專利名稱：流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的工藝，尤其是以褐黃孢鏈霉菌 (Streptomycesgilvosporeus)ATCC13326 發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的工藝。
背景技術：
納他霄素(Natamycin)是由納塔爾鏈霄菌(Streptomyces natal ens is)或 塔努力卩鏈霉菌(Sti^ptomyce s chatanoogensis)或揭黃抱鏈毒菌(Streptomyces gilvosporeus)發(fā)酵產(chǎn)生的一種二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能有效地抑制和殺 死霉菌及酵母菌，是一種安全、低毒、高效、廣譜的抗真菌類抗生素和天然的生物防腐劑 (Pedersen JC. Natamycin as a fungicide in agarmedia[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58 (3) : 1064-1066)。與其它抗菌產(chǎn)品相比，納他霉素對哺乳動物細胞 的毒性極低，可廣泛應用于由真菌引起的疾病。除此之外，納他霉素的低溶解度，可用其對 食品表面進行處理以增加食品的保質期，不影響風味和口感。目前，全球有30多個國家批 準將納他霉素用于乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒等的生產(chǎn)和保藏。納他霉素的需求量 增力口，市場前景巨大(Davidson PM,Doan CH. Natamycin[A]. Antimicrobials in Foods[C]. New York, Basel and Hong Kong :Marcel Dekker Inc.,1993,395-407)。目前，國內(nèi)外納他霉素的發(fā)酵水平不一，大部分發(fā)酵法生產(chǎn)納他霉素的產(chǎn)量 為 2 5g/L，應用前景受到限制(Mohamed A F, Hesham A E. Optimization of the cultivation medium fornatamycin production by Streptomyces natalensis[J]. Journal of Basic Microbiology, 2000,40 (3) : 157-166)。有報道(江正兵，宋慧婷，馬立 新.納他霉素高產(chǎn)菌株的選育及納他霉素高效發(fā)酵提取純化方法。CN101307299A)通過發(fā) 酵罐流加高濃度葡萄糖培養(yǎng)Str印tomycesgilvosporeus HBJ591突變株，獲得納他霉素產(chǎn) 量為14g/L，為迄今為止報道的最高水平，但該方法耗糖多，糖轉化率也較為低下。通過流加 底料或其他營養(yǎng)成分來增加納他霉素產(chǎn)量的研究國內(nèi)外并不多見。納他霉素與其它大環(huán)內(nèi) 脂類抗生素的合成機理相似，都屬于聚酮體途徑，培養(yǎng)液中的一些蛋白、氨基酸、碳水化合 物以及一些維生素和微量元素都可能對納他霉素的合成有促進作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法。本發(fā)明以褐黃孢鏈霉菌(Sti^ptomyces gilvosporeus)ATCC13326生產(chǎn)納他霉素 的具體方法如下1)搖瓶種子培養(yǎng)無菌條件下，取褐黃孢鏈霉菌孢子涂布于高氏1號瓊脂培養(yǎng)基斜面中，置于培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)好的孢子塊接入盛有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)；2) 一級種子罐培養(yǎng)將種子液按5% 10%的接種量接入盛有一級種子罐培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)；
