的上清液作為蛋白來(lái)源。含有40pg的上清液蛋白的樣本在15%的SDS-PAGE凝膠中電泳并在竭化纖維膜(BIO-RAD,Hercules,CA)上打點(diǎn)。用標(biāo)準(zhǔn)的含有5%奶粉的Tween80/Tris-bufferedsaline(TTBS)封閉溶液封閉，然后添加純化的PTS或FPS抗體。然后將膜在室溫下振蕩溫育37小時(shí)，用TTBS洗滌3次，然后在室溫下用山羊過氧化酶才示i己的4元兔IgG(KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg,MD)在TTBS封閉溶液中溫育另夕卜3小時(shí)。根據(jù)制造商手冊(cè)用ECL試劑盒(AmershamBiosciences，Buckinghamshire,England)實(shí)施二級(jí)抗體的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。圖3顯示了轉(zhuǎn)基因植物中廣藿香醇合酶(PTS)蛋白和二磷酸法呢酯合酶(FPS)蛋白的表達(dá)水平。圖3中泳道上方的數(shù)字表示獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系，這些品系中設(shè)計(jì)含有廣虔香醇合酶(PTS)基因，或含有廣藿香醇合酶和FPS基因(？丁8+FPS)的結(jié)構(gòu)，或編碼FPS和PTS融合蛋白(PTS+FPS)的結(jié)構(gòu)。通過用單獨(dú)的萜合酶基因(廣藿香醇合酶)(2PTS)或編碼融和蛋白(2PTS-FPS)的基因轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物和通過用辟合酶基因和另外的含有轉(zhuǎn)基因的HMGR基因(8PTS)或另外的含有轉(zhuǎn)基因的FPP合酶(2PTS+FPS)轉(zhuǎn)化獲得的植物顯示出結(jié)果。使用的陽(yáng)性對(duì)照為PTS和FPS蛋白(分別為泳道PTS和泳道FPS),其從經(jīng)轉(zhuǎn)化以過量表達(dá)這些蛋白的細(xì)菌中純化而來(lái)。泳道WT1是從野生型植物的葉子中提取的。泳道WT1是才直物的葉子中提取的及表達(dá)HMGR基因。圖A顯示了用PTS抗體探明的膜，而圖B顯示了用FPS抗體探明的膜。在圖3中可以看出在野生型植物中以免疫方法沒有檢測(cè)到蛋白。對(duì)于大多數(shù)分析的轉(zhuǎn)基因品系來(lái)說，在葉子提取物中可檢測(cè)到PTS和/或FPS蛋白并且葉子中重組體蛋白的表達(dá)水平與辟(廣藿香醇)積聚的水平相關(guān)。實(shí)施例11:「1-13。葡萄糖標(biāo)記用于顯示本發(fā)明植物中薛合成所用的路徑為了在積聚的廣藿香醇中確定碳的生物來(lái)源，進(jìn)行標(biāo)記試驗(yàn)并且將本發(fā)明的植物與為廣藿香醇的質(zhì)體生產(chǎn)設(shè)計(jì)的植物(PCT/IB2006/051198)作對(duì)比。8PTS10(在細(xì)胞溶膠中表達(dá)PTS的轉(zhuǎn)基因植物品系)的種子和2tpPTS+tpFPS12(質(zhì)體的)在添加了潮霉素(15mg/l)的固體MS培養(yǎng)基上培育。為進(jìn)行GC-MS分析，三十抹4周大的幼苗隨后被轉(zhuǎn)移到含有5ml的不含蔗糖的液體MS培養(yǎng)基的25ml燒瓶中并在黑暗中緩慢振蕩(125rpm)溫育。1天后，將1OOmg的[1-13C]-葡萄糖(Sigma)加入培養(yǎng)基中并且每隔一天收集植物材料。如實(shí)施例7所述提取100mg的樣本用于GC分析。為進(jìn)行NMR分析，使用上述兩種轉(zhuǎn)基因品系的1000抹幼苗，100抹幼苗在添加了lg的[1-13(3]-葡萄糖的含有50ml的液體MS培養(yǎng)基的250ml的燒瓶中生長(zhǎng)。在1周后收集所有標(biāo)記的幼苗并按如上方式提取。然后使用硅石TLC盤和正己烷乙酸乙酯(9:1)作為展開液通過制備性TLC分離對(duì)濃縮的提取物(3ml)進(jìn)行純化。才矣下來(lái)通過13C-NMR(750mHz,CDC13byBobCoatesintheChemistryDepartment,UniversityofIllinois，Champaign，IL)分析來(lái)自2tpPTS+tpFPS12品系的250pg的純化的"C標(biāo)記的廣藿香醇和來(lái)自8PTS10的500pg的廣藿香醇。相對(duì)于由對(duì)照的植物純化出來(lái)的未標(biāo)記的廣藿香醇確定碳的位置和富集度。圖13A顯示了在供給[1-13(:]葡萄糖的轉(zhuǎn)基因幼苗中，分別出現(xiàn)在MVA和MEP路徑中的從IPP合成的廣藿香醇中的預(yù)測(cè)13C標(biāo)記模式。預(yù)測(cè)MVA路徑中的由IPP合成的廣藿香醇在位點(diǎn)1,3，5,7,9,12,13,14和15上具有9個(gè)13C原子，然而預(yù)測(cè)與其相對(duì)的來(lái)自MEP的廣藿香醇僅在2，6，8，12,13和15位點(diǎn)上有6個(gè)13C原子。