專(zhuān)利名稱(chēng)：一種木聚糖酶及重組表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種木聚糖酶及重組表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母工程菌。
背景技術(shù)：
阿拉伯木聚糖也叫戊聚糖或木聚糖，它的主要成分為阿拉伯糖和木糖。根據(jù)阿拉伯木聚糖是否溶于水，分為水不可溶性阿拉伯木聚糖和水溶性阿拉伯木聚糖。谷物中一般含有5% 10%的細(xì)胞壁物質(zhì)，這些細(xì)胞壁物質(zhì)主要由非淀粉多糖(NSP)組成。而在NSP中，阿拉伯木聚糖占主要部分(一般占谷物)的6. 5% 12.2%，雖然阿拉 伯木聚糖在谷物中的含量通常不高，但它卻是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要成分。阿拉伯木聚糖是小麥細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)性多糖，具有高黏度、高分子量和氧化膠凝等物化特性，與其他非淀粉多糖(3-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、纖維素和木質(zhì)素等)一起共同構(gòu)成了小麥各組織的細(xì)胞壁，成為細(xì)胞骨架的重要組分。面粉中存在著非淀粉多糖、戊聚糖，主要是阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖肽，其中阿拉伯木聚糖占戊聚糖60% 70%。一般小麥含阿拉伯木聚糖約2%，其中水溶性的為
0.5% 0. 8%，水溶性戊聚糖的持水力很強(qiáng)，一般能吸水達(dá)10 20倍。在面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能增加面團(tuán)的持水性。試驗(yàn)證明，在面粉中添加木聚糖酶，能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶、改進(jìn)面團(tuán)的機(jī)械強(qiáng)度和增加面包的體積、改進(jìn)面包的色澤。一般情況下，面粉中存在著內(nèi)源酶，能使15% 20%的不溶性戊聚糖溶解。但加入外來(lái)的酶，可使溶解量增至40% 65%。木聚糖酶是一種專(zhuān)一性的戊聚糖酶。作用于面粉中的可溶及不可溶性的戊聚糖，木聚糖酶對(duì)水不溶性戊聚糖起到增溶效果，一定程度上減小了水不溶性戊聚糖的消極影響，吸水性強(qiáng)，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)膜的強(qiáng)度和彈性，可以提高面筋的彈性，增強(qiáng)對(duì)過(guò)度攪拌的耐受力，改善面團(tuán)的可操作性及穩(wěn)定性，在烘烤時(shí)降低二氧化碳的擴(kuò)散速度，氣體分布均勻，大小和穩(wěn)定性都有所改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶及重組表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，即利用基因工程技術(shù)手段，將瘤胃真菌(Orpinomyces)的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，構(gòu)建畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達(dá)木聚糖酶，且生產(chǎn)的木聚糖酶在酸性偏中性條件下具有較高的活性，能有效提高面團(tuán)的延伸性和發(fā)酵性能，可廣泛應(yīng)用于烘培領(lǐng)域。本發(fā)明的木聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。用于編碼上述木聚糖酶的核苷酸，其一種序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明涉及一種畢赤酵母工程菌，為畢赤酵母El (Pichia pastoris El),該工程菌攜帶有能表達(dá)瘤胃真菌木聚糖酶基因的表達(dá)載體，已于2012年11月27日，保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為=CCTCC NO M 2012481。
本發(fā)明另一方面涉及上述畢赤酵母工程菌的應(yīng)用，用于生產(chǎn)木聚糖酶，所述木聚糖酶在酸性偏中性條件下適用。本發(fā)明另一方面涉及上述木聚糖酶在烘焙中的應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建了高效表達(dá)瘤胃真菌木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌，其生產(chǎn)的木聚糖酶在酸性偏中性范圍內(nèi)具有較高的酶活性，最適PH值為6.0，在PH5. 0-7. 5的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性；最適反應(yīng)溫度為50°C，在溫度40-60°C的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。本發(fā)明的重組表達(dá)木聚糖酶能有效提高面團(tuán)的延伸性和發(fā)酵性能，可廣泛應(yīng)用于烘培領(lǐng)域。


圖1 :木聚糖酶基因XynEl的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2 :構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPIC9K_XynEl示意圖。圖3 :畢赤酵母工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳圖，箭頭所示為重組木聚糖酶XYNEI。圖4 :重組木聚糖酶XYNEl的發(fā)酵曲線(xiàn)。圖5 :重組木聚糖酶XYNEl的pH特性分析。圖6 :重組木聚糖酶XYNEl的反應(yīng)溫度分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明。