一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法。該方法是將草甘膦抗性基因通過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用該農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選抗性愈傷，經(jīng)分化、生根、煉苗、移栽，得到對(duì)草甘膦具有抗性的轉(zhuǎn)基因水稻，分子鑒定結(jié)果顯示外源基因已穩(wěn)定地表達(dá)。本發(fā)明得到的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻除了帶有抗草甘膦除草劑基因外，不含其它篩選標(biāo)記基因，可作為商品化抗除草劑水稻品種，減少后期流程，加快育種步伐。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)低，遺傳性狀穩(wěn)定，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】—種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]稻田雜草與水稻在水、肥、生長(zhǎng)空間上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，直接影響水稻的產(chǎn)量。近年來(lái)直播和拋秧等栽培方法的使用，使得稻田的雜草危害變得日益嚴(yán)重；特別是新型稻田雜草一雜草稻一的出現(xiàn)，給稻田除草提出了難題。另外，隨著農(nóng)村人口往城市遷移速度的加快，水稻種植的規(guī)模化和機(jī)械化是一個(gè)可預(yù)見(jiàn)的趨勢(shì)，這使得傳統(tǒng)的人工除草的方法變得不現(xiàn)實(shí)。施用除草劑是解決這些新出現(xiàn)的問(wèn)題的最佳方案之一，因此，抗除草劑水稻將具有非常大的實(shí)際需求和市場(chǎng)潛力。
[0003]草甘膦(glyphosate)別名N-(膦羧甲基)甘氨酸；農(nóng)達(dá)(Roundup);鎮(zhèn)草寧；膦甘酸，是一種非選擇性、無(wú)殘留、滅生性除草劑，對(duì)多年生根雜草非常有效，廣泛用于橡膠、桑、茶、果園及甘蔗地。施用草甘膦后，進(jìn)入植物體內(nèi)的草甘膦分子與磷酸烯醇丙酮酸競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合EPSPS (5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶)的活性位點(diǎn)，終止了芳香族氨基酸的合成途徑，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最終導(dǎo)致植物死亡。利用源于細(xì)菌、植物抗性細(xì)胞系的Epsps基因可以大大提高植物對(duì)草甘膦的耐受性。在轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的研制中，最負(fù)盛名、推廣面積最大、經(jīng)濟(jì)效益最高的是抗草甘膦作物?，F(xiàn)已研制成功的抗草甘膦作物有:大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、水稻、煙草、花生、番茄、馬鈴薯、向日葵、胡蘿卜、洋蔥、春小麥、苜蓿、波菜、南瓜、百脈根等20多種植物。由于抗草甘膦作物在世界各地的推廣與大面 積種植，影響了除草劑新品種的篩選與開(kāi)發(fā)、世界除草劑銷售市場(chǎng)以及食品工業(yè)，還引起了作物栽培方式及耕作制度的深刻變革?？梢灶A(yù)見(jiàn)其耐性基因工程的市場(chǎng)前景廣闊(Wang X J, Lang Z H, Shan A S，Huang D F.Advances in mechanism ofherbicide inhibiting amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant transgenicplants.China Biotechnology，2008，28 (2):110-116.)
[0004]目前的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法主要是用以潮霉素為篩選劑的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。例如HieiY,Ohta S，Komori T.Efficient transformation of rice(0ryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.[J]PlantJournal, 1994 (6)，通過(guò)潮霉素篩選，獲得粳稻“越光”的轉(zhuǎn)基因植株；沈革志，張建軍，殷麗青，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ds轉(zhuǎn)座因子的水稻遺傳轉(zhuǎn)化[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).1998 (04)；劉巧泉，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報(bào).1998 (03)獲得“中花11”的轉(zhuǎn)基因植株；孫建昌，馬靜，何玉科，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化寧夏水稻的研究[J].寧夏農(nóng)林科技.2009 (01)，獲得“優(yōu)育28”的轉(zhuǎn)基因植株。但是利用該篩選方法培育出的轉(zhuǎn)基因水稻會(huì)帶入多余的篩選標(biāo)記基因，給未來(lái)的品種應(yīng)用帶來(lái)麻煩。也有少量轉(zhuǎn)化方法以Bar基因作為篩選標(biāo)記基因，用除草劑草丁膦作為篩選劑得到抗草丁膦的轉(zhuǎn)基因水稻植株。例如文獻(xiàn)【黎垣慶，劉剛，嚴(yán)文貴，等.轉(zhuǎn)bar基因水稻除草劑抗性遺傳研究及其應(yīng)用[J].雜交水稻2000 (01)、查中萍，萬(wàn)丙良，殷得所，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué).2011 (24)】。相對(duì)于草丁膦，草甘膦具有價(jià)格便宜，在土壤中易分解、無(wú)殘留，對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在影響小等優(yōu)點(diǎn)，從而成為了世界范圍內(nèi)施用面積最大的除草劑，這也為抗草甘膦除草劑作物的培育提出了更高的要求，迫切需要一種大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)抗草甘膦水稻的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):構(gòu)建包含草甘膦抗性基因Epsps-1和Epsps-2的遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法、以草甘膦作為篩選劑，成功地將草甘膦抗性基因轉(zhuǎn)入到水稻愈傷組織中，并培育出抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因水稻植株，借助PCR方法分析鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，Southern Blot方法鑒定外源基因拷貝數(shù),試紙條檢測(cè)Epsps-1或Epsps-2蛋白表達(dá)情況,分子鑒定結(jié)果顯示外源基因已穩(wěn)定地表達(dá)。
[0007]本發(fā)明提供的抗草 甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將含草甘膦抗性基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中；
