本申請(qǐng)涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因秈稻的制備方法，該方法中使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基組合，以及通過該方法制備的水稻幼苗、水稻植株、水稻種子或水稻組織。

背景技術(shù)：

水稻是我國(guó)乃至世界上的主要糧食作物，是全球近一半人口的主要熱量來源，然而由于雜草危害直接造成的水稻產(chǎn)量損失巨大。伴隨著人們對(duì)除草劑作用機(jī)理和代謝途徑的了解和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，通過現(xiàn)代生物技術(shù)培育抗除草劑的農(nóng)作物，使田間化學(xué)除草技術(shù)和生物技術(shù)緊密結(jié)合，可以擴(kuò)大高效與超高效低毒除草劑品種的應(yīng)用范圍，降低除草劑殘留。

草甘膦(glyphosate)即N-(phosphonomethy)glycine，商品名農(nóng)達(dá)(Roundup)，是一種廣泛應(yīng)用于水旱地雜草防除的滅生性除草劑。草甘膦施用后可被植物迅速吸收，進(jìn)入植物體內(nèi)與磷酸烯醇丙酮酸競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合EPSPS(5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶)的活性位點(diǎn)，終止了芳香族氨基酸的合成途徑，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最終導(dǎo)致植物死亡。草甘膦具有很好的傳導(dǎo)性能，對(duì)世界上十大多年生、深根性難除雜草均有良好效果，是一種廣譜滅生性除草劑。草甘膦進(jìn)入土中遇金屬二價(jià)離子形成絡(luò)合物，通過微生物降解作用失去活性，即與土壤接觸后失去其植物毒性；與土壤具有強(qiáng)的親和力，在土壤中遷移性很??；在水中可發(fā)生明顯的水解作用，迅速失去活性；同時(shí)由于人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)缺乏芳香族氨基酸合成途徑，沒有草甘膦的作用靶標(biāo)酶，因此草甘瞵對(duì)人畜是沒有毒性的。由于草甘膦具有高效低毒無(wú)殘留，對(duì)人畜無(wú)毒，入土后迅速失活，不會(huì)造成土壤及地下水的污染的特點(diǎn)，研 制抗草甘膦水稻具有很高的商業(yè)價(jià)值。

以潮霉素為篩選劑的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前水稻遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，但是利用該篩選方法培育出的轉(zhuǎn)基因水稻會(huì)帶入多余的篩選標(biāo)記基因。而少量水稻除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)化主要集中在Bar基因的利用上。武長(zhǎng)劍(1994)、朱常香等(2000)、王慧中等(2000)、施利利等(2004)相繼利用原生質(zhì)體、粳稻、秈稻以及水稻幼胚等不同材料不同方法將抗除草劑Bar基因轉(zhuǎn)入水稻獲得具有除草劑穩(wěn)定抗性的水稻植株并進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測(cè)證明抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入。

草甘膦是目前使用面積最大、使用范圍最廣的廣譜性除草劑，相對(duì)于草丁膦，草甘膦具有價(jià)格便宜，在土壤中易分解、短殘留、不易進(jìn)入地下水等優(yōu)點(diǎn)，在水稻免耕與少耕種植中起著關(guān)鍵性作用，培育抗草甘膦除草劑的水稻對(duì)生產(chǎn)抗除草劑水稻具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一方面，本申請(qǐng)涉及用于篩選抗草甘膦的愈傷組織的篩選培養(yǎng)基，其包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素和50-400mg/L草甘膦。

在第二方面，本申請(qǐng)涉及培養(yǎng)基組合，其包括上述篩選培養(yǎng)基和用于共培養(yǎng)農(nóng)桿菌和愈傷組織的共培養(yǎng)基，所述共培養(yǎng)基包含3/10倍MS培養(yǎng)基的大量元素和1/2倍MS培養(yǎng)基的微量元素。