但實(shí)例僅限于說(shuō)明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫(xiě)的《分子克' 實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實(shí)施例1、瘤胃真菌木聚糖酶基因的克隆查閱GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶11家族中的一個(gè)木聚糖酶基因，該基因來(lái)源于瘤胃真菌(Orpinomyces) ,GenBank號(hào)為AAD04194.1。通過(guò)上海捷瑞生物工程有限公司合成該木聚糖酶基因，命名為XynEl，合成基因的基因序列為SEQ ID NO. 2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.1。采用PCR反應(yīng)克隆木聚糖酶基因XynEl片段，引物和反應(yīng)條件如下引物I (F) GCGCGAATTCAAGGCCCAATGGGGTGGAAACG引物2 (R) TAAAGCGGCCGCTTAAGAGGGAGCAGAACC反應(yīng)條件為94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)后，72°C保溫lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示，XynEl基因?yàn)榇笮?20bp的片段。實(shí)施例2、重組表達(dá)木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建1、表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆得到的木聚糖酶基因XynEl片段，用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，100 ill酶切體系如下木聚糖酶基因XynEl PCR產(chǎn)物40 ylUOXH buffer IOu I,IOXBSA IOu UEcoR I 5u l.Not I 5u UddH2O 30u I0 37°C酶切 4h 后，瓊脂糖凝膠電泳回收。將表達(dá)載體pPIC9K先用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I進(jìn)行單酶切，100 酶切體系如下表達(dá)載體 PPIC9K 20 ii 1、10XH buffer IOu l.EcoR I 5u l,ddH2 065 u I0 37°C酶切 4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。將回收片段再用限制性?xún)?nèi)切酶Not I進(jìn)行單酶切，IOOiU酶切體系如下pPIC9K 回收片段 20 ii l、10XHbuffer IOu 1U0XBSA IOu IUOXTriton IOy1、Not I 5 u UddH2O 45 yl。37°C酶切4h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的XynEl片段與表達(dá)載體pPIC9K相連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-XynEl，如圖2所示。連接體系如下:表達(dá)載體pPIC9K 5 iil、XynEl片段3 yl、IOXT4 ligase buffer Iu UT4 ligase I 。22C 連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 a，挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，即為重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-XynEl。2、轉(zhuǎn)化與篩選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_XynEl用Sal I進(jìn)行線(xiàn)性化，線(xiàn)性化片段用柱純化試劑盒純化后，通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生長(zhǎng)出的菌落即為畢赤酵母工程菌株，然后涂布含不同濃度遺傳霉素的YPD平板上篩選多拷貝的轉(zhuǎn)化子。3、發(fā)酵驗(yàn)證挑取單個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)Id后，再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，300C，250rpm振蕩培養(yǎng)，每天添加0. 5%的甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)4d后，離心去除菌體，將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，工程菌表達(dá)的木聚糖酶XYNEl分子量為26kDa左右。將該陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為Pichia pastoris E1，并于2012年11月27日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)為CCTCC NO M2012481o將上清液進(jìn)行木聚糖酶活力測(cè)定，結(jié)果顯示，搖瓶水平下工程菌中木聚糖酶XYNQl的表達(dá)量達(dá)到227U/ml。木聚糖酶酶活力檢測(cè)方法如下取2ml濃度為I %的木聚糖底物(pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經(jīng)pH5. 5乙酸乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑，混勻以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻后，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)e。酶活單位定義在370C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放I U mol還原糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位U。酶活計(jì)算公式x丨尸[(& - Ab) X K + C0] x N x 1000
