專利名稱：應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP啟動(dòng) 子調(diào)控生產(chǎn)生物蛋白的方法，具體是一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控 表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法。
背景技術(shù)：
葡聚糖內(nèi)切酶(endo-l，4-P-D-glucanase， EC3.2.1.4) (EG)作用于纖 維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解p-l，4-糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子截 短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素。當(dāng)葡聚糖內(nèi)切酶與葡聚 糖外切酶和p-葡萄糖苷酶的協(xié)同作用時(shí)能將植物纖維素分解為葡萄 糖，葡萄糖可作為食品也可作為生物能源乙醇的原料。
葡聚糖內(nèi)切酶主要來(lái)自于某些細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌。傳統(tǒng) 上生產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶主要是應(yīng)用天然的菌株進(jìn)行發(fā)酵，但是，由于細(xì) 菌產(chǎn)生的葡聚糖內(nèi)切酶是以包涵體形式存在于胞內(nèi)，產(chǎn)物難于純化； 而放線菌和絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)要求較高，分泌大量自身的蛋白， 生產(chǎn)成本較高。
畢赤酵母(PZc/H'aposton;s)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達(dá)宿主，
營(yíng)養(yǎng)要求不高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于 戸加^分泌自身的蛋白很少，有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。近來(lái)有應(yīng)用 尸/c/^/ a加^的pAOXl系統(tǒng)表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶，但pAOXl在系統(tǒng)表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶時(shí)需要應(yīng)用甲醇為碳源，而甲醇是易揮發(fā)的有毒物 質(zhì)，在生產(chǎn)中使用，容易造成環(huán)境污染；當(dāng)大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，甲醇的大 量使用具有潛在火災(zāi)危險(xiǎn)；并且，外源蛋白的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決應(yīng)用天然產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶的菌株生產(chǎn)葡 聚糖內(nèi)切酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化以及應(yīng)用尸/c/n: pwtoni的 pAOXl表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶時(shí)需要應(yīng)用毒性的甲醇為碳源的 問(wèn)題，而提供一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子) 調(diào)控表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法，其步
1、 首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由 pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn) 化畢赤酵母基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28 3(TC在生 物反應(yīng)器中發(fā)酵工程菌1 2d分泌表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶，在發(fā)酵過(guò)程中 用氨水維持pH在4 6。所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85%磷 酸25~28 ml/L， CaS04 '21120 0. 8~ 1. 2g/L， K2S04 17-19 g/L， MgS04 '7 H20 13 16g/L，KOH 3. 5~4. 5 g/L，碳源15~ 45g/L，蛋白胨18~22 g/L,Yeast extract 8 ~12g/L, PTM4 3~5 ml/L。所述碳源是甘油或油酸。所 述PTM4是由以下組分組成CuS04 *5H20 1. 5 2. 5g/L， Nal *2H20 0. 1~0. 2g/L， MnS04 H20 2. 5 ~3. 5g/L， Na2Mo04 2H20 0. 1~0. 3 g/L， H3BO30, 01 0. 03g/L， CoCl2 *6 H20 1. 0 2. Og/L, ZnCl2 6. 5 ~7. 5g/L， Fe2(S04)3 7 H20 20~ 25g/L，生物素0. 1~0. 3 g/L，硫酸1 ~2ml/L。
本發(fā)明采用了畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)的葡聚糖內(nèi)切酶，具有 下列優(yōu)點(diǎn)-
1、 生產(chǎn)成本低，只需使用普通的無(wú)機(jī)鹽、碳源和氮源作為發(fā)酵
培養(yǎng)基。
2、 可在生物反應(yīng)器中發(fā)酵畢赤酵母，其細(xì)胞能生長(zhǎng)至細(xì)胞密度 達(dá)200A以上，能以足夠多的細(xì)胞數(shù)量表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶，有利于葡 聚糖內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
3、 發(fā)酵周期短，整個(gè)發(fā)酵周期只需l~2d。
4、 使用無(wú)毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源。
5、 由于pGAP是畢赤酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子，由pGAP調(diào)控表達(dá)的葡 聚糖內(nèi)切酶約占總分泌蛋白的比例較高，并且由于在葡聚糖內(nèi)切酶的 C端融合了His標(biāo)簽，有利于產(chǎn)物的純化。
具體實(shí)施方式
下面才用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例一
1、首先從戶/c/z/a/ osto^中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的乃'c/^ pwton; 表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化/ ostoWs基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A,"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 。1120 0.93g， K2S0418.2g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH4.13g，甘油40 g，蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方(每升)CuS04 5H20 2.0 g， Nal 2H20 O.lg， MnS04 H20 3.0 g,Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl26 H20 1.05 g， ZnCl27.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS。4 7 H20 11.6 g代替)，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC， pH5.0,攪拌轉(zhuǎn)速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵2 d后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。實(shí)施例二
1、 首先從i^c/H'a; astoWs中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的尸/c^a /^Won's表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化i^/^/ oston's基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A6()。"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H200.93 g， K2S0418.2g， MgS04 *7H20 14,9g， KOH4.13g，油酸20 g，蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方(每升)CuS04 '5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'H20 3.0 g，Na2Mo04 2H20 0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1,05 g, ZnCl27.0 g， Fe2(S04)3 7H20 22g (可FeS。4 7 H20 11.6 g代替)，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30。C， pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-卯0 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。實(shí)施例三