GC-MS分析的結(jié)果示于圖13B中，其中圖b顯示了由供給12C-葡萄糖(對(duì)照)的植物合成的廣藿香醇的MS母離子，和圖c和圖d顯示了供給"C-葡萄糖的分別通過(細(xì)胞質(zhì))MVA和(質(zhì)體)MEP路徑生產(chǎn)廣藿香醇的植物。由此看出出現(xiàn)在供給"C-葡萄糖的植物的廣藿香醇具有較重的離子，并且其具有較不明顯的質(zhì)體廣藿香醇主要母離子的質(zhì)量從222變動(dòng)到225,并且當(dāng)設(shè)計(jì)細(xì)胞質(zhì)路徑時(shí)，可觀測(cè)到M+8mass母離子；主要母離子的質(zhì)量變動(dòng)到224并且當(dāng)設(shè)計(jì)葉綠體路徑時(shí)可觀測(cè)到M+6mass母離子。這些觀測(cè)結(jié)果與標(biāo)記預(yù)計(jì)是一致的。NRM分析的結(jié)果示于表2。表2:通過細(xì)胞質(zhì)MVA路徑和質(zhì)體MEP路徑從1-13C葡萄糖合成廣藿香醇的13c富集度<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*由于污染造成的信號(hào)根據(jù)圖13中顯示的預(yù)測(cè)的標(biāo)記模式，表2顯示出來(lái)自于具有在細(xì)胞溶膠中表達(dá)的PTS的植物的廣藿香醇中，碳原子1,3,5,7,9，12，13，14和15富集13C。因此標(biāo)記顯示出由于MVA路徑，倍半薛實(shí)際上由IPP合成了，并顯示出質(zhì)體路徑?jīng)]有貢獻(xiàn)。實(shí)施例12:植物中細(xì)胞質(zhì)單辟生物合成的設(shè)計(jì)圖7中顯示的表達(dá)載體在原始的PTS和FPS表達(dá)載體中如圖11所說明的通過用對(duì)PTS基因的柑橘檸檬烯合酶基因(LIS)(GenBankaccessionAF514287)和對(duì)FPS基因的來(lái)自于擬南芥(Arabidopsisthaliana)(GenBankaccessionATH17376)的二磷酸香葉酯合酶基因(GPS)的取代克隆來(lái)生成。從杵檬水果或擬南芥植物分離出來(lái)的RNA通過各自基因的反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得LIS和GPS基因。使用RNA-Trizol(invitrogen)試劑根據(jù)制造商的步驟提取RNA并且使用反轉(zhuǎn)錄酶和oligodT引物將其轉(zhuǎn)化為第一鏈cDNA。使用引物組合AtGPS-SpeF和AtGPS-KpnR對(duì)GPS的擴(kuò)增和引物組合LIS-AscF和LIS-XhoR對(duì)LIS的擴(kuò)增實(shí)施PCR擴(kuò)增(30，31)。這些引物被設(shè)計(jì)用于移除編碼質(zhì)體定位信號(hào)的核苷酸序列，以引入起始密碼子和引入限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)。含有LIS基因的PCR產(chǎn)物(32)用Xhol和Ascl限制性酶消化并連接到用相同的酶消化(34)的原始PTS表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)上(33)。得到的載體(35)用于植物中LIS的表達(dá)。對(duì)于LIS和GPS表達(dá)載體的構(gòu)建，如上所述獲得的含有GPS基因的PCR產(chǎn)物(36),用Kpnl和Spel限制性酶消化并連接到用相同的酶消化(38)的PTS+FPS表達(dá)載體(37)上來(lái)獲得載體39(圖11)。如上所述得到含有LIS基因并用Xhol和Ascl限制性酶(32)消化的PCR產(chǎn)物，并且連接到首先用相同的酶(42)消化的載體40上。得到的載體(41)被用于在植物中表達(dá)LIS和GPS。根據(jù)實(shí)施例6將植物轉(zhuǎn)化并根據(jù)實(shí)施例7評(píng)價(jià)檸檬烯的'積聚。在圖15中可以看出檸檬烯被積聚在為細(xì)胞質(zhì)路徑設(shè)計(jì)的植物和為一些增加檸檬烯積聚的GPS和LIS的共表達(dá)設(shè)計(jì)的植物中。