3) 二級種子罐培養(yǎng)將種子液按10% 30%的接種量接入盛有二級種子罐培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)；4)底料流加發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液按5% 10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度28 30°C，轉速為100 200rpm，發(fā)酵時間120 160h，分別在發(fā)酵培養(yǎng)24 48h、60 80h、 90 IOOh時，恒速流加初始培養(yǎng)液質量體積的5% 20%發(fā)酵培養(yǎng)基，待發(fā)酵液呈米黃色 稍深，菌絲衰老，趨于自溶，染色淺時放罐，得納他霉素。發(fā)酵液中納他霉素的含量可達到9. 5 11. 5g/L。在步驟1)中，所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度可為28 30°C，培養(yǎng)的時間可為5 9d ；所述搖瓶種子培養(yǎng)基為可溶性淀粉20. 0 0. Og/L,葡萄糖8. 0 15. Og/L,黃豆餅粉 10. 0 20. Og/L，酵母粉 8. 0 20g/L，蛋白胨 5. 0 10. Og/L，碳酸鈣 2. 0 10. Og/L, pH 7. 0 ；所述搖床培養(yǎng)的轉速可為150 220rpm，搖床培養(yǎng)的溫度可為25 30°C，搖床培養(yǎng)的 時間可為36 48h。在步驟2)中，所述一級種子罐培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. 0g/L，黃豆餅粉5.0 15. 0g/L，蛋白胨5.0 10. 0g/L，酵母粉5. 0 10. 0g/L，氯化鈉 2. 0 5. 0g/L,碳酸鈣5. 0 15. 0g/L,消泡劑1 2g/L，pH 7. 0 士0. 5 ；所述種子罐中培養(yǎng)的 轉速可為200 400rpm，培養(yǎng)的溫度可為28 30°C，種子罐的罐壓可為0. 03 0. 05MPa, 培養(yǎng)的時間可為24 48h。在步驟3)中，所述二級種子罐培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. 0g/L，黃豆餅粉5.0 15. 0g/L，蛋白胨5.0 10. 0g/L，酵母粉5. 0 10. 0g/L，氯化鈉 2. 0 5. 0g/L,碳酸鈣5. 0 15. 0g/L,消泡劑1 2g/L，pH 7. 0 士0. 5 ；所述種子罐中培養(yǎng)的 轉速可為200 400rpm，培養(yǎng)的溫度可為28 30°C，種子罐的罐壓可為0. 03 0. 05MPa, 培養(yǎng)的時間可為24 48h。在步驟4)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. Og/ L，黃豆餅粉5. 0 15. 0g/L,蛋白胨5. 0 10. 0g/L,氯化鈉2. 0 5. 0g/L,碳酸鈣5. 0 15. 0g/L,消泡劑 0. 5 2g/L，pH 7. 0 士0. 5。本發(fā)明采用底料流加方法，發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，納他霉素產(chǎn)量較傳統(tǒng)方法提高一 倍以上，具有操作簡單、成本低、設備要求低，效果佳等優(yōu)勢。


圖1為實施例1中褐黃孢鏈霉菌在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)納他霉素的曲 線。在圖1中，橫坐標為時間Time(h)，左縱坐標為發(fā)酵液中納他霉素濃度Natamycin concentration (g/L) ( ■)，右縱坐標為菌體干質量 Dry cell weight (DCff, g/L)(〇)。圖2為實施例2中褐黃孢鏈霉菌在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中生產(chǎn)納他霉素的曲 線。在圖2中，橫坐標為時間Time(h)，左縱坐標為發(fā)酵液中納他霉素濃度Natamycin concentration (g/L) ( ■)，右縱坐標 1 為菌體干質量 Dry cell weight (DCff, g/L)(〇)， 右縱坐標2為發(fā)酵液pH(···)。圖3為實施例3中褐黃孢鏈霉菌在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中流加底料生產(chǎn)納他霉素 的曲線。在圖3中，橫坐標為時間Time (h)，左縱坐標為發(fā)酵液中納他霉素濃度Natamycinconcentration(g/L) ( ■)；從左到右順序，右縱坐標1為發(fā)酵液的溶氧D0(% )(-)及菌體 干質量Dry ce 1 Iweight (DCff, g/L)(〇)，右縱坐標2為發(fā)酵液的pH(···)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作詳細說明。實施例11)搖瓶種子培養(yǎng)無菌條件下，從 80°C超低溫冰箱保藏的孢子甘油管中取 200 μ L涂布于高氏1號瓊脂培養(yǎng)基斜面中，置于28°C培養(yǎng)箱，依菌落生長情況培養(yǎng)5 9d。 利用小鏟將培養(yǎng)好的新鮮斜面上Icm2的孢子塊接入盛有種子培養(yǎng)基(可溶性淀粉20. Og/ L，葡萄糖8. Og/L,黃豆餅粉10. Og/L,酵母粉8. Og/L,蛋白胨5. 