Mxt式中XD為稀釋酶液中木聚糖酶的活力，U/ml ；Ae為酶反應(yīng)液的吸光度；Ab為酶空白液的吸光度；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率A為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的截距；M為木糖的摩爾質(zhì)量，150. 2g/mol ；t為酶解反應(yīng)時(shí)間，min ;N為酶液稀釋倍數(shù)；1000為轉(zhuǎn)化因子，Immol = 1000 Umol0實(shí)施例3畢赤酵母工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用
在10升發(fā)酵罐上進(jìn)行上述畢赤酵母工程菌的發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基配方硫酸鈣1. lg/L、磷酸二氫鉀5. 5g/L、磷酸二氫銨55g/L、硫酸鉀20. 3g/L、硫酸鎂16. 4g/L、氫氧化鉀1. 65g/L、消泡劑0. 05%。發(fā)酵生產(chǎn)工藝pH值5.0、溫度30°C、攪拌速率300rpm、通風(fēng)量1. 0-1. 5 (v/v)、溶氧控制在20%以上。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為三個(gè)階段第一階段為保藏編號(hào)為CCTCC NO M2012481的工程菌的菌體培養(yǎng)階段，按7%比例接入種子，30°C培養(yǎng)24-26h，以補(bǔ)完葡萄糖為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上，表明該階段結(jié)束，為期約30-60min ;第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加甲醇誘導(dǎo)，并且保持溶氧在20%以上，培養(yǎng)時(shí)間在150-180h之間。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液通過(guò)板框過(guò)濾機(jī)處理后獲得粗酶液。通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間段發(fā)酵液中的菌體量和木聚糖酶XYNEl的酶活，制得發(fā)酵進(jìn)程曲線(xiàn)。結(jié)果如圖4所示，畢赤酵母工程菌最終的發(fā)酵酶活能達(dá)到2800U/ml，而且傳代后也能穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例4木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定1、最適反應(yīng)pH的測(cè)定采用pH值分別為2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，PH值分別為8. 0,9. O、10. 0的硼酸-硼砂緩沖液，將發(fā)酵的上清液進(jìn)行稀釋測(cè)定，木聚糖底物也分別用對(duì)應(yīng)PH值的緩沖液配制，在37°C下分別進(jìn)行木聚糖酶活力測(cè)定，計(jì)算酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線(xiàn)。結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明生產(chǎn)的木聚糖酶XYNEl最適反應(yīng)pH值為6. 0，為酸性木聚糖酶。2、最適反應(yīng)溫度的測(cè)定在pH5. 5 條件下，分別測(cè)定 30°C、35 V、40°C、45 V、50°C、55 V、60 V、65 V溫度時(shí)
發(fā)酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線(xiàn)。結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明生產(chǎn)的木聚糖酶XYNEl最適反應(yīng)溫度為50°C。實(shí)施例5重組表達(dá)的木聚糖酶在烘焙中的應(yīng)用一、重組表達(dá)木聚糖酶在饅頭粉中的應(yīng)用在饅頭粉中添加2-10PPM本發(fā)明重組表達(dá)的木聚糖酶，做成饅頭，冷卻后，測(cè)定饅
頭的相關(guān)指標(biāo)，具體指標(biāo)見(jiàn)下表
權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.編碼權(quán)利要求1所述木聚糖酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3.用于重組表達(dá)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，其保藏編號(hào)為CCTCC 2012481。
4.權(quán)利要求3所述的畢赤酵母工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的木聚糖酶在烘焙中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種重組表達(dá)木聚糖酶的畢赤酵母工程菌及其應(yīng)用。所述工程菌攜帶有能表達(dá)瘤胃真菌的木聚糖酶基因的表達(dá)載體，其重組表達(dá)的木聚糖酶在酸性偏中性范圍內(nèi)具有較高的酶活性，最適作用pH為6.0，在pH5.0-7.5的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性，最適反應(yīng)溫度為50℃，在溫度40-60℃的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。本發(fā)明的木聚糖酶可廣泛應(yīng)用于烘培食品加工領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102994480SQ20121050893
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者肖志壯, 徐曉東, 李冬冬, 王海, 劉安邦 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司