一種利用基因工程培育高異黃酮抗草甘膦大豆的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及利用基因工程培養(yǎng)植物領(lǐng)域，具體是一種利用基因工程培育高異黃酬 抗草甘麟大豆的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycine max)屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體（2η = 40)植物，在 世界各國(guó)廣泛種植，是世界上重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，也是食用油和植物蛋白的主要 來源。異黃酬作為豆科植物，特別是大豆中重要的黃酬類化合物，在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，植物與 微生物互相識(shí)別等方面起著重要的作用。有研究表明，大豆異黃酬是大豆組織對(duì)疫霉根腐 病菌（Phyto地thora megasperma f. sp. glycinea)侵染的反應(yīng)物質(zhì)。同時(shí)，異黃酬在大豆 與根瘤菌度radyrhizobium japonicum)互作的過程中起著一種信號(hào)分子的作用。
[0003] 近年來由于發(fā)現(xiàn)異黃酬在人體保健與疾病治療等方面有直接而有效的作用，受到 普遍重視。大量研究表明，異黃酬具有抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預(yù) 防和抑制白血病、骨質(zhì)疏松、癌癥等多種疾病的發(fā)生。許多流行病學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告 表明，大豆異黃酬可W有效地抑制乳腺癌、前列腺癌、白血病、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、胃癌等多 種癌癥的發(fā)生。大豆異黃酬可W促進(jìn)骨質(zhì)形成，保護(hù)骨質(zhì)不丟失，有效防治骨質(zhì)疏松癥。此 夕F，由于異黃酬和動(dòng)物雌激素17 β -雌二醇的結(jié)構(gòu)相似，是一類植物雌激素。因此，大豆異 黃酬還具有弱的雌激素活性，可改善婦女更年期癥狀。大豆異黃酬還具有一定的抗酸化能 力，能增強(qiáng)屯、肌收縮力，增加冠狀動(dòng)脈血流量。
[0004] 在高等植物中，異黃酬是通過苯基丙酸類（Phenylpropanoid)代謝途徑合成的。 異黃酬的12種成分中，大豆武原值ai化ein，7,4'-二徑基異黃酬）、染料木素（Genistein， 5,7,4' -Ξ徑基異黃酬）、黃豆素（Glycitein)是苯基丙酸類代謝途徑的主要分支產(chǎn)物， 并且W葡糖武-和丙二酷-葡糖武的形式膽存在液泡中。苯基丙酸類途徑中形成大豆武 原值ai化ein)的分支在大多數(shù)植物中都比較普遍，形成黃豆素（Glycitein)的途徑目前 研究還不是很清楚[42]。染料木素的合成與黃酬和花青素的合成有共同的前體抽皮素 (Naringenin，4, 5,7-Ξ徑黃燒酬）。在苯基丙酸類（Phenylpropanoid)途徑中，抽皮素 (Na;ringenin，4, 5, 7-Ξ徑黃燒酬）所設(shè)及的代謝途徑中形成Ξ徑基異黃酬（Genistein)的 異黃酬合成酶（Isoflavonesynthase,IF巧是異黃酬合成的關(guān)鍵限速酶基因。 陽(yáng)0化]紅Ξ葉（Tri化liumpratense)是豆科Ξ葉草屬多年生草本植物。富含異黃酬，其 中異黃酬含量為4 μ g/mg~6 μ g/mg，是大豆中異黃酬含量的1. 25~6倍，紅Ξ葉中的IFS 基因與大豆的IFS基因具有77%的同源性，其功能相似，但與大豆IFS相比具有更高的活 性。
[0006] 雜草控制是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中關(guān)鍵的措施。草甘麟是一種有機(jī)憐除草劑，具有高效、低 毒、殺草譜廣及低殘留等特點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的一種除草劑。植物體中有3種 芳香族必需氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸），它們的生物合成途徑中有一個(gè)關(guān)鍵性 酶--5-締醇丙酬酷莽草酸-3-憐酸合成酶巧-enolpyryv}d stdkimic acid-3-phosphate chorismate synthase, EPSP巧。草甘麟能夠與EPSPS蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制 該酶的活性，阻斷植物莽草酸途徑，導(dǎo)致苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族必需氨基酸的 生物合成受阻，從而使莽草酸過度積累而影響植物正常生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致死亡。草甘麟屬于非 選擇性、滅生性除草劑，只能用于播種前雜草控制。從抗高濃度草甘麟的微生物中分離獲得 的草甘麟不敏感EPSPS蛋白編碼基因，能夠有效的提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)于草甘麟的抗性，從 而擴(kuò)大草甘麟的使用范圍，降低雜草控制成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)中對(duì)異黃酬含量的需求及大豆生產(chǎn)中雜草控制成本的考慮，本發(fā)明 所要解決的技術(shù)問題是在大豆基因組中導(dǎo)入能提高異黃酬合成及增加草甘麟抗性的基因， 獲得轉(zhuǎn)基因青葛新品系，W提高其異黃酬合成能力及草甘麟抗性，使運(yùn)種轉(zhuǎn)基因大豆品系 成為大規(guī)模種植的大豆品種。
