用于測定大豆疫霉菌無毒基因Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及設(shè)及一種分子測定方法，尤其設(shè)及用于測定大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆疫霉菌侵染大豆引起的大豆根腐病是世界范圍內(nèi)威脅大豆生產(chǎn)的主要病害 之一。大豆根腐病于1948年在美國的印地安那州首次被發(fā)現(xiàn)，而后在大豆的主要生產(chǎn)國都 相繼發(fā)現(xiàn)了該病害。我國1989年由沈崇堯和蘇彥純首次在東北大豆主產(chǎn)區(qū)分離到大豆疫霉 菌，之后在黑龍江省、吉林省和北京市也相繼發(fā)現(xiàn)有大豆疫霉菌，近幾年山東、安徽、河南、 江蘇、浙江、內(nèi)蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和貴州等15個(gè)省(市區(qū)）也相繼被報(bào)道分離 鑒定到大豆疫霉菌。其中在黑龍江和福建兩省發(fā)生較為嚴(yán)重，目前仍是我國重要的對外檢 疫對象。
[0003] 大豆疫霉菌的進(jìn)化速度較快，生理小種分化十分復(fù)雜，美國目前已鑒定到55個(gè)生 理小種和更多未正式定名生理小種的致病型;我國已發(fā)現(xiàn)1號、3號、8號、9號、11號、15號、17 號、21號、24號等10個(gè)生理小種，其中1號生理小種為黑龍江省的優(yōu)勢小種，同時(shí)也鑒定到大 量的未定名生理小種的致病型。
[0004] 目前防治大豆疫霉根腐病最有效的方法是種植抗病品種，而想要準(zhǔn)確使用大豆抗 病品種就需要明確待檢測大豆疫霉菌(指定地區(qū)分離的大豆疫霉菌）的毒性組成（即生理小 種的組成）；而目前生理小種的測定主要采用帶有14個(gè)抗病基因（Rpsla，Rpslb，Rpslc， I?psld,I?pslk,I?ps2,I?ps3a,I?ps3b,I?ps3c,I?ps4,Rps5,1?ps6,1?ps7 和化s8)的一套近等基因系 鑒別寄主進(jìn)行下胚軸創(chuàng)傷接種測定，該方法雖然簡單易行，但測定周期長、工作強(qiáng)度大、容 易出現(xiàn)中間類型，不適合高通量的生理小種鑒定；因此尋求一種能夠快速、準(zhǔn)確、高通量測 定大豆疫霉菌毒性組成的方法是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。
[0005] 與本發(fā)明相關(guān)的公知常識：公知常識（1):病原菌攜帶有無毒基因或毒性基因，鑒 別寄主攜帶有抗病基因或感病基因，其中無毒基因與毒性基因是一對等位基因，抗病基因 和感病基因是一對等位基因；當(dāng)攜帶有無毒基因的病原菌侵染攜帶有對應(yīng)抗病基因的鑒別 寄主時(shí)，抗病基因與無毒基因互作使鑒別寄主表現(xiàn)為抗??；當(dāng)攜帶有無毒基因的病原菌侵 染攜帶有感病基因的鑒別寄主時(shí)，鑒別寄主表現(xiàn)為感??；當(dāng)攜帶有毒性基因的病原菌侵染 鑒別寄主時(shí)，不管鑒別寄主是否攜帶有抗病基因，均表現(xiàn)為感病。公知常識(2):對于無毒基 因與抗病基因的命名，國際上通常是先命名無毒基因，并將能與無毒基因互作使鑒別寄主 表現(xiàn)為抗病的基因命名為對應(yīng)的抗病基因；即理論上可能會(huì)存在多個(gè)抗病基因與同一個(gè)無 毒基因互作的情況，而實(shí)際上也確實(shí)如此，例如國際上最初認(rèn)為大豆疫霉中的無毒基因 Avr4和Avr6分別與大豆中的抗病基因化s4和化s6互作，但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Avr4和Avr6實(shí) 際上是同一個(gè)基因，改名為Avr4/6,抗病基因化s4和化s6均能與無毒基因 Avr4/6互作，分別 識別無毒基因 Avr4/6的不同部位來引發(fā)抗病反應(yīng)，由公知常識(2)分析，理論上可能會(huì)存在 多個(gè)抗病基因與無毒基因 Avr3a互作，即來源于不同抗病材料的抗病基因化s3a可能是完全 不同的抗病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于測定大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83- 570致病性的分子方法，該方法測定周期短、無中間類型、準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)測定多株大豆疫 霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83-570的致病性;為快速、準(zhǔn)確、高通量測定大豆疫霉菌毒 性組成奠定了基礎(chǔ)。