1、 首先從尸/cM^oston;s中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的尸/c/2/fl pastoni表達(dá)載體，并將這一
載體轉(zhuǎn)化尸Z'C/W^ / OStoWs基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A,"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml, CaS04 2H200.93 g， K2S0418.2g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH4.13g，山梨醇35 g，蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4 ml(PTM4配方(每升)CuS04 *5H2O2.0g， NaI'2H2O0.1g， MnS04 H203.0 g， Na2Mo04'2H2O0.2g， H3B03 0.02 g， CoCl2 '6恥1.05經(jīng)ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeS04 7 H20 11. 6 g代替)，生物素0,2g，硫酸lml)，在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C, pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。實(shí)施例四
1 、首先從乃'c/2/aposton's中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的P/c/z/fl posto^表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化尸/c/z/a/ o^cWs基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A,"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H200.93 g， K2S04 18.2 g, MgS04 7 H20 14.9 g, KOH 4.13 g,葡萄糖40g，蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升):CuS04 '5H2O2.0g， NaI*2H2O0.1g， MnS04 H203.0 g， Na2Mo04 '2恥0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 '6 H20 1.05 g，ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeS04 7 H20 11. 6 g代替)，生物素0,2g，硫酸lml),在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵2 d后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。實(shí)施例五
1、 首先從尸/c/z/a/ osto^中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、 在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的尸/c/n'a戸加&表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化戶z'c/2iaposton's基因組；
3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A6(K)"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H200.93 g, K2S0418.2g， MgS04*7H20 14.9 g， KOH4.13g,學(xué)L酸30 g，蛋白胨20 g， Yeast extract 10 g, PTM4微量元素4 ml(PTM4配方
(每升)CuS04 '5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04'1120 3.0 g，Na2Mo04 2H20 0.2 g, H3B03 0.02 g， CoCl2 6 H20 1.05 g, ZnCl27.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeSOW H20 11.6 g代替)，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度3(TC， pH5.0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。實(shí)施例六
1 、首先從尸/c/w'apastoni中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；
2、在葡聚糖內(nèi)切酶基因序列的3'末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由
pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的尸/c/w'" pwto^表達(dá)載體，并將這一
載體轉(zhuǎn)化P/c/^pwtor^基因組；3、 根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；
4、 將工程菌株菌液(A,"1.5)接種(接種量為1/12)于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基配方(每升)85%磷酸26.7 ml， CaS04 2H200.93 g， K2S0418.2g， MgS04 7 H20 14.9 g， KOH 4.13 g，甘露醇40 g，蛋白胨20g， Yeast extract 10 g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升)CuS04 '5H2O2.0g， Nal'2H2O0.1g， MnS04 H203.0 g， Na2Mo04 '2恥0.2 g， H3B03 0.02 g， CoCl2 *6 H20 1.05 g，ZnCl2 7.0 g， Fe2(S04)3 7 H20 22 g (可FeS04 7 H20 11. 6 g代替)，生物素0.2 g，硫酸1 ml)，在50 L生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C ， pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900 r/min，通氣量20—30 L/min;發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速而控制溶氧20—30%。發(fā)酵30 h后離心收獲上清進(jìn)行純化葡聚糖內(nèi)切酶。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法，其特征在于，其具體步驟如下1)、首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2)、在pGAP啟動(dòng)子的基因序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化為畢赤酵母基因組；3)、根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；4)、將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28～30℃在生物反應(yīng)器中發(fā)酵工程菌1～2d分泌表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶，在發(fā)酵過(guò)程中用氨水維持pH在4～6；所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7 H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下組分組成CuSO4·5H2O 1.5～2.5g/L，NaI·2H2O0.1～0.2g/L，MnSO4·H2O 2.5～3.5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1～0.3g/L，H3BO3 0.01～0.03g/L，CoCl2·6H2O 1.0～2.0g/L，ZnCl2 6.5～7.5g/L，F(xiàn)e2(SO4)3·7H2O 20～25g/L，生物素0.1～0.3g/L，硫酸1～2ml/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)葡聚 糖內(nèi)切酶的方法，其特征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡 萄糖、乳酸或甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；構(gòu)建由pGAP調(diào)控葡聚糖內(nèi)切酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組；根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌分泌表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)的葡聚糖內(nèi)切酶有利于產(chǎn)物的純化，解決應(yīng)用天然產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶的菌株生產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化等的問(wèn)題，有利于葡聚糖內(nèi)切酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101624602SQ20091015923
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者直 屈, 屠發(fā)志, 張?zhí)碓? 張愛(ài)聯(lián), 易國(guó)輝, 羅進(jìn)賢 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所