專利名稱：分離自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其編碼序列的制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分離來自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的制備與用途，具體涉及從草甘膦污染土壤微生物群體DNA庫中分離的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白產(chǎn)物的制備與用途。
背景技術(shù)：
草甘膦(Glyphosate)為內(nèi)吸傳導型、廣譜滅生性除草劑，其作用機制是通過抑制植物體內(nèi)5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻斷植物體內(nèi)芳香族氨基酸的 生物合成，導致植物死亡。應用化學誘變細菌產(chǎn)生的aroA突變體，抗藥性機理研究確證了 aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合酶的編碼基因。近年來包括美國和中國在內(nèi)的國家，草甘膦產(chǎn)量急劇增加還與系列轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物品種的選育和大面積推廣有直接的關(guān)系。美國Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的編碼基因及其抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物等方面已申請了 100余份專利，獲得轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品種，其中大豆等多種轉(zhuǎn)基因作物已進入商品化生產(chǎn)?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因植物的研究開發(fā)對農(nóng)業(yè)發(fā)展可起到巨大推進作用，因此，為選育新的高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途，本發(fā)明通過從草甘膦極端污染環(huán)境中采集土壤樣品，構(gòu)建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA庫，分離獲得了一種EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉(zhuǎn)入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，用于提高植物對草甘膦的抗性。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶為如下多肽，
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性為25. 57U/mg。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，編碼所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，所述編碼EPSP合酶多肽的SEQ ID N0:1的多核苷酸序列選自下組的一種
(a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列；
(b)具有SEQID NO: I中1-1338位的序列。
一種用于提高植物對草甘膦的抗性的載體，含有如上所述的多核苷酸。一種用于提高植物對草甘膦的抗性的宿主細胞，含有如上所述的載體。分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制備方法，(a)培養(yǎng)上述含有如權(quán)利要求7所述的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。一種能與如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特異性結(jié)合的抗體。一種改變植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步驟
(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有EPSP合酶DNA編碼序列，所述的EPSP合酶選自下組
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個到二十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；
(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(I)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使EPSP合酶DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；
(3)選擇出轉(zhuǎn)入EPSP合酶DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；
(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在本發(fā)明中，術(shù)語“ EPSPS ”、“ EPSP合酶”、“ EPSP合成酶” “ EPSP多肽”或“ 5_烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶”可互換使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。如發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如發(fā)明所用，“分離的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化EPSP合酶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。 本發(fā)明還包括EPSP合酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然EPSP合酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與EPSPS DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 EPSP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有EPSP多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供EPSP合酶或多肽的類似物。這些類似物與天然EPSP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到。在本發(fā)明中，“EPSP合酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表I
夏￥的殘基I代表性的取代I優(yōu)選的坂 T
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
Asn (N)Gln;His;Lys;ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys (C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro;AlaAla
His (H)Asn;Gln;Lys;ArgArg
He (I)Leu; Val; Met; Ala; PheLeu
權(quán)利要求
1.一種分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，所述編碼序列包含SEQ ID NO: 1，其特征在于用于提高植物對草甘膦的抗性。
2.如權(quán)利要求I所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
3.如權(quán)利要求2所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶為如下多肽， (a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性為25. 57U/mg。
5.如權(quán)利要求4所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的夂值為0. 0443 ±0. 012。
6.如權(quán)利要求5所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的&值為0. 746 ±0. 007。
7.如權(quán)利要求6所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于編碼所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列選自下組(a)編碼上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
8.如權(quán)利要求7所述的分離自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其編碼序列的用途，其特征在于所述編碼EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:l的多核苷酸序列選自下組的一種 (a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列； (b)具有SEQ ID NO: I中1-1338位的序列。
9.一種含有如權(quán)利要求8所述的多核苷酸的用于提高植物對草甘膦的抗性的載體。
10.一種含有如權(quán)利要求9所述的載體用于提高植物對草甘膦的抗性的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其編碼序列的制備和用途，本發(fā)明通過從草甘膦極端污染環(huán)境中采集土壤樣品，構(gòu)建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA庫，分離獲得了一種EPSP合酶，并且通過實驗證實了它具有高抗草甘膦抗性，并且轉(zhuǎn)入植物后，可導致植物抗草甘膦抗性的提高。
文檔編號C12N15/82GK102776161SQ20121028770
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者何軍光, 劉英新, 吳濤, 張維, 徐京, 林敏 , 樓億圓, 燕永亮, 王偉, 王林輝, 陸偉, 陳明, 黃明春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所, 浙江新安化工集團股份有限公司