在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括懸浮培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括誘導(dǎo)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括對(duì)繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括對(duì)篩選后的抗草甘膦水稻愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組合還包括用于對(duì)分化培養(yǎng)獲得的再生苗進(jìn)行生根培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基。

在第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝丝共莞熟⑺居鷤M織的制備方法，包括以下步驟：

(1)利用包含抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌菌液在懸浮培養(yǎng)基中侵染水稻愈傷組織；

(2)將侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；

(3)將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得抗草甘膦的水稻愈傷組織。

在第四方面，本申請(qǐng)還涉及獲得抗草甘膦的水稻幼苗的方法，其包括將通過上述方法獲得的抗草甘膦水稻愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，獲得再生水稻幼苗。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將分化培養(yǎng)獲得的再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得生根水稻幼苗。

在第五方面，本申請(qǐng)還涉及通過上述方法獲得的水稻愈傷組織和水稻幼苗。

在第六方面，本申請(qǐng)還涉及通過上述愈傷組織或幼苗獲得的水稻植株。

在第七方面，本申請(qǐng)還涉及通過上述水稻植株獲得的水稻種子、水稻組織、及由所述水稻種子或水稻組織獲得的深加工產(chǎn)品。

本發(fā)明的篩選培養(yǎng)基利用草甘膦作為篩選劑，培育出的水稻品種除了帶有抗草甘膦除草劑的基因外不含有其它的篩選標(biāo)記基因。

本申請(qǐng)的一些培養(yǎng)基組合采用了特定的培養(yǎng)基配方，可以提高各階段的培養(yǎng)效率。

本發(fā)明的方法利用草甘膦作為篩選劑，培育出的水稻愈傷組織、水稻幼苗或由這些水稻愈傷組織或水稻幼苗獲得的水稻植株除了帶有抗草甘膦除草劑的基因外不含有其它的篩選標(biāo)記基因。

通過上述水稻植株獲得的水稻種子、水稻組織、及由所述水稻種子或水稻組織獲得的深加工產(chǎn)品不含其它的篩選標(biāo)記基因，對(duì)于其進(jìn)一步的應(yīng)用也更安全。

本申請(qǐng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基組合、方法、水稻愈傷組織、水稻幼苗、水稻植株、水稻種子和水稻組織具有以下優(yōu)勢(shì)中的一種或多種：加快育種速度；效率高；操作簡(jiǎn)便；轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)低；和遺傳性狀穩(wěn)定等。

附圖說明

圖1為農(nóng)桿菌內(nèi)T-DNA區(qū)示意圖。

圖2A-2B為轉(zhuǎn)基因植株中外源基因(GFP)在組織中的表達(dá)圖。圖2A為外源基因(GFP)在轉(zhuǎn)化水稻根部的表達(dá)圖；圖2B為外源基因(GFP)在轉(zhuǎn)化水稻葉部的表達(dá)圖。a：轉(zhuǎn)化明恢63得到的苗；b：野生型明恢63；c：轉(zhuǎn)化9311得到的苗；d：野生型9311。

圖3A-3B為轉(zhuǎn)基因植株中外源基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。圖3A：轉(zhuǎn)化明恢63所得到的部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖；圖3B:轉(zhuǎn)化9311所得到的部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增圖。M：為2kB Marker分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-14：本申請(qǐng)制備的轉(zhuǎn)基因植株編號(hào)；N：陰性對(duì)照；P：陽(yáng)性對(duì)照。

圖4為轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)圖。轉(zhuǎn)化秈稻品種明恢63以及9311植株DNA印跡檢測(cè)圖。每個(gè)樣品分別來自于獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。M：為DNA Molecular Weight Marker III分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；1-3：轉(zhuǎn)化明恢63得到的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株，4-6：轉(zhuǎn)化9311得到的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的一方面，本申請(qǐng)涉及篩選培養(yǎng)基，其用于篩選抗草甘膦的愈傷組織，其包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素和50-400mg/L草甘膦。