0g/L,碳酸鈣2. 0g/L, pH 7. 0)的三角瓶中，搖床轉速200rpm、28°C、培養(yǎng)36h。2) 一級種子罐培養(yǎng)將種子液按10%的接種量接入盛有一級種子罐培養(yǎng)基(可溶 性淀粉100g/L，葡萄糖25. 0g/L，黃豆餅粉15. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，酵母粉10. 0g/L，氯化 鈉2. 0g/L，碳酸鈣15. 0g/L，消泡劑2g/L，pH 7. 0士0. 5)的種子罐中，轉速200 400rpm, 培養(yǎng)溫度28°C，罐壓0. 03 0. 05MPa。培養(yǎng)24 48h。3) 二級種子罐培養(yǎng)將一級種子罐的培養(yǎng)液按10 30%的接種量接入盛有二級 種子罐培養(yǎng)基(可溶性淀粉100g/L，葡萄糖25. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L, 酵母粉10. 0g/L，氯化鈉2. 0g/L，碳酸鈣15. 0g/L，消泡劑2g/L，pH 7. 0 士0. 5)的種子罐中， 轉速200 400rpm,培養(yǎng)溫度28 °C，罐壓0. 03 0. 05MPa。培養(yǎng)24h。4)底料流加發(fā)酵罐放大培養(yǎng)將種子液按10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基(可 溶性淀粉50. 0g/L,葡萄糖5. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L,蛋白胨5. 0g/L,酵母粉5. 0g/L,氯化 鈉2. 0g/L，碳酸鈣15. 0g/L,消泡劑lg/L，pH 7. 0)的發(fā)酵罐。培養(yǎng)溫度28°C，轉速為500 700rpm,發(fā)酵時間168h。在發(fā)酵培養(yǎng)開始后36h、72h、96h時，分別恒速流加培養(yǎng)液質量體積 體積的5 20%發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溶氧為30%以上。至發(fā)酵結束時發(fā)酵液中納他霉素含量 通過HPLC法測定達到11. 2g/L。分析其生產(chǎn)曲線(圖1)可知，菌體在24左右后溶氧迅速 下降，表面此階段生長迅速，在36h時溶氧上升即地物接近耗盡時流加底料，使菌體進一步 增加，為后期生產(chǎn)納他霉素做準備。在72h、96h時再次流加底料，促進納他霉素產(chǎn)量穩(wěn)步上 升，使得在144h左右納他霉素產(chǎn)量達到堆高11. 2g/L。菌體干質量最高可達46. 25g/L。HPLC方法如下取ImL納他霉素發(fā)酵液，加入9mL甲醇，充分搖勻后，超聲30min，5000rpm離心 IOmin除去菌體，取上清液ImL加入70%甲醇4mL，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾即得到待測液。
標準品的配制精確稱取50mg納他霉素標準品，用甲醇溶解并定容至IOOmL,配制 成0. 5g/L的標準儲備液置于4°C避光保存。臨用時使用70%甲醇稀釋至所需濃度則得到 納他霉素標準液，經(jīng)0. 22 μ m微孔濾膜過濾后即得標準待測液。HPLC 條件儀器為 Agilent I2OOseries ；流動相V (甲醇)V (水)V (磷酸) =63 36 0. 3 ；色譜柱Agilent LC C18 (5 μ m ;4· 6讓X 250讓)；柱溫室溫；檢測波 長303nm ；流速1. 00mL/min ；進樣量20 μ L。實施例21)搖瓶種子培養(yǎng)到二級種子罐培養(yǎng)同實施例1 ；
2)底料流加發(fā)酵罐放大培養(yǎng)將種子液按10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基 (可溶性淀粉50. Og/L,葡萄糖5. Og/L,黃豆餅粉15. Og/L,蛋白胨5. Og/L,酵母粉5. Og/L, 氯化鈉2.0g/L，碳酸鈣15.0g/L，消泡劑lg/L，pH 7.0)的發(fā)酵罐。培養(yǎng)溫度28°C，轉速為 200rpm,發(fā)酵時間130h。在發(fā)酵培養(yǎng)開始后30h、68h、90h時，分別恒速流加培養(yǎng)液質量體積 體積的20%發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溶氧為30%以上。至發(fā)酵結束時發(fā)酵液中納他霉素含量通過 HPLC法測定達到10. 5g/L。實施例31)搖瓶種子培養(yǎng)到二級種子罐培養(yǎng)同實施例1 ；2)底料流加發(fā)酵罐放大培養(yǎng)將二級種子液按10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng) 基(可溶性淀粉50. 