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：用于測定大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法，采用CTAB法提取待檢測大豆疫霉菌的基因組 DNA;然后設(shè)計(jì)一對特異性引物并W提取的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的一對特異 性引物分別結(jié)合在無毒基因 Avr3a的上游和下游，從而使PCR擴(kuò)增出的DNA片段包括完整的 無毒基因 Avr3a;用限制性內(nèi)切酶BmgBI酶切擴(kuò)增出的DNA片段，得到酶切產(chǎn)物;對酶切產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；觀察酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 圖，如果在25化p-5(K)bp范圍內(nèi)有2條DNA條帶，則對應(yīng)的待檢測大豆疫霉菌菌株對鑒別寄主 L83-570表現(xiàn)為不致病;如果酶切后在750bp W下有1條DNA條帶，則對應(yīng)的待檢測大豆疫霉 菌菌株對鑒別寄主L83-570表現(xiàn)為致病。
[000引進(jìn)一步地，所述的一對特異性引物為AVR3A1F/AVR3A1R，其堿基序列分別為： AVR3A1F:5 -ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3 ; AVR3A1R:日-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3 。
[0009] 進(jìn)一步地，所述CTAB法提取待檢測大豆疫霉菌基因組DNA的具體步驟為： (1) 從培養(yǎng)5-7天的待檢測大豆疫霉菌菌落邊緣切取10-20塊直徑2 X 2mm菌絲塊，移入 裝有100ml澄清的10%V8液體培養(yǎng)基的Ξ角瓶中，置于25°C黑暗條件下、120r/min震蕩培養(yǎng) 5-7天，培養(yǎng)好的菌絲體用滅菌雙層紗布過濾收集，蒸饋水沖洗1次，經(jīng)冷凍干燥后充分搗碎 成菌絲粉； (2) 取50mg的菌絲粉于1.5ml EP管中，加入90化1質(zhì)量濃度為2%的CTAB提取液和90μ1 質(zhì)量濃度為10 %的SDS水溶液后縱滿混合器上充分混勻； (3) 55-60 °C水浴比，每15min振蕩混勻一次； (4 )1200化/min離屯、lOmin，取上清液A，加入苯酪、氯仿和異戊醇Ξ者的混合物抽提1 次，所加入的苯酪、氯仿和異戊醇Ξ者的混合物中苯酪、氯仿和異戊醇的重量比為25:24:1， 苯酪、氯仿和異戊醇Ξ者混合物的體積與上清液A的體積相等； (5 )1200化/min離屯、lOmin，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的體積與上清 液B的體積相等； (6) 1200化/min離屯、lOmin，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰無水乙醇過夜 沉淀基因組DNA，所加入NaAc水溶液和冰無水乙醇與上清液C的體積比為0.1:2:1; (7) 用預(yù)冷的體積比為70%的乙醇水溶液洗涂兩次，然后置于37°C條件下干燥； (8) 干燥后的DNA用100μΙ含50μg/ml核糖核酸酶的d地2〇溶解，37°C靜置化后，置于-20 °C冰箱中備用。
[0010] 進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件分別為： 擴(kuò)增體系:稀釋10倍的PCR反應(yīng)緩沖液，2.5μ1; 2.5mmol/L的MgCl2，1.扣1; 2.5mmol/L的 dNTPs，0.5μ 1; 5υ/μ 1 的Taq DM聚合酶，0.2μ 1; 1 ΟμL?ο 1 /L的特異性引物AVR3A1F和AVR3A1R各 0.化1;模板DM，0.5μ1;加無菌超純水至25μ1; 擴(kuò)增條件:95 °C變性30S，60 °C退火30S，72 °C延伸30S，30個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min。
[0011] 進(jìn)一步地，酶切前用AxyPr邱DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增出的DNA片段，所述 酶切的酶切體系和酶切條件分別為： 酶切體系:稀釋10倍的酶切緩沖液，2μ1; 5υ/μ1的Bm濁I酶，0.5μ1;用AxyPr邱DNA凝膠 回收試劑盒回收的DNA片段，6μ1;力時(shí)地2〇至20μ1; 酶切條件:37 °C溫育1.化，然后65 °C溫育20min失活。
[0012] 進(jìn)一步地，所述瓊脂糖凝膠電泳的條件為：1 %瓊脂糖凝膠，120V電壓下電泳 30min，用0.化g/ml漠化乙錠溶液染色，紫外燈下用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。