在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有100-400mg/L的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有100-300mg/L的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有150-300mg/L的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有150-200mg/L的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有200-300mg/L的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基含有50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mg/L的草甘膦。

在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含250mg/L羧芐青霉素。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些 實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含200-600mg/L谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含300-800mg/L脯氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含2-3mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含30g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含7g/L瓊脂。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基的pH值為5.8。

在一方面，本申請(qǐng)涉及培養(yǎng)基組合，其包括上述篩選培養(yǎng)基和用于共培養(yǎng)農(nóng)桿菌和愈傷組織的共培養(yǎng)基，所述共培養(yǎng)基包含3/10倍MS培養(yǎng)基的大量元素和1/2倍MS培養(yǎng)基的微量元素。

在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含800mg/L水解酪蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含2-3mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含20g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含10g/L葡萄糖。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含200mg/L乙酰丁香酮。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基還包含7g/L瓊脂。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基的pH值為5.2。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括懸浮培養(yǎng)基，所述懸浮培養(yǎng)基包含AA培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽、甘氨酸、肌醇和煙酸硫胺素。

在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含100-300mg/L天冬氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含500-1000mg/L谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含100-300mg/L精氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含2mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含20g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含10g/L葡萄糖。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基還包含200mg/L乙酰丁香酮。在一些實(shí)施方案中，所述懸浮培養(yǎng)基的pH值為5.2。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括誘導(dǎo)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素和10倍 B5培養(yǎng)基的微量元素。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含200-600mg/L谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含300-800mg/L脯氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含300-800mg/L水解酪蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含2-3mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含30g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含3g/L Phytagel。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.8。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)基，其中所述繼代培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素和10倍B5培養(yǎng)基的微量元素。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含200-600mg/L谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含300-800mg/L脯氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含300-800mg/L水解酪蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含2-3mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含30g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基還包含3g/L Phytagel。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括對(duì)繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的預(yù)培養(yǎng)基，其中所述預(yù)培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素和10倍B5培養(yǎng)基的微量元素。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含200-600mg/L谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含300-800mg/L脯氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含300-800mg/L水解酪蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含2-3mg/L 2,4-D。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含30g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基還包含200mg/L乙酰丁香酮。在一些實(shí)施方案中， 所述預(yù)培養(yǎng)基還包含3g/L Phytagel。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基的pH值為5.8。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括對(duì)篩選后的抗草甘膦水稻愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基，其中所述分化培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素和50-400mg/L草甘膦。在一些實(shí)施方案中，所述篩選培養(yǎng)基還包含250mg/L羧芐青霉素。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含N6培養(yǎng)基的鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含300-800mg/L脯氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含800-1000mg/L水解酪蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含2mg/L 6-糖基氨基嘌呤。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含0.2mg/L萘乙酸。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含0.2mg/L吲哚乙酸。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含20g/L麥芽糖。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含10g/L蔗糖。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基還包含3g/L Phytagel。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基的pH值為6.0。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的培養(yǎng)基組合還包括用于對(duì)分化培養(yǎng)獲得的再生苗進(jìn)行生根培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基，其中所述生根培養(yǎng)基包含MS培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基還包含20g/L蔗糖。在一些實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基還包含3g/L Phytagel。在一些實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8。

在一方面，本申請(qǐng)涉及抗草甘膦水稻愈傷組織的制備方法，其包括以下步驟：

(1)利用包含抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌菌液在懸浮培養(yǎng)基中侵染水稻愈傷組織；

(2)將侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；

(3)將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得抗草甘膦的水稻愈傷組織。

在一些實(shí)施方案中，所述水稻為秈稻。在一些實(shí)施方案中，所述水 稻為品種9311和/或品種明恢63。

在一些實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌EHA105。在一些實(shí)施方案中，所述抗草甘膦基因?yàn)镋psps-CP4基因。在一些實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌還包含GFP基因。在一些實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌包含與所述Epsps-CP4基因可操作地連接的Ubi啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌包含于所述GFP基因可操作地連接的35S啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，其中侵染用農(nóng)桿菌菌液濃度為OD₆₀₀＝0.05-0.8。在一些實(shí)施方案中，侵染時(shí)間為10-15分鐘。