0g/L,葡萄糖5. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L,蛋白胨5. 0g/L,酵母粉5. Og/ L，氯化鈉2.(^/1，碳酸鈣15.(^/1，消泡劑化/1，pH 7.0)的發(fā)酵罐。培養(yǎng)溫度28°C，轉速 為200rpm，發(fā)酵時間130h。在發(fā)酵培養(yǎng)開始后36h、72h、96h時，分別恒速流加培養(yǎng)液質量 體積20%的發(fā)酵培養(yǎng)基，控制溶氧為30%以上。至發(fā)酵結束時發(fā)酵液中納他霉素含量通過 HPLC法測定達到9. 53g/L。菌體干質量達到56. 0g/L。對比例11)菌種活化及搖瓶種子培養(yǎng)同實施例1。2)發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基(可溶性淀粉 50. 0g/L,葡萄糖10. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L,蛋白胨10. 0g/L,酵母粉5. 0g/L,氯化鈉2. Og/ L，碳酸鈣15. 0g/L, pH 7. 0)的三角瓶搖瓶中，搖床轉速200rpm，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間 144h。至發(fā)酵結束時通過HPLC法測定發(fā)酵液中納他霉素含量為2. 2g/L(參見圖2)。對比例21)菌種活化、搖瓶種子培養(yǎng)及一級種子罐培養(yǎng)同實施例1。2) 二級種子罐培養(yǎng)將一級種子罐的培養(yǎng)液按10 30%的接種量接入盛有二級 種子罐培養(yǎng)基(可溶性淀粉100g/L，葡萄糖25. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L, 酵母粉10. 0g/L，氯化鈉2. 0g/L，碳酸鈣15. 0g/L，消泡劑2g/L，pH 7. 0 士0. 5)的種子罐中， 轉速200 400rpm,培養(yǎng)溫度28 °C，罐壓0. 03 0. 05MPa。培養(yǎng)24h。3)發(fā)酵罐培養(yǎng)將二級種子罐培養(yǎng)液按10%的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基(可 溶性淀粉50. 0g/L,葡萄糖5. 0g/L,黃豆餅粉15. 0g/L,蛋白胨5. 0g/L,酵母粉5. 0g/L,氯化 鈉2. 0g/L，碳酸鈣15. 0g/L,消泡劑2g/L，pH 7. 0)的120L發(fā)酵罐。培養(yǎng)溫度28°C，轉速為 400 600rpm，發(fā)酵時間168h。至發(fā)酵結束發(fā)酵液中納他霉素最高含量達到6. 54g/L (參見 圖3)。
權利要求
流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于包括以下步驟1)搖瓶種子培養(yǎng)無菌條件下，取褐黃孢鏈霉菌孢子涂布于高氏1號瓊脂培養(yǎng)基斜面中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)好的孢子塊接入盛有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，搖床培養(yǎng)；2)一級種子罐培養(yǎng)將種子液按5％～10％的接種量接入盛有一級種子罐培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)；3)二級種子罐培養(yǎng)將種子液按10％～30％的接種量接入盛有二級種子罐培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)；4)底料流加發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液按5％～10％的接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度28～30℃，轉速為100～200rpm，發(fā)酵時間120～160h，分別在發(fā)酵培養(yǎng)24～48h、60～80h、90～100h時，恒速流加初始培養(yǎng)液質量體積的5％～20％發(fā)酵培養(yǎng)基，待發(fā)酵液呈米黃色稍深，菌絲衰老，趨于自溶，染色淺時放罐，得納他霉素。
2.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟1) 中，所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度為28 30°C，培養(yǎng)的時間為5 9d。
