專利名稱：：一種與草甘膦抗性相關(guān)的ⅱ型epsp合酶保守模體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種II型EPSP合酶的序列模體。
背景技術(shù)：
：EPSP合酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，EC2.5丄19)作為莽草酸合成途徑的第六位酶，是除草劑草甘膦作用的靶標(biāo)酶，對(duì)植物、真菌、細(xì)菌和部分病原寄生蟲合成芳香族氨基酸及其它芳香族代謝產(chǎn)物必不可少的。由于哺乳動(dòng)物體內(nèi)不存在莽草酸途徑，因此EPSP合酶成為研發(fā)新型除草劑和新型抗菌素等的靶標(biāo)酶。EPSP合酶分I型和II型兩種類型，其中II型EPSP合酶通常都源于草甘膦耐受的微生物，有較高的底物PEP親和性和催化效率。如源自根癌膿桿菌CP4的EPSP合酶，不受草甘膦抑制并且為耐受草甘膦轉(zhuǎn)基因作物提供了一個(gè)新的作用模式。如果能發(fā)現(xiàn)II型EPSP合酶的高度保守序列模體，可以為研發(fā)新型抗草甘膦植物、研發(fā)新型除草劑和新型抗菌素等提供方便的手段。已有人做了此方面的工作，如Monsanto公司利用定點(diǎn)突變方法對(duì)CP4EPSP合酶與草甘膦抗性相關(guān)的模體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了Arg-X-His-X-Glu、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K和Asn-X-Thr-Arg四個(gè)序列模體在II型酶中高度保守，通過替換X位點(diǎn)氨基酸會(huì)極大影響該型酶對(duì)草甘膦的抗性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的II型EPSP合酶序列模體。本發(fā)明在II型EPSP合酶中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的高度保守的序列模體(sequencemotif)，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下氨基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His,Asp或Glu。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，除X外，所述序列模體中其它四個(gè)氨基酸對(duì)酶活力至關(guān)重要。可作為化合物攻擊的靶位點(diǎn)，為抗菌新藥物的合成奠定基礎(chǔ)；所述序列模體中，X是不保守位點(diǎn)氨基酸，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用不同的氨基酸替換后可提高或降低除草劑草甘膦的抗性。為II型EPSP合酶應(yīng)用于抗除草劑草甘膦提供新的改造位點(diǎn)。如本發(fā)明使用A1501EPSP合酶作為研究實(shí)例，其X位點(diǎn)Asn替換為Ser等氨基酸可提高除草劑草甘膦抗性，替換為Trp后對(duì)草甘膦抗性減弱。為證實(shí)本發(fā)明的效果，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)1、II型EPSP合酶多序列比對(duì)所有II型EPSP合酶氨基酸序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)了新的序列模體Arg-Pro-Met-X-Arg。(見實(shí)施例1)此模體存在于已知的所有II型EPSP合酶中，其中Arg、Pro、Met、Arg四個(gè)氨基酸在所有II型EPSP合酶序列中完全保守。X位點(diǎn)可為二十種氨基酸替換。2、保守位點(diǎn)氨基酸的替換新序列模體中四個(gè)保守的氨基酸進(jìn)行任意氨基酸替換，酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果顯示均失去酶活力。(見實(shí)施例2)3、非保守位點(diǎn)氨基酸替換非保守位點(diǎn)氨基酸替換后，酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果顯示功能可互補(bǔ)。(見實(shí)施例3)4、草甘膦抗性測(cè)定將X位點(diǎn)逐個(gè)進(jìn)行草甘膦抗性測(cè)定，結(jié)果顯示此位點(diǎn)的替換可提高或降低酶對(duì)除草劑草甘膦的抗性。(見實(shí)施例4)經(jīng)測(cè)定，保守位點(diǎn)氨基酸替換后，酶失去功能；非保守氨基酸替換后，酶功能存在，對(duì)除草劑草甘膦抗性提高或降低。本發(fā)明所提供的新EPSP合酶具有如下用途1、培育高抗草甘膦植物由于非保守位點(diǎn)X氨基酸替換后可提高EPSP合酶對(duì)除草劑草甘膦的抗性，故此可用于培育高抗草甘膦植物。比如，新II型EPSP合酶構(gòu)建與pUC18載體構(gòu)建的新重組載體可用于酶功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，以及草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)。2、研發(fā)新的抗菌素新II型EPSP合酶模體可作為設(shè)計(jì)抗菌藥物攻擊的靶位點(diǎn)。由于據(jù)目前報(bào)道的II型EPSP合酶均源自微生物，人和其它動(dòng)物不存在此酶，故此可將新II型EPSP合酶新模體中的保守氨基酸作為新抗菌化合物攻擊的靶位點(diǎn)，為研發(fā)新的抗菌素奠定基礎(chǔ)。圖1是pUCaroAA1501重組載體具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件。