在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的共培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)的條件為20-28℃暗條件下3-4天。

在一些實(shí)施方案中，其中所述篩選培養(yǎng)基為上述篩選培養(yǎng)基；任選地所述篩選培養(yǎng)的條件為28℃暗條件下4-6周。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)水稻愈傷組織。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為28-36℃暗條件下2-4周。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將誘導(dǎo)得到的水稻愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的繼代培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述繼代培養(yǎng)的條件為28-36℃暗條件，每2周一個(gè)繼代周期。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的預(yù)培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)培養(yǎng)的條件為28℃暗條件下3-6天。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及獲得抗草甘膦的水稻幼苗的方法，其包括將通過上述方法獲得的抗草甘膦水稻愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，獲得再生水稻幼苗。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的分化培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，所述分化培養(yǎng)的條件為28℃、16小時(shí)光/8小時(shí)暗。

任選地所述方法還包括將分化培養(yǎng)獲得的再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，獲得生根水稻幼苗。在一些實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基組合中的生根培養(yǎng)基；在一些實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)的條件為16小時(shí)光/8小時(shí)暗的光周期。

本申請(qǐng)中使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方在表1-4中列出。

表1 N6培養(yǎng)基的配方

表2 B5培養(yǎng)基的配方

表3 MS培養(yǎng)基的配方

表4 AA培養(yǎng)基的配方

在上述實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，本申請(qǐng)的抗草甘膦基因?yàn)楦鶕?jù)US RE39247E中公開的cp4的蛋白序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得。在一具體實(shí)施方案中，cp4蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列。在一具體實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的抗草甘膦基因具有序列表中SEQ ID NO:1所描述的核苷酸序列。

以下實(shí)施例用于說明本申請(qǐng)，但不用來限制本申請(qǐng)的范圍。在不背離本申請(qǐng)精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本申請(qǐng)組分、方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本申請(qǐng)的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的制備

1.誘導(dǎo)愈傷組織

(1)取9311或明恢63水稻成熟種子，去殼后用75％的乙醇消毒0.5-1分鐘；

(2)40％(V/V)的次氯酸鈉溶液(NaClO)消毒10-15分鐘；

(3)滅菌水沖洗3次；

(4)將消毒好的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

(5)28-36℃暗培養(yǎng)30天。

2.愈傷組織的繼代培養(yǎng)

挑選外表嫩黃色、表面干燥、質(zhì)地緊實(shí)的愈傷組織放置于繼代培養(yǎng)基上，28-36℃暗培養(yǎng)，每2周為一個(gè)周期進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

3.愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)

挑選外表嫩黃色、表面干燥、質(zhì)地緊實(shí)的顆粒狀愈傷組織放置于預(yù)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)3-6天。

4.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

1)于無(wú)菌工作臺(tái)上，將-70℃冰箱中保存的含抗草甘膦基因Epsps-CP4的(根據(jù)US RE39247E中公開的cp4的蛋白序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得)表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株取出，用酒精燈灼燒滅菌金屬接種環(huán)，冷卻后蘸取少量農(nóng)桿菌，在含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的平板培養(yǎng)基上劃線；

2)將劃線平板培養(yǎng)基用Parafilm封口膜封好，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天；

3)用已滅菌的接種環(huán)蘸取少量LB劃線平板上生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌，接種于含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基，置無(wú)菌的50ml離心管中，放入28℃搖床震蕩培養(yǎng)20小時(shí)；

4)將菌液離心，除去上清液；

5)用移液器吸取懸浮培養(yǎng)基添加到去除了上清液的上述50ml離心管中，調(diào)整OD600值至0.05-0.8。

5.農(nóng)桿菌侵染

1)將上述含有農(nóng)桿菌的懸浮培養(yǎng)基倒入裝有經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織的三角瓶至完全浸沒愈傷，浸泡10-15分鐘；