3.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟1) 中，所述搖瓶種子培養(yǎng)基為可溶性淀粉20. 0 0. Og/L,葡萄糖8. 0 15. Og/L,黃豆餅粉 10. 0 20. Og/L，酵母粉 8. 0 20g/L，蛋白胨 5. 0 10. Og/L，碳酸鈣 2. 0 10. Og/L, pH 7. 0。
4.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟1) 中，所述搖床培養(yǎng)的轉速為150 220rpm，搖床培養(yǎng)的溫度為25 30°C，搖床培養(yǎng)的時間 為36 48h。
5.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟2) 中，所述一級種子罐培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. 0g/L,黃豆餅粉 5.0 15. 0g/L，蛋白胨5. 0 10. 0g/L，酵母粉5. 0 10. 0g/L，氯化鈉2. 0 5. 0g/L，碳酸 鈣 5. 0 15. 0g/L，消泡劑 1 2g/L, pH 7. 0 士0. 5。
6.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟2) 中，所述種子罐中培養(yǎng)的轉速為200 400rpm，培養(yǎng)的溫度為28 30°C，種子罐的罐壓為 0. 03 0. 05MPa,培養(yǎng)的時間為24 48h。
7.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟3) 中，所述二級種子罐培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. 0g/L,黃豆餅粉 5.0 15. 0g/L，蛋白胨5. 0 10. 0g/L，酵母粉5. 0 10. 0g/L，氯化鈉2. 0 5. 0g/L，碳酸 鈣 5. 0 15. 0g/L，消泡劑 1 2g/L, pH 7. 0 士0. 5。
8.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟3) 中，所述種子罐中培養(yǎng)的轉速為200 400rpm，培養(yǎng)的溫度為28 30°C，種子罐的罐壓為 0. 03 0. 05MPa,培養(yǎng)的時間為24 48h。
9.如權利要求1所述的流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，其特征在于在步驟4) 中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉50. 0 100g/L，葡萄糖5. 0 25. 0g/L,黃豆餅粉5. 0 15. 0g/L，蛋白胨5. 0 10. 0g/L,氯化鈉2. 0 5. 0g/L,碳酸鈣5. 0 15. 0g/L,消泡劑'0. 5 2g/L，ρΗ7· 0 士 0· 5。
全文摘要
流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法，涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的工藝，提供一種流加底料發(fā)酵罐生產(chǎn)納他霉素的方法。將納他霉素生產(chǎn)菌株褐黃孢鏈霉菌活化后轉接至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后再轉接至一級、二級種子罐中培養(yǎng)，然后接入發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在發(fā)酵培養(yǎng)24～48h、60～80h、90～100h時，通過恒速流加初始培養(yǎng)液質量體積的5％～20％發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)，待發(fā)酵液呈米黃色稍深，菌絲衰老，趨于自溶，染色淺時放罐，此時發(fā)酵液中納他霉素含量達到9.5～11.5g/L。采用底料流加方法，發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素，納他霉素產(chǎn)量比傳統(tǒng)方法提高一倍以上，具有操作簡單、成本低、設備要求低，效果佳等優(yōu)勢。
文檔編號C12R1/465GK101985643SQ20101022791
公開日2011年3月16日 申請日期2010年7月13日 優(yōu)先權日2010年7月13日
發(fā)明者凌雪萍, 盧英華, 姚傳義, 敬科舉, 曾憲海, 郝曉兵, 陳翠雪, 馬尼拉法沙·伊馬努兒 申請人:廈門大學