參考文獻(xiàn)AusubelFM,BrentR，KingstonRE,MooreDD，SeidmanSmithJA，StruhlK(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology.BenfeyPN,ChuaNH(1990)TheCauliflowerMosaicVirus-35sPromoter-CombinatorialRegulationOfTranscriptionInPlants.Science250:959-966ChappellJ,WolfF，ProulxJ,CuellarR，SaundersC(1995)IsTheReactionCatalyzedBy3-Hydroxy-3-MethylglutarylCoenzyme-AReductaseARate-LimitingStepForIsoprenoidBiosynthesisInPlants.PlantPhysiology109:1337-1343ChinDJ，GilGRussellDW,LiscumL，LuskeyKL,BasuSK,OkayamaH,BergP,GoldsteinJL,BrownMS(1984)Nucleotide-SequenceOf3-Hydroxy-3-Methyl-GlutarylCoenzyme-AReductase,AGlycoproteinOfEndoplasmic-Reticulum.Nature308:613-617FreyPM,Scharer-HernandezNQFuttererJ,PotrykusI，Puonti-KaerlasJ(2001)SimultaneousanalysisofthebidirectionalAfricancassavamosaicviruspromoteractivityusingtwodifferentluciferasegenes.VirusGenes22:231-242HajdukiewiczP，SvabZ,MaligaP(1994)TheSmall,VersatilePpzpFamilyOfAgrobacteriumBinaryVectorsForPlantTransformation.PlantMolecularBiology25:989-994HartleyJL,TempleGF,BraschMA(2000)DNAcloningusinginvitrosite-specificrecombination.GenomeResearch10:1788-1795HorschRB，F(xiàn)ryJE,HoffmannNL,EichholtzD,RogersSG，F(xiàn)raleyRT(1985)ASimpleAndGeneral-MethodForTransferringGenesIntoPlants.Science227:1229-1231Luckeretal(2001)ExpressionofClarkiaS陽(yáng)linaloolsynthaseintransgenicpetuniaplantsresultsintheaccumulationofS-linalyl-beta-D-glucopyranoside;PlantJ.(4):315-24MauCJ，WestCA(1994)CloningofcasbenesynthasecDNA:evidenceforconservedstructuralfeaturesamongterpenoidcyclasesinplantsProcNatlAcadSciUSA;91(18):8497-501.MersereauM,PazourGJ,DasA(1990)EfficientTransformationOfAgrobacterium-TumefaciensByElectroporation,Gene90:149-151MurashigeT,SkoogF(1962)ARevisedMediumForRapidGrowthAndBioAssaysWithTobaccoTissueCultures.PhysiologiaPlantarum15:473-&Oharaetal(2003)LimoneneproductionintobaccowithPerillalimonenesynthasecDNA.J.Exp.Bot.Petersetal(2000)Biochemistry;39(50):15592-602SambrookJ,FritschEF，ManiatisT(1989)MolecularCloning-alaboratorymanual(2ndEdition).ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NYSchardlCL,ByrdAD，BenzionQAltschulerMA,HildebrandDF,HuntAG(1987)DesignAndConstructionOfAVersatileSystemForTheExpressionOfForeignGenesInPlants.Gene61:1-11Shirai,K.,Masuda，K.andOosawa,K.2002.CloningandSequencingofEnt-kKaureneSynthaseCDNAfromCucumber.ActaHort.(ISHS)588:317-320TakahashiS,ZhaoY,O'MaillePE，GreenhagenBT,NoelJP,CoatesRM,ChappellJ(2005)Kineticandmolecularanalysisof5-epiaristolochene-l,3-dihydroxylase,acytochromeP450enzymecatalyzingsuccessviehydroxylationsofsesquiterpenes.JournalofBiologicalChemistry280:3686-3696TarshisLC,YanMJ，PoulterCD,SacchettiniJC(1994)Crystal-StructureOfRecombinantFarnesylDiphosphateSynthaseAt2.6-AngstromResolution.Biochemistry33:10871-1087權(quán)利要求1.