[0008] 為了提高大豆中異黃酬含量W及降低雜草控制成本，本發(fā)明提供一種利用基因工 程培育高異黃酬抗草甘麟大豆的方法，包括W下步驟：
[0009] 步驟一、克隆化IFS基因片段；
[0010] 步驟二、克隆EPSPS基因片段；
[0011] 步驟Ξ、共轉(zhuǎn)化化IFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高異黃酬抗草甘 麟大豆；
[0012]TpIFS基因片段是異黃酬合成酶基因片段，EPSPS基因片段是5-締醇丙酬酷莽草 酸-3-憐酸合成酶基因片段。步驟一和步驟二是分別進(jìn)行的，不存在先后順序。
[0013]進(jìn)一步地，TpIFS基因片段來自紅Ξ葉（Trifolium pratense)。
[0014] 進(jìn)一步地，TpIFS基因片段的序列是SEQIDNo.1所示的核巧酸序列。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟一中化IFS基因片段的獲得是：W紅Ξ葉的基因組為模板，WSEQ IDNo. 2和SEQIDNo. 3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；或者通過人工合成SEQIDNo. 1序 列得到的。其中，PCR擴(kuò)增的條件是98°C10s，55°C5s，72°C10s，共進(jìn)行25-35個(gè)循環(huán)。
[0016] 進(jìn)一步地，EPSPS基因片段的序列是沈QIDNo. 4。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟二中EPSPS基因片段的獲得是：WpS0Y19的基因組為模板，WSEQ IDNo. 5和SEQIDNo.6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的；或者通過人工合成SEQIDNo. 4序 列得到的。其中，PCR擴(kuò)增的條件是98°C10s，55°C5s，72°C10s，共進(jìn)行25-35個(gè)循環(huán)。 陽(yáng)01引進(jìn)一步地，步驟Ξ中采用冷激的方法將同時(shí)包含化IFS基因片段和EPSPS基因片 段的重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將根癌農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆，得到高異 黃酬抗草甘麟大豆。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟一具體為：PCR擴(kuò)增、回收得到化IFS基因片段，將化IFS基因片段 與PMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，酶切及 PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆測(cè)序，確定得到包含化IFS基因片段的重組子pTpIFS ;
[0020] 步驟二具體為：PCR擴(kuò)增、回收得到EPSPS基因片段，將EPSPS基因片段與PMD18-T 載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，酶切及PCR鑒定后將 陽(yáng)性克隆測(cè)序，確定得到包含EPSPS基因片段的重組子祀PSPS ;
[0021] 步驟Ξ具體為：利用步驟一中的重組子pTpIFS和步驟二中的重組子祀PSPS構(gòu)建 重組質(zhì)粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS，并利用重組質(zhì)粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS將其含有的TpIFS基因片段和EPSPS基因片段共轉(zhuǎn)化到大豆中，得到高異黃酬抗草甘麟大豆。
[0022] 進(jìn)一步地，還包括W下步驟：
[0023] 步驟四、通過PCR擴(kuò)增化IFS基因片段和EPSPS基因片段后的電泳條帶對(duì)步驟Ξ 中得到的高異黃酬抗草甘麟大豆中的進(jìn)行鑒定，確保化IFS基因片段和EPSPS基因片段已 轉(zhuǎn)入；
[0024] 步驟五、通過HPLC檢測(cè)步驟Ξ中得到的高異黃酬抗草甘麟大豆的異黃酬水平。 陽(yáng)0巧]異黃酬合成酶（Isoflavonesynthase,IF巧是大豆植株合成異黃酬的關(guān)鍵酶， 增強(qiáng)IFS的活性可W提高植株異黃酬的含量。5-締醇丙酬酷莽草酸-3-憐酸合成酶 (5-enolpyryvylshikimic曰cid-3-phosph曰techorism曰tesynth曰se,EPSPS)是苯丙氨酉畫、 色氨酸和酪氨酸等植物芳香族必需氨基酸的生物合成的關(guān)鍵酶，提高EPSPS的活性能夠提 高植株對(duì)于草甘麟的抗性。本發(fā)明將關(guān)鍵酶基因IFS及EPSPS基因共轉(zhuǎn)化大豆，提高大豆 異黃酬含量的同時(shí)增強(qiáng)對(duì)于草甘麟的抗性，獲得高異黃酬含量并抗除草劑的基因工程青葛 品種，為培育高異黃酬含量的除草劑抗性大豆提供一種新的方法。
[00%] 本發(fā)明可W對(duì)所述的F1代植株進(jìn)行人工篩選，W獲得穩(wěn)定表達(dá)化IFS基因和 EPSPS基因的高異黃酬含量且抗草甘麟的大豆植株。在大豆基因組中導(dǎo)入化IFS和EPSPS基因，使大豆合成異黃酬過程中產(chǎn)生調(diào)控性，且能夠合成5-締醇丙酬酷莽草酸-3-憐酸合 成酶，調(diào)控大豆在草甘麟存在條件下能夠繼續(xù)正常生長(zhǎng)，具有比原先更高效地合成異黃酬 及在草甘麟存在情況下繼續(xù)合成苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等植物芳香族必需氨基酸的特 性，