專利名稱：與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWDI5-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和農(nóng)作物抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RPSWD15-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaμ fmann & Gerdemann)引起的大豆疫霉根腐病是危害大豆生產(chǎn)的主要病害之一。近年來，該病害在大豆主產(chǎn)區(qū)黑龍江省危害日益突出，危害大豆面積達(dá)15 X IO4公頃。該病害可在大豆的任何生育階段造成危害，一般田塊減產(chǎn)10-30%，嚴(yán)重地塊可達(dá)60-90%，甚至造成絕產(chǎn)，對大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。目前，大豆疫霉根腐病已經(jīng)成為威脅我國大豆生產(chǎn)的常見病害，所以對該病害的防治刻不容緩。
實(shí)踐證明，培育和種植抗病品種是最為安全、經(jīng)濟(jì)和有效的措施。為此，許多學(xué)者在篩選抗性資源及抗病基因定位方面做了大量的研究。研究表明，大豆對疫霉根腐病的抗性分為質(zhì)量性狀抗性(小種抗性)和數(shù)量性狀抗性。質(zhì)量性狀抗性由顯性基因控制，具有完全抗性。迄今，國外已在大豆基因組9個(gè)位點(diǎn)上鑒定了 15個(gè)抗大豆疫霉根腐病基因(Rps)， 即 Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld, Rpslk, Rps2, Rps3a, Rps3b, Rps3c, Rps4, Rps5, Rps6, Rps7, Rps8和 theRps gene in cv. Waseshiroge,分別位于大 基因組第 3，16, 13, 18, 18, 18, 3, 13 和3號染色體上(MLG(Sugimoto等，2012)。大豆疫霉根腐病在我國發(fā)生的歷史較短，抗病育種工作也剛剛起步。目前，我國只鑒定了 4個(gè)抗病基因 RpsYB30, RpsYD25, RpsZS18，RpsSNlO分別位于大豆基因組第19，3，2和13號染色體上(MLG L, N, Dlb和F)(范愛穎等，2009，孫石等，2011，姚海燕等，2010，于安亮等，2010，朱振東等， 2007)。我國大豆疫霉具有群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，適應(yīng)范圍廣和毒力變化快等特點(diǎn)，容易產(chǎn)生新的毒力型小種和克服品種抗性。一般認(rèn)為大豆疫霉根腐病基因的使用壽命為10-15年，但是新的抗病基因被克服的速度正在加快，如RpsS被鑒定后不到3年，就已發(fā)現(xiàn)了能夠克服其抗性的新的毒力型的大豆疫霉菌株。大量研究表明國外已鑒定的15個(gè)抗病基因中(除 the Rps gene in cv. Waseshiroge外)，除Rpslc和Rpslk外，都不能有效抵抗我國病區(qū)的大豆疫霉種群。因此，有必要大力挖掘和利用新的抗性資源并不斷地進(jìn)行抗病基因的累加， 培育抗性持久的大豆品種。
為挖掘新的大豆抗性資源，大多數(shù)學(xué)者借助SSR分子標(biāo)記(http://soybase.org) 進(jìn)行抗病基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種。該類標(biāo)記具有高信息量、可靠性強(qiáng)、簡便和快速等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的應(yīng)用。此外利用已公布的大豆基因組序列(http://www. Phytozome. net)開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，可以對基因進(jìn)行精細(xì)定位，獲得基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。
大豆品種皖豆15是安徽省潘村湖農(nóng)場農(nóng)科所用蒙慶13經(jīng)輻射后系統(tǒng)選育而成的，于1996年通過安徽省品質(zhì)審定。該品種對大豆病毒病和霜霉病具有高抗性(李俊山 2007)。前期研究結(jié)果表明，該品種對不同毒力型的兩個(gè)大豆疫霉菌株P(guān)sMCl和PsMC2均有較強(qiáng)的抗性(朱振東等，2001)。陳曉玲等(2008)和夏長劍等(2011)再次報(bào)道皖豆15對大豆疫霉菌株具有廣譜抗性，推測其可能含有新的抗病基因。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記，其中，所述候選基因RpsWD15-l位于大豆第17號染色體上，且位于標(biāo)記 Sattwdl5-24/25和Sattwdl5_47之間，與這兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為O. 5cM和O. 8cM。
所述分子標(biāo)記為Sattwdl5_28，含重復(fù)基序(AT) 23，且用于擴(kuò)增分子標(biāo)記 Sattwdl5-28的PCR引物對為
上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和
下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。
分子標(biāo)記Sattwdl5_28與候選基因RpsWD15_l的遺傳距離為OcM。
PCR擴(kuò)增使用的退火溫度優(yōu)選為48°C，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為123bp。
其中，候選基因RpsWD15_l的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明還提供用于檢測與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記Sattwdl5-28的PCR引物對，包括