實(shí)施例1II型EPSP合酶多序列比對(duì)本發(fā)明在NCBI非冗繁數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索并下載所有II型EPSP合酶氨基酸序列，目前為止共有482條，使用MEGA4.0軟件的CLUSTAL程序進(jìn)行多序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示共有五個(gè)保守序列模體即Arg-X-His-X-Glu、Arg-Pro-Met-X-Arg、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K禾PAsn-X-Thr-Arg，其中發(fā)現(xiàn)Arg-Pro-Met-X-Arg(其中X為如下二十種常見氨基酸的任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp，Glu。)為新序列模體。實(shí)施例2保守位點(diǎn)氨基酸的替換本發(fā)明選用A1501EPSP合酶作用研究實(shí)例，使用Stratagene公司的QuickChange^定點(diǎn)突變?cè)噭┖校鶕?jù)該試劑盒說明，使用QuickChang/'引物設(shè)計(jì)程序4設(shè)計(jì)重疊引物，將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行堿基突變，達(dá)到氨基酸替換的目的。將Argl27，Pro128，Metl29，Argl31(序列位置按照A1501EPSP合酶氨基酸序列標(biāo)記)四個(gè)氨基酸分別替換為任意其它常見氨基酸。并采用酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子未能生長(zhǎng)，即酶功能均不能回補(bǔ)。具體替換氨基酸見表l。所述酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)方法為大腸桿菌EPSP合酶缺失突變株ER2799作為受體菌。將野生型或突變體酶與pUC18用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindlII雙酶切，然后16。C連接過夜，構(gòu)建功能互補(bǔ)載體(見圖l)。采用熱激轉(zhuǎn)化的方法，將重組載體導(dǎo)入受體菌，涂于M9固體限制性培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)施例3非保守位點(diǎn)氨基酸替換本發(fā)明選用A1501EPSP合酶作用研究實(shí)例，采用定點(diǎn)突變PCR方法對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行堿基突變，達(dá)到氨基酸突變的目的。將Asnl30位點(diǎn)(序列位置按照A1501EPSP合酶氨基酸序列標(biāo)記)采用任意常用氨基酸替換四個(gè)氨基酸分別替換為任意，并采用酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示酶功能均可回補(bǔ)。具體替換氨基酸見表l。酶功能互補(bǔ)試驗(yàn)方法參見實(shí)施例2方法部分。表1新II型EPSP合酶序列模體氨基酸替換實(shí)驗(yàn)結(jié)果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注新序列模體氨基酸位置按照A1501EPSP合酶位置標(biāo)記；[O(HO]"-"表示功能不能互補(bǔ)；"+"表示功能可互補(bǔ)。實(shí)施例4草甘膦抗性測(cè)定將導(dǎo)入野生型或突變體酶的受體菌接種至M9液體限制性培養(yǎng)基中。分別加入終濃度為O，20，50，100，200mM草甘膦鈉鹽。37°C，200rpm培養(yǎng)48小時(shí)，用分光光度計(jì)在OD6。。nm檢測(cè)菌液濃度。Asnl30位點(diǎn)氨基酸替換結(jié)果顯示突變可使酶的抗性提高或降低。具體數(shù)據(jù)見表2。表2非保守位點(diǎn)X突變結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種II型EPSP合酶中的序列模體，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下氨基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。2.—種II型EPSP合酶氨基酸序列，其特征是含有權(quán)利要求1所述模體的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2所述EPSP合酶在培育高抗草甘膦植物中的用途。4.權(quán)利要求2所述EPSP合酶在設(shè)計(jì)抗菌藥物靶位點(diǎn)中的用途。5.—種重組載體，包含編碼權(quán)利要求2所述合酶氨基酸序列的基因。全文摘要本發(fā)明涉及一種與草甘膦抗性相關(guān)的II型EPSP合酶保守模體，其中高度保守的四個(gè)氨基酸對(duì)酶活力至關(guān)重要，可作為化合物攻擊的靶位點(diǎn)，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下氨基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。不保守位點(diǎn)氨基酸可進(jìn)行替換，以提高或降低除草劑草甘膦的抗性。本序列模體的發(fā)現(xiàn)為新藥物的合成奠定了基礎(chǔ)，為II型EPSP合酶應(yīng)用于抗除草劑草甘膦提供了新的改造位點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N15/82GK101691563SQ20091009352公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年10月12日優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日發(fā)明者平淑珍,張維,李亮,林敏,燕永亮,陸偉,陳明申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所