[0009](2)將步驟(1)的農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；
[0010](3)將步驟(2)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選抗性愈傷組織；
[0011](4)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基分化，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻。
[0012]其中，步驟(1)所述的表達(dá)載體為pZZOOOll或pZZOOOl3。
[0013]進(jìn)一步地，所述pZZOOOll載體的構(gòu)建方法為:合成Epsps-1基因，序列如SEQID N0.1所示；將Epsps-1基因與PU130載體該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過(guò)程是:pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s_Bar部分得到PU130。分別用BamHI和SacI酶切，將酶切后的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體 Pub1-Epsps-1-35spolyA,即 pZZ00002 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對(duì) pZZ00002 和P35s-gfp-35spolyA進(jìn)行雙酶切，再將酶切后的二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到遺傳轉(zhuǎn)化載體PZZ00011。
[0014]進(jìn)一步地，所述pZZ00013載體的構(gòu)建方法為:合成Epsps-2基因，序列如SEQ IDN0.2所示；將Epsps-2基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切后的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-Epsps-2-35spolyA，即pZZ00003 ;分別用HindIII和PmeI對(duì)pZZ00003和P35s-gfp-35spolyA進(jìn)行雙酶切，再將酶切后的二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到遺傳轉(zhuǎn)化載體PZZ00013。
[0015]在pZZOOOll和pZZ00013載體的構(gòu)建方法中，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381載體為模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列為上、下游引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到的。
[0016]PCR 擴(kuò)增 P35s-gfp_35spolyA 的 50 μ L 反應(yīng)體系為:10 X La Taq Buffer5 μ L,
2.5mM dNTP4 μ L,上、下游引物各 I μ L，pCambial381 模板 I μ L，LA Taq0.5 μ L,ddH2037.5 μ L0[0017]反應(yīng)條件為:95°C, 5min ；95 °C，40s，55 °C，40s，72 °C，2min，25 個(gè)循環(huán)；72 °C,10min，4°C保存。1%瓊脂糖凝膠回收P35s-gfp_35spolyA片段。
[0018]Hind ΙΙΙ/PmeI 酶切回收 PCR 片段和質(zhì)粒 pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)或PZZ00003 (Pub1-Epsps-2-35spolyA)，體系為:10XNEB4,10 μ L ； 100XBSAl μ L ；Hind III，
2μ L ；PmeI,2 μ L ；PCR片段或質(zhì)粒5-10 μ L ;加滅菌ddH20至總體系100 μ L。酶切條件為37°C,3-5h0
[0019]使用QIAGEN PCR Purifcation Kit試劑盒純化回收目標(biāo)片段。
[0020]連接上述兩個(gè)酶切片段(P35s-gfp-35spolyA片段和pZZ00002或pZZ00003)，體系為:10Xligase buffer, 2 μ L ;長(zhǎng)片段 I μ L ;短片段 7 μ L ；ligase, I μ L ;加 ddH20 至總體系20 μ L0連接條件為16°C，2-4h。
[0021]熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α )得到遺傳轉(zhuǎn)化載體ρΖΖΟΟΟΙ 1/ρΖΖ00013，并將遺傳轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示該農(nóng)桿菌中含有Epsps-1基因或Epsps-2基因。
[0022]本發(fā)明方法中，所述的選擇培養(yǎng)基以N6為基本培養(yǎng)基，并添加2.5mg/L的2，4_D，250mg/L羧芐青霉素和草甘膦。
[0023]進(jìn)一步地，選擇培養(yǎng)基中草甘膦的終濃度為8(T300mg/L。
[0024]本發(fā)明制備抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的方法中，應(yīng)用的農(nóng)桿菌為EHA105。
[0025]優(yōu)選地，本發(fā)明方法中所述的水稻為粳稻。
[0026]更優(yōu)選地，所述的粳稻為空育131和/或R187。
[0027]本發(fā)明方法利用草甘膦作為篩選劑，培育出的水稻品種除了帶有抗草甘膦除草劑的基因外不含有其它的篩選標(biāo)記基因，可以直接作為抗除草劑的品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，極大地減少了后期的流程，加快了育種步伐。本發(fā)明方法具有效率高、操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)低、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)抗草甘膦水稻提供了可能。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為遺傳轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)示意圖，其中圖1A為Epsps-1基因遺傳轉(zhuǎn)化載體(pZZOOOll)的T-DNA區(qū)示意圖；圖1B為Epsps-2基因遺傳轉(zhuǎn)化載體(pZZ00013)的T-DNA區(qū)示意圖。
[0029] 圖2轉(zhuǎn)基因植株中外源基因(GFP)在組織中的表達(dá)圖。圖2A為外源基因(GFP)在轉(zhuǎn)化粳稻根部的表達(dá)圖；圖2B為外源基因(GFP)在轉(zhuǎn)化粳稻葉部的表達(dá)圖。a:含Epsps-1的載體轉(zhuǎn)化空育131得到的苗；b:含Epsps-2的載體轉(zhuǎn)化空育131得到的苗；c:野生型空育131 ；d:含Epsps-1的載體轉(zhuǎn)化R187得到的苗；e:含Epsps-2的載體轉(zhuǎn)化R187得到的苗；f:野生型R187