上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和
下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。
本發(fā)明還提供與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在鑒定抗疫霉根腐病大豆品種中的應(yīng)用，其包括步驟1)提取待測大豆的基因組DNA ;2)以待測大豆的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求4所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能夠擴(kuò)增出123bp的產(chǎn)物，則判定為抗疫霉根腐病大豆品種。
其中,PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以20 μ I計(jì)為大豆基因組DNA模板濃度2ng/y L, 10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，四種dNTP濃度各為20 μ mol/L，上、下游引物濃度各為O. 2ymol/ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5U,用 ddH20 補(bǔ)足至 20 μ I。
PCR反應(yīng)使用的條件為95°C 3分鐘；94°C 50秒，48°C 50秒，72°C 50秒，35個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。
本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于檢測抗疫霉根腐病大豆的試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的一種或多種。
本發(fā)明還提供上述與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在植物分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供上述與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在大S·抗疫霉根腐病分子育種中的應(yīng)用。
具體地，本發(fā)明的與大S·抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分尚的分子標(biāo)記及候選基因RpsWD 15-1是通過以下方法獲得的
利用WilliamsX皖豆15雜交組合衍生的F2:3群體作為作圖群體，研究皖豆15對大豆疫霉根腐病抗性的遺傳基礎(chǔ)；利用已公布的大豆SSR標(biāo)記，篩選與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記；利用大豆基因組序列信息，開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對該基因進(jìn)行精細(xì)定位，同時(shí)獲得與該基因共分離的分子標(biāo)記。從而為抗大豆抗疫霉根腐病育種提供輔助選擇，提高育種效率，加速抗疫霉根腐病育種工作進(jìn)程。
具體技術(shù)方案
( I)皖豆15的抗性遺傳分析
以抗病品種皖豆15作為父本，感病品種Williams (rps)作為母本，雜交產(chǎn)生F1 代，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代，F(xiàn)2代自交產(chǎn)生的102個(gè)F2:3家系抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方法，每個(gè)家系鑒定20-30個(gè)植株對大豆疫霉菌株P(guān)sMCl的反應(yīng)進(jìn)行抗性遺傳分析。接種后在25°C，濕度為80-100%條件下，保濕48h，然后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)，6d后進(jìn)行病情調(diào)查。參照Gordon等(2006)方法評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查F2:3家系的抗、分離、 感病家系的分尚比，研究院S· 15對疫霉根腐病的抗性遺傳規(guī)律。
(2)基因DNA的提取和抗感池構(gòu)建
采用CTAB法提取2個(gè)親本及102個(gè)F2:3家系的基因組DNA。每個(gè)F2:3家系分別取 20個(gè)單株葉片樣品，等量混合提取DNA。按照Michelmore等(1991)取10個(gè)抗病、感病家系構(gòu)建用于分離群體分組分析(Bulk Segregating Analysis, BSA)的抗、感池。
(3)利用SSR標(biāo)記定位皖豆15的抗病基因
大豆SSR標(biāo)記序列來源于http://soybase. org。隨機(jī)選取SSR標(biāo)記在院豆15 和Williams之間，抗感池之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增和多態(tài)性篩選。PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，含有 10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，四種dNTPs各20 μ mol/L, TaqDNA聚合酶O. 5U，上、下游引物分別為 O. 2 μ mol/L,模板 DNA 濃度為 2ng/ μ L。
PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序，95°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性50秒，47-51 °C退火50秒，72°C延伸50秒，從變性至延伸共設(shè)35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在8-12% 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳和分析。