2)倒掉懸浮培養(yǎng)基，將侵染后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液；

3)將吸干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，放置于20-28℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3-4天。

6.水洗

1)將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌三角瓶中；

2)倒入滅菌水至完全侵沒愈傷組織，搖晃2-3分鐘，倒掉洗滌水；

3)重復(fù)上述2)步驟2-3次直至洗滌水呈澄清狀態(tài)，倒掉洗滌水；

4)加入含500mg/L羧芐青霉素的滅菌水浸泡愈傷，輕微晃動(dòng)后靜置30分鐘；

5)倒掉浸泡液體，將愈傷組織轉(zhuǎn)入裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干水分。

7.篩選

將吸干水分的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3個(gè)周期，每個(gè)周期為2周。比較不同草甘膦濃度篩選效果(如表5所示)。當(dāng)草甘膦濃度為50mg/L時(shí)，生成的抗性愈傷經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為23.77％(9311)、30％(明恢63)；當(dāng)草甘膦濃度提高到100mg/L時(shí)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)93.28％(9311)、85.71％(明恢63)；當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)100％。因此，本申請(qǐng)所述的選擇培養(yǎng)基中草甘膦的添加量為終濃度范圍在50-400mg/L之間。

表5 不同草甘膦濃度對(duì)9311轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)例

表6 不同草甘膦濃度對(duì)明恢63轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)例

8.分化

將篩選階段生成的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，28℃、16小時(shí)光/8小時(shí)暗的光周期條件培養(yǎng)。

9.生根培養(yǎng)

將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)盒中，16小時(shí)光/8小時(shí)暗的光周期條件培養(yǎng)至長(zhǎng)出白色的新根。

10.煉苗及移栽

幼苗生根長(zhǎng)成后，打開生根培養(yǎng)盒，置室內(nèi)光線充足處煉苗；2-3天后將苗取出，洗凈根部的殘留培養(yǎng)基，移栽至穴盤置溫室中，待長(zhǎng)出新葉后移栽到盆缽中栽培。

實(shí)施例1中使用的培養(yǎng)基配方在以下列出。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、200-600mg/L谷氨酸、300-800mg/L脯氨酸、300-800mg/L水解酪蛋白、2-3mg/L 2,4-D、30g/L麥芽糖和3g/L Phytagel，pH值為5.8。

繼代培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、200-600mg/L谷氨酸、300-800mg/L脯氨酸、300-800mg/L水解酪蛋白、2-3mg/L 2,4-D、30g/L麥芽糖和3g/L Phytagel，pH值為5.8。

預(yù)培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、200-600mg/L谷氨酸、300-800mg/L脯氨酸、300-800mg/L水解酪蛋白、2-3mg/L 2,4-D、30g/L麥芽糖、200mg/L乙酰丁香酮和3g/L Phytagel，pH值為5.8。

懸浮培養(yǎng)基包含AA培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，以及100-300mg/L天冬氨酸、500-1000mg/L谷氨酸、100-300mg/L精氨酸、2mg/L 2,4-D、20g/L麥芽糖、10g/L葡萄糖和200mg/L乙酰丁香酮，pH值為5.2。

共培養(yǎng)基包含3/10倍MS培養(yǎng)基的大量元素、1/2倍MS培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、N6培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、800mg/L水解酪蛋白、2-3mg/L 2,4-D、20g/L麥芽糖、10g/L葡萄糖、200mg/L乙酰丁香 酮和7g/L瓊脂，pH值為5.2。

篩選培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、200-600mg/L谷氨酸、300-800mg/L脯氨酸、2-3mg/L 2,4-D、30g/L麥芽糖、250mg/L羧芐青霉素、50-400mg/L草甘膦和7g/L瓊脂，pH值為5.8。