[0013] 有益效果：本發(fā)明提供了 一種用于測定大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主 L83-570致病性的分子方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物AVR3A1F/AVR3A1R能夠特異性的與模 版DNA無毒基因 Avr3a的上游和下游相結(jié)合，從而使擴(kuò)增出的DNA片段包含完整的無毒基因 Avr3a，并且在擴(kuò)增出的DNA片段中無毒基因 Avr3a兩端多余的堿基數(shù)量較為合理，既節(jié)約了 PCR擴(kuò)增所需的堿基，又能使后續(xù)的電泳效果更加明顯;本發(fā)明通過限制性內(nèi)切酶BmgBI酶 切待檢測大豆疫霉菌的無毒基因 Avr3a來間接測定待檢測大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒 別寄主L83-570的致病性，其測定周期短、無中間類型、準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)測定多株大豆疫霉 菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83-570的致病性，為大量、快速和準(zhǔn)確鑒定大豆疫霉菌的生 理小種提供有力支持;本發(fā)明通過對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來判斷無毒基因 Avr3a 是否被限制性內(nèi)切酶BmgBI切開，電泳圖為2條DNA條帶的顯然是被酶切成兩段的，即對鑒別 寄主L83-570表現(xiàn)為不致病。
【附圖說明】
[0014] 圖1、實(shí)施例所示5株待檢測大豆疫霉菌基因組DNA擴(kuò)增出的DNA片段被限制性內(nèi)切 酶Bm濁I酶切前后的瓊脂糖凝膠電泳圖，a圖表示酶切前，b圖表示酶切后； 圖2、實(shí)施例所示5株待檢測大豆疫霉菌基因組DNA擴(kuò)增出的DNA片段中無毒基因 Avr3a 的基因序列對比及酶切位點(diǎn)圖；點(diǎn)表示堿基與Avr3a(I)行堿基相同，短線表示與Avr3a(I) 行相比發(fā)生了堿基缺失； 圖3、試驗(yàn)中16株大豆疫霉菌基因組DNA擴(kuò)增出的DNA片段被限制性內(nèi)切酶Bm濁I酶切后 的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖1-圖3中:A表示不致病，V表示致病；I表示菌株P(guān)s0702，Π 表示菌株P(guān)s0301，虹表示菌 株P(guān)s0705，IV表示菌株P(guān)s0903，V表示菌株P(guān)s0302。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0016] 實(shí)施例 5株待檢測大豆疫霉菌：菌株P(guān)s0702(2007年分離），菌株P(guān)s0301(2003年分離），菌株 Ps0705(2007年分離），菌株P(guān)s0903(2009年分離），菌株P(guān)s0302(2003年分離），運(yùn)些菌株均為 采用大豆葉碟誘捕法從中國大豆田±壤中分離，然后經(jīng)過單抱分離進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接于10% V8斜面培養(yǎng)基上12 °C下保存，所述的10 % V8斜面培養(yǎng)基指，在lOOmL用紗布過濾后的V8蔬菜 汁中，加入〇.2g碳酸巧和15g瓊脂粉，加蒸饋水補(bǔ)足至lOOOmL，加熱使瓊脂完全融化，然后分 裝在Ξ角瓶中，121°C滅菌20min; 用于測定大豆疫霉菌無毒基因 Avr3a對鑒別寄主L83-570致病性的分子方法，分別對5 株待檢測大豆疫霉菌菌株進(jìn)行測定，具體測定方法包括W下步驟： 步驟一、采用CTAB法提取大豆疫霉菌的基因組DNA，提取基因組DNA的具體操作如下： (1) 從培養(yǎng)5-7天的待檢測大豆疫霉菌菌落邊緣切取10-20塊直徑2 X 2mm菌絲塊，移入 裝有100ml澄清的10%V8液體培養(yǎng)基（10%V8液體培養(yǎng)基指用蒸饋水稀釋10倍的V8蔬菜汁， V8蔬菜汁是美國Campbell公司生產(chǎn)的罐裝飲料，由番茄汁、胡蘿h汁、芹菜汁、歐芹汁、甜菜 汁、窩宦汁、西洋菜汁和渡菜汁8種蔬菜汁組成）的Ξ角瓶中，置于25°C黑暗條件下、120r/ min震蕩培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)好的菌絲體用滅菌雙層紗布過濾收集，蒸饋水沖洗1次，經(jīng)冷凍干 燥后充分搗碎成菌絲粉； (2) 取50mg的菌絲粉于1.5ml EP管中，加入