(4)抗病基因的精細(xì)定位
為使該基因更有效和更精確地應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇育種工作中，利用已公布的大豆基因組序列信息，開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對該基因進(jìn)行精細(xì)定位。在利用soybase 數(shù)據(jù)庫內(nèi)已公布的SSR標(biāo)記將抗病基因初步定位的基礎(chǔ)上，首先在Phytozome數(shù)據(jù)庫內(nèi) (http://www. phytozome. net/soybean)下載與該基因連鎖的兩個(gè)標(biāo)記區(qū)間的序列,然后用 SSR Hunter1. 3 (http://en. bio-soft. net/dna/SSRHunter)尋找 SSR 位點(diǎn)，最后用軟件 Primer Premier 5. O (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA)設(shè)計(jì) SSR 弓I物。 PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法參照(3)中的描述。
對具有多態(tài)性的SSR引物，進(jìn)行F2:3群體驗(yàn)證。在F2:3群體中，與皖豆15基因型相同的SSR引物記為AA，與Wi 11 i ams基因型相同的SSR引物記為BB，雜合基因型記為AB。
(5)數(shù)據(jù)分析
對F2:3群體抗性分離及SSR標(biāo)記在F2:3家系中的分離模式進(jìn)行X 2檢驗(yàn)。用Joinmap 4.0 (Van Ooijen 2006)軟件分析SSR標(biāo)記與抗病基因的連鎖關(guān)系。
大S·疫霉根腐病是影響大S·生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害。本發(fā)明是利用SSR分子標(biāo)記方法，首次在大豆第17號染色體上定位了一個(gè)新的抗病候選基因RpsWD15-l并獲得了與該抗病基因RpsWD15-l共分離及緊密連鎖的分子標(biāo)記。該抗病基因具有廣譜抗性，可有效控制我國大豆疫霉根腐病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失。利用與該基因共分離的SSR標(biāo)記Sattwdl5-28，能夠有效地應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇育種工作中，克服常規(guī)育種方法所需要的周期長的缺點(diǎn)；基于PCR技術(shù)，在室內(nèi)對大豆資源進(jìn)行抗性分析；同時(shí)為克隆該基因奠定基礎(chǔ)，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，這對于進(jìn)一步了解該基因的分子遺傳學(xué)機(jī)理具有重要意義，在大豆生產(chǎn)實(shí)踐、育種工作和抗病理論研究中具有很重要的價(jià)值。其優(yōu)點(diǎn)在于
(一)本發(fā)明首次在大豆第17號染色體上定位了一個(gè)新的抗大豆疫霉根腐病候選基因RpsWD15-l。該基因是在對我國毒力較強(qiáng)的大豆疫霉菌株P(guān)sMCl (毒力型 la, lc, Ik, 2，3b, 3c, 4，5，6，7，8，ZS18)具有完全抗性的大豆品種皖豆15中獲得。同時(shí)，該基因?qū)ξ覈蠖挂呙咕哂袕V譜抗性，可有效控制我國大豆疫霉根腐病的發(fā)生，減輕該病害造成的產(chǎn)量損失。
(二)本發(fā)明的與候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記Sattwdl5_28，是在皖豆 15及其抗性穩(wěn)定的雜交后代家系中獲得的新的標(biāo)記，可以用于大豆疫霉根腐病品種鑒定和大豆抗病后代的分子標(biāo)記輔助選擇育種。
(三)本發(fā)明的與候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記Sattwdl5-28，為該基因的克隆和測序奠定基礎(chǔ)，從而明確該序列信息和結(jié)構(gòu)特征。同時(shí)，根據(jù)共分離的分子標(biāo)記和大豆基因組序列信息，進(jìn)行該基因的單倍型分析 ，有望克隆到新的抗病基因。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中接種大豆疫霉PsMCl菌株6d后，皖豆15及Williams的生長情況。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中大豆疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l及其連鎖的SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實(shí)施例1大豆抗疫霉根腐病新的候選基因RpsWD15_l及其共分離的分子標(biāo)記 Sattwdl5-28 的獲得
1.1皖豆15的抗性遺傳分析
以抗病品種皖豆15作為父本，感病品種Williams (rps)作為母本，配制雜交組合產(chǎn)生F1代，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代，F(xiàn)2代自交產(chǎn)生的102個(gè)F2:3家系作為抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方法，每個(gè)家系鑒定20-30個(gè)植株對菌株P(guān)sMCl 的反應(yīng)進(jìn)行抗性遺傳分析。接種后在25°C，濕度為80-100%條件下，保濕48h，然后轉(zhuǎn)入溫室培養(yǎng)，6d后進(jìn)行病情調(diào)查。參照Gordon (2006)等方法評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，即植株死亡率小于20% 的家系為純和抗病家系，死亡率大于80%的家系為純和感病家系，而死亡率為21-79%的家系為抗性分離家系，調(diào)查F2:3家系的抗、分離、感病家系的分離比，研究皖豆15對疫霉根腐病的抗性遺傳規(guī)律(圖1)。