[0030]圖3轉(zhuǎn)基因植株中外源基因(Epsps-1/Epsps-2)PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。圖3A =Epsps-1基因轉(zhuǎn)化粳稻品種空育131所得到的部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖；圖3B:Epsps-2基因轉(zhuǎn)化粳稻品種空育131所得到的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖；圖30 =Epsps-1基因轉(zhuǎn)化粳稻品種R187所得到的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖；圖3D:Epsps-2基因轉(zhuǎn)化粳稻品種R187所得到的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖。M:為2KB Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_20:本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)基因植株編號(hào)；N:陰性對(duì)照；P:陽(yáng)性對(duì)照；圖片左側(cè)數(shù)字:轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)編號(hào)。[0031]圖4轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)圖。Epsps-1和Epsps-2轉(zhuǎn)化粳稻品種空育131以及Epsps-1和Epsps-2轉(zhuǎn)化粳稻品種R187植株Southern_blot檢測(cè)圖。每個(gè)樣品分別來(lái)自于獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，圖上標(biāo)示出了相應(yīng)的目標(biāo)基因和受體品種。
[0032]圖5Epsps試紙條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中蛋白(Epsps_l/Epsps_2)表達(dá)的結(jié)果。圖5A:Epsps-1和Epsps-2轉(zhuǎn)化粳稻品種空育131植株蛋白檢測(cè)圖；圖5B:Epsps_l和Epsps-2轉(zhuǎn)化梗稻品種R187植株蛋白檢測(cè)圖。
[0033]圖6轉(zhuǎn)基因植株噴施草甘膦除草劑后的表型圖，草甘膦噴施濃度0.6% (V/V)0【具體實(shí)施方式】
[0034]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0035]若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0036]實(shí)施例1Epsps-1和Epsps-2基因的合成與遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
[0037]1、人工合成草甘膦抗性基因 Epsps-1 (US_RE39247)和 Epsps-2 (CN88103827.X)，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0038]2、以PU130載體為骨架(PU130載體的構(gòu)建過(guò)程是:pCambia3300載體經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)，構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體，分別命名為pZZOOOll和pZZ00013。兩個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)域示意圖見(jiàn)圖1A，圖1B。 [0039](I)把人工合成的基因Epsps-1和Epsps-2經(jīng)BamHI和SacI酶切，插入經(jīng)BamHI和SacI酶切處理過(guò)的PU130，分別獲得中間載體pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)、pZZ
00003(Pub1-Epsps-2-35spolyA)。
[0040](2) PCR 擴(kuò)增 P35s-gfp_35spolyA。
[0041]反應(yīng)體系:10X La Taq Buffer5 μ L,
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備方法，包括以下步驟: (1)將含草甘膦抗性基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中； (2)將步驟(1)的農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織； (3 )將步驟(2 )的愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑選抗性愈傷組織； (4)將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基分化，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的表達(dá)載體為pZZOOOll或PZZ00013。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZOOOll載體的構(gòu)建方法為:合成Epsps-1基因，序列如SEQ ID N0.1所示^fEpsps-1基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切后的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-EpSpS-1-35SpolyA，即 pZZ00002 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對(duì) pZZ00002 和 P35s-gfp_35spolyA 進(jìn)行雙酶切，再將酶切后的二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到遺傳轉(zhuǎn)化載體pZZOOOll。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZ00013載體的構(gòu)建方法為:合成Epsps-2基因，序列如SEQ ID N0.2所示^fEpsps_2基因與PU130載體分別用BamHI和SacI酶切，將酶切后的Epsps-1基因與PU130載體連接，得到中間載體Pub1-EpSpS-2-35SpolyA，即 pZZ00003 ;分別用 Hind III 和 PmeI 對(duì) pZZ00003 和 P35s-gfp_35spolyA 進(jìn)行雙酶切，再將酶切后的二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到遺傳轉(zhuǎn)化載體PZZ00013。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381載體為模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列為上、下游引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的選擇培養(yǎng)基以N6為基本培養(yǎng)基，并添加2.5mg/L的2，4-D，250mg/L羧芐青霉素和草甘膦。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，選擇培養(yǎng)基中草甘膦的終濃度為8(T300mg/L0
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的農(nóng)桿菌為EHA105。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻為粳稻。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的粳稻為空育131和/或R187。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104004781SQ201310058935
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月25日
【發(fā)明者】張琳, 馬崇烈, 魏晶, 夏秀云, 王維鵬, 李晨, 章旺根 申請(qǐng)人:中國(guó)種子集團(tuán)有限公司