分化培養(yǎng)基包含N6培養(yǎng)基的大量元素、10倍B5培養(yǎng)基的微量元素、N6培養(yǎng)基的鐵鹽、B5培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)、300-800mg/L脯氨酸、800-1000mg/L水解酪蛋白、2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤、2mg/L 6-糖基氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、0.2mg/L吲哚乙酸、20g/L麥芽糖、10g/L蔗糖、50-400mg/L草甘膦和3g/L Phytagel，pH值為6.0。

生根培養(yǎng)基包含MS培養(yǎng)基、20g/L蔗糖、3g/L Phytagel，pH值為5.8。

實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因9311水稻的鑒定

1.轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因GFP在組織中的表達(dá)觀察

取實(shí)施例1的轉(zhuǎn)基因9311和明恢63水稻植株根和葉片進(jìn)行外源基因(GFP)在組織中的表達(dá)觀察，在熒光下呈亮綠色，說明外源基因成功表達(dá)，否則為陰性材料，陰性材料與陽(yáng)性材料相比，在熒光下為顯色。結(jié)果見圖2A，圖2B。

2.轉(zhuǎn)基因植株中外源基因陽(yáng)性檢測(cè)

取實(shí)施例1的轉(zhuǎn)基因植株葉片，在DNA水平上做外源基因的陽(yáng)性檢測(cè)。步驟如下：葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Murray et al,Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res,1980,8:4321-4325)。將得到的DNA作為模板做普通PCR。

通過PCR方法利用Epsps-CP4引物進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。Epsps-CP4引物序列為：

CP4-L：TCAATAGCAGCAACCTCTC；

CP4-R：ATAGTCCTCACGCCATCA。

PCR反應(yīng)總體積為20μl，具體配法是：模板100ng，10×PCR緩沖 液2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg^2-1.5μl，正向引物、反向引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃預(yù)變性4分鐘，②94℃變性1分鐘，③56℃退火1分鐘，④72℃延伸2.5分鐘，⑤從②－④循環(huán)32次，⑥72℃延伸10分鐘，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。因?yàn)镋psps-CP4基因?yàn)楸旧暾?qǐng)遺傳轉(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴(kuò)增出Epsps-CP4基因特異帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽(yáng)性植株，否則即為陰性材料。實(shí)施例3制得的轉(zhuǎn)基因水稻的基因檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

表7 28℃條件下誘導(dǎo)/繼代所得愈傷的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表8 32℃條件下誘導(dǎo)/繼代所得愈傷的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表9 36℃條件下誘導(dǎo)/繼代所得愈傷的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表10 不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表11 共培養(yǎng)4天的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表12 共培養(yǎng)3天的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表13 不同農(nóng)桿菌菌液濃度侵染的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)例

表14 轉(zhuǎn)化效率實(shí)驗(yàn)例

3.轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)檢測(cè)

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)，選取經(jīng)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)為單拷貝的樣本，采用DNA印跡方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行更精確的分析。參照Lu et al.Localization of pms3,a gene for photoperiod-sensitive genic male sterility,to a 28.4-kb DNA fragment.Mol Genet Genomics,2005,273:507-511所述的方法進(jìn)行DNA印跡。在37℃條件下，用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化總DNA過夜，然后在1％(w/v)的瓊脂糖凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。使用Roche公司的地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I)，參照廠商的說明書，進(jìn)行探針標(biāo)記和雜交。結(jié)果顯示檢測(cè)的植株都是單拷貝。這表明了外源基因已經(jīng)穩(wěn)定地整合到了植物基因組上。轉(zhuǎn)基因植株DNA印跡檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)通過引用并入本文，其引用程度如同單獨(dú)指出通過引用并入的每個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確定本文所描述的具體實(shí)施方案的許多等同形式。本發(fā)明的范圍并不旨在限制于以上描述。替代性方法和材料以及另外的應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，并且旨在包括在權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍內(nèi)。