102個(gè)WiIliams X皖豆15雜交組合衍生的F2:3家系對菌株P(guān)sMCl的抗性鑒定結(jié)果表明，31個(gè)家系為純和抗病，42個(gè)家系為雜合型，29個(gè)家系為感病，經(jīng)X 2檢驗(yàn)分離符合期望的1:2:1，表明皖豆15對大豆疫霉菌株P(guān)sMCl的抗性是由一個(gè)顯性單基因控制，將該候選基因命名為RpsWD15。
1. 2大豆基因組DNA的提取和抗感池構(gòu)建
采用CTAB法提取2個(gè)親本及102個(gè)F2:3家系的基因組DNA。每個(gè)F2:3家系分別取 20個(gè)單株葉片樣品，等量混合放入2. OmL的離心管中。置于液氮中研磨成粉末狀，向離心管中加入800 μ L65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后于65°C水浴中保溫30-50分鐘，不時(shí)搖動(dòng)以免成團(tuán)；取出離心管，冷卻至室溫，加入800yL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，抽提10 分鐘，期間每隔一段時(shí)間輕輕顛倒，使其充分混勻，12000rpm離心10分鐘；取上清液到另一1. 5mL離心管中，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勻10分鐘后，12000rpm離心10 分鐘；取上清液到另一1. 5mL離心管中，加入O. 8倍體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，于-20°C 下放置30-60分鐘，使DNA以沉淀析出；挑出DNA沉淀轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中，用75%酒精洗滌2次,最后用無水乙醇脫水，吹干,加入適量滅菌的超純水。DNA溶解后，用O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，將DNA濃度調(diào)整至 40ng/μ L0
按照Michelmore等(1991)等方法構(gòu)建用于分離群體分組分析(Bulk Segregating Analysis, BSA) 的抗、感池。各取I μ L的10個(gè)抗病家系的DNA混合于一個(gè)新的離心管中，構(gòu)建成抗池，并將DNA濃度調(diào)整至40ng/ μ L。感池構(gòu)建方法參照抗池構(gòu)建方法。
1. 3利用SSR標(biāo)記定位皖豆15的抗病基因
大豆SSR標(biāo)記序列來源于http://soybase. org。隨機(jī)選取SSR標(biāo)記在院豆15和 Williams之間及抗感池之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增和多態(tài)性篩選。
PCR 反應(yīng)體系為 20 μ 1，含有 10XPCR 緩沖液 2. 5 μ 1，四種 dNTPs 各 20 μ mol/L, TaqDNA聚合酶O. 5U，上、下游引物分別為O. 2 μ mol/L,模板DNA濃度為2ng/ μ L。
PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序，95°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性50秒，47-51 °C退火50秒，72°C延伸50秒，從變性至延伸共設(shè)35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。
PCR產(chǎn)物檢測，按照1:5的比例，將4 μ I的6 X上樣緩沖液加入到PCR產(chǎn)物中，混合后擴(kuò)增產(chǎn)物在8-12%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳和分析。
隨機(jī)選取大豆上的SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)來自第17號染色體上的21對SSR標(biāo)記在兩親本間具有多態(tài)性。將這21個(gè)標(biāo)記用于抗感池檢測多態(tài)性，其中只有9個(gè)標(biāo)記產(chǎn)生多態(tài)性，它們可能與抗病基因連鎖。進(jìn)一步用102個(gè)WilliamsX皖豆15雜交組合衍生的F2:3家系對這 9個(gè)標(biāo)記進(jìn)行連鎖驗(yàn)證，結(jié)果表明來源于第17號染色體上的9個(gè)標(biāo)記Sat_222，Sat_292, Sa tt514, Satt461, Satt528, Satt574, Satt543, Satt615 和 Satt301 與 RpsffD15 連鎖。這 9 個(gè)標(biāo)記在群體中均呈1:2:1分布,為共顯性標(biāo)記。用Joinmap 4. O軟件分析表明，RpsWD15_l 基因與這9個(gè)標(biāo)記連鎖，且位于標(biāo)記Satt543和Satt615之間，與這兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為 2. 2cM 和 7. 2cM。
1. 4抗病基因的精細(xì)定位