表達(dá)編碼HMG-CoA還原酶(HMGR)的轉(zhuǎn)基因和編碼萜合酶(TS)的轉(zhuǎn)基因的植物。2.權(quán)利要求1的植物，還表達(dá)編碼異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(PRT)的轉(zhuǎn)基因。3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物直接進(jìn)入到植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中TS為單辟合酶和/或倍半薛合酶。5.權(quán)利要求2、4、5和/或6中任一項(xiàng)的植物，其中編碼PRT的基因?yàn)榫幋a二磷酸香葉酯合酶(GPS)和/或二磷酸法呢酯合酶(FPS)的基因。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中轉(zhuǎn)基因和/或額外基因?yàn)楹嘶颉?.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，當(dāng)與不含轉(zhuǎn)基因的天然植物相比時(shí)，其積聚至少1.2倍的由該轉(zhuǎn)基因編碼的TS合成的辟。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化的植物，其積聚每克新鮮葉子至少400ng可由該轉(zhuǎn)基因和/或額外基因編碼的TS合成的辟。9.含有編碼至少一種PRT和/或至少一種TS的核苷酸序列的載體。10.制備轉(zhuǎn)化的植物的方法，該方法包含以下步驟-轉(zhuǎn)化植物材料以含有額外基因，所述額外基因編碼HMGR和TS,和-從所述的植物材料中再生出轉(zhuǎn)化的植物。11.制備轉(zhuǎn)化的植物的方法，該方法包含以下步驟-用含有編碼TS的至少一種基因的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化第一植物材料；-用含有編碼HMGR的至少一種基因的至少一種DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化第二植物材料；-分別從第一和第二轉(zhuǎn)化的植物材料中再生出第一和第二植物；-雜交第一和第二植物；和-從雜交獲得的后代中選擇含有編碼TS的基因和編碼HMGR的基因兩者的植物。12.權(quán)利要求11的方法，其中含有編碼TS的基因的DNA結(jié)構(gòu)或者含有編碼HMGR的基因結(jié)構(gòu)還含有編碼PRT的基因。13.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包含用被轉(zhuǎn)化以含有編碼PRT基因的植物與第一和/或第二再生植物雜交或者與通過雜交第一和第二再生植物獲得的植物雜交的步驟。14.改變植物中辟含量的方法，該方法含有權(quán)利要求10~13中4壬一項(xiàng)的步驟。15.生產(chǎn)碎的方法，該方法包含從權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)的植物中或從權(quán)利要求1115中任一項(xiàng)的方法獲得的植物中分離碎的步驟。16.至少一種編碼HMGR和TS的基因在具有改變的萜含量的植物的生產(chǎn)中的應(yīng)用。17.權(quán)利要求18中任一項(xiàng)的植物，權(quán)利要求1015中任一項(xiàng)的方法，和/或權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中編碼HMGR、TS和如果存在的PRT的基因是不含質(zhì)體定位序列的核基因。全文摘要本發(fā)明涉及積聚單萜和/或倍半萜的轉(zhuǎn)化的植物，具體涉及一種表達(dá)轉(zhuǎn)基因的植物和被轉(zhuǎn)化以含有額外基因拷貝的植物，所述基因編碼至少一種HMGR-CoA還原酶和萜合酶。本發(fā)明還要求保護(hù)制備該植物的方法和生產(chǎn)萜的方法。因此，本發(fā)明提供了一種可靠并且節(jié)約成本的用于生產(chǎn)任何萜，特別是感興趣的任何單萜和/或倍半萜的平臺(tái)。例如，技術(shù)人員可使用任何編碼倍半萜合酶的基因在本發(fā)明的植物中積聚各自的倍半萜。文檔編號(hào)C12N15/82GK101208434SQ200680022986公開日2008年6月25日申請(qǐng)日期2006年6月26日優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日發(fā)明者喬·夏貝爾,安東尼·克拉克,巫水欽,米歇爾·沙爾克申請(qǐng)人:肯塔基大學(xué)研究機(jī)構(gòu)