為使該基因更有效和更精確地應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助選擇育種工作中，利用已公布的大豆基因組序列開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對該基因進(jìn)行精細(xì)定位。在Phytozome數(shù)據(jù)庫內(nèi)(http://www.phytozome.net/soybean)比對分析可知，Satt543 和 Satt615 之間物理距離為 4. 29Mb 并下載該區(qū)段序列；用 SSR Hunter1. 3 (http://en. bio-soft, net/dna/ SSRHunter)共尋找到671個(gè)SSR位點(diǎn)，其中大于10個(gè)重復(fù)基序的SSR位點(diǎn)有414個(gè)；用軟件Primer Premier 5. O (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA)在這 414 個(gè) SSR 位點(diǎn)上設(shè)計(jì)引物，最中獲得414個(gè)SSR標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序和檢測方法參照(3) 中的描述。
采用BSA方法，共得到17個(gè)多態(tài)性的SSR標(biāo)記，可能與抗病基因連鎖。進(jìn)一步用 102個(gè)WilliamsX皖豆15雜交組合衍生的F2:3家系對這17個(gè)標(biāo)記進(jìn)行連鎖驗(yàn)證(表I)。 結(jié)果表明，這17個(gè)標(biāo)記在群體中均呈1:2:1分布，為共顯性標(biāo)記。
表I根據(jù)大豆基因組序列設(shè)計(jì)和與候選基因RpsWD15_l連鎖的分子標(biāo)記信息·
權(quán)利要求
1.與大豆抗疫霉根腐病候選基因RPSWD15-1共分離的分子標(biāo)記，其特征在于，所述候選基因RpsWD15-l位于大豆第17號染色體上，且位于標(biāo)記Sattwdl5_24/25和Sattwdl5_47 之間，與這兩個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為O. 5cM和O. ScM ；所述分子標(biāo)記為Sattwdl5-28,含重復(fù)基序(AT) 23,且用于擴(kuò)增分子標(biāo)記Sattwdl5_28 的特異性PCR引物對為上游引物 F : 5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物 R : 5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，PCR擴(kuò)增使用的退火溫度為48°C，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為123bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于，所述候選基因RpsWD15-l的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.用于檢測與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15-l共分離的分子標(biāo)記Sattwdl5-28 的特異性PCR引物對，其特征在于，包括上游引物 F : 5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物 R : 5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。
5.權(quán)利要求1所述與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15-l共分離的分子標(biāo)記在鑒定抗疫霉根腐病大豆品種中的應(yīng)用，其包括步驟1)提取待測大豆的基因組DNA；2)以待測大豆的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求4所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能夠擴(kuò)增出123bp的產(chǎn)物，則判定為抗疫霉根腐病大豆品種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以 20 μ I計(jì)為大豆基因組DNA模板濃度2ng/ μ L，10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，四種dNTP濃度各為20ymol/L，上、下游引物濃度各為O. 2ymol/L，Taq DNA聚合酶O. 5U，用ddH20補(bǔ)足至 20 μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的條件為95°C3 分鐘；94°C 50 秒，48°C 50 秒，72°C 50 秒，35 個(gè)循環(huán)；72°C 10 分鐘。
8.含有權(quán)利要求4所述引物對的用于檢測抗疫霉根腐病大豆的試劑盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的一種或多種。
10.權(quán)利要求1所述與大S·抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分尚的分子標(biāo)記在大 S·抗疫霉根腐病分子育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，以抗病品種皖豆15作為父本，感病品種Williams(rps)作為母本，雜交產(chǎn)生F1代，通過自交產(chǎn)生F2:3群體作為作圖群體，用已公布的大豆SSR標(biāo)記和根據(jù)大豆基因組序列開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對皖豆15含有的抗病基因進(jìn)行遺傳作圖和精細(xì)定位?？共』騌psWD15-1被定位在第17號染色體上，位于標(biāo)記Sattwd15-24/25(0.5cM)和Sattwd15-47(0.8cM)之間。同時(shí)，還獲得與基因RpsWD15-1共分離的分子標(biāo)記Sattwd15-28。該標(biāo)記可用于大豆抗疫霉根腐病的輔助選擇育種中。
文檔編號C12N15/11GK102994498SQ20121050916
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者朱振東, 張吉清, 王曉鳴, 夏長劍, 段燦星 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所