專利名稱：：一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說(shuō)屬于育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是培育雜交水稻的基礎(chǔ)，而不育系純度高低直接影響雜交種的純度和雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)。我國(guó)的粳型與秈型雜交水稻研究同期，但粳型雜交水稻研究進(jìn)展仍緩慢，其中一個(gè)重要原因是用于雜交粳稻育種的主要是滇I型和BT型兩個(gè)體系，這兩個(gè)體系的部分不育系育性不穩(wěn)定，致使生產(chǎn)的雜交種子純度較低，嚴(yán)重影響了雜交粳稻雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)。粳稻不育系的育性不穩(wěn)定主要表現(xiàn)在兩方面。一是一些BT型和滇I型的粳稻不育系在高溫下會(huì)發(fā)生少量自交結(jié)實(shí)，該問(wèn)題我們基于云南立體氣候優(yōu)勢(shì)，在海拔相差1000米的不同溫度條件下篩選敗育穩(wěn)定的不育系得到很好的解決。二是在粳稻不育系中發(fā)現(xiàn)存在少量可自交結(jié)實(shí)的植株——稱之為"可育株"。這些可育株表型與保持系完全一致，但在恢復(fù)基因位點(diǎn)存在差異?？捎甏嬖趦深愐活愂羌?xì)胞核攜帶隱性恢復(fù)基因，對(duì)不育系無(wú)育性恢復(fù)功能，其基因型與保持系一致是來(lái)源保持系混雜；另一類是細(xì)胞核攜帶顯性恢復(fù)基因，能使不育系育性恢復(fù)，該基因來(lái)源于不育系隱性恢復(fù)基因發(fā)生自然回復(fù)突變產(chǎn)生，這類可育株稱為含恢復(fù)基因可育株。在所有報(bào)道中，鑒別含恢復(fù)基因可育株的基因型都采用傳統(tǒng)的測(cè)交鑒別方法，時(shí)間周期在120天以上，工作量大、繁瑣，鑒別一個(gè)材料需人民幣60元以上。目前還沒(méi)有一種技術(shù)經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首次采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)鑒定粳稻不育系中混雜含恢復(fù)基因可育株基因型，克服傳統(tǒng)的測(cè)交鑒別方法的不足，提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的分子鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是取待鑒定可育株葉片提取水稻總DNA;用恢復(fù)基因Rf-l的特異性引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶在4。C酶切48h;酶切混合物力口入3iU的loadingbuffer,混勻上樣6yl，用1%瓊脂糖凝膠、1XTAEbuffer、120V電泳50min;紫外透射儀上檢測(cè)，依據(jù)電泳結(jié)果鑒定材料基因型?？捎昊蛐蜑闊o(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp;基因型為含恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp，這種基因型為含恢復(fù)基因可育株。本發(fā)明的效果用途能經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液組成及擴(kuò)增程序如下反應(yīng)液組成反應(yīng)總體積為12.5ul，含ddH208.95iil，10Xbuffer(含NH4+)1.25ii1，MgCl2(25mM)0.9ii1，dNTP(2.5mM)0.3ii1，2個(gè)弓|物(lOpmol)各0.2ii1，F(xiàn)ermentasTaq(5U/ii1)0.1ii1，模板DNA(20-40ng/ii1)0.6ii1;擴(kuò)增程序94。C5min;94。Clmin、58。Clmin、72。Clmin，40個(gè)循環(huán)；72。C5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切反應(yīng)液組成為反應(yīng)總體積為12.0ul，含ddH202.5iU，10Xbuffer(R)1.2ii1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0ii1，F(xiàn)ermentasBstUI(10U/ii1)0.3ii1。本發(fā)明的有益效果是由于利用了分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合我們對(duì)滇I型恢復(fù)基因精確標(biāo)記及分子定位的結(jié)果，在粳稻不育系繁殖過(guò)程中快速鑒定出含恢復(fù)基因可育株基因型，有利于繁殖高純度不育系，為解決雜交粳稻不育系純度面臨的問(wèn)題提供有力的工具。具體表現(xiàn)為(l)用恢復(fù)基因Rf-l的特異性引物M49609BstUI鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株基因型，鑒別準(zhǔn)確率為100%，而且用時(shí)不超過(guò)5天，鑒別材料提取DNA，PCR反應(yīng)、酶切、電泳即可；(2)由于鑒別方法簡(jiǎn)單易行，鑒別不受季節(jié)及材料數(shù)量的限制，而避免了測(cè)交和田間種植的繁瑣程序，鑒別方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，鑒定一個(gè)材料僅需人民幣5元。圖1是用M49609BstUI作引物，PCR擴(kuò)增、酶切、瓊脂糖凝膠電泳所得到的電泳圖譜，其中泳道1、2、4、6、8、10、11、12、13、14為無(wú)育性恢復(fù)基因可育株基因型，泳道3、5、7、9為含恢復(fù)基因可育株基因型。具體實(shí)施案例具體實(shí)施方式對(duì)滇I型不育系群體中混雜含恢復(fù)基因可育株分別用測(cè)交鑒別和分子鑒別法鑒定材料基因型，比較兩種方法鑒別結(jié)果，考察分子鑒別法的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確性。實(shí)施例一來(lái)自滇I型粳稻不育系黎榆A群體的10個(gè)可育株，對(duì)10株分別用測(cè)交鑒別及分子鑒定法鑒定材料的基因型，比較兩種方法鑒別結(jié)果，考察分子鑒別法的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確性。測(cè)交鑒別時(shí)，不育系黎榆A與IO個(gè)可育株分別測(cè)交，下一季種植10個(gè)測(cè)交&代，調(diào)查套袋結(jié)實(shí)率。分子鑒別時(shí)，取10個(gè)可育株葉片，提取水稻總DNA;用恢復(fù)基因Rf-l的特異性引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶在4。C酶切48h;酶切混合物加入3iU的loadingbuffer,混勻上樣6yl，用1%瓊脂糖凝膠、1XTAEbuffer、120V電泳50min;紫外透射儀上檢測(cè)，依據(jù)電泳結(jié)果鑒定材料基因型?；蛐蜑闊o(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp;基因型為含恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp，這種基因型為含恢復(fù)基因可育株。本發(fā)明的效果用途能經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液組成及擴(kuò)增程序如下反應(yīng)液組成反應(yīng)總體積為12.5ul，含ddH208.95y1，10Xbuffer(含NH4+)1.25ii1，MgCl2(25mM)0.9ii1，dNTP(2.5mM)0.3ii1，2個(gè)弓|物(lOpmol)各0.2ii1，F(xiàn)ermentasTaq(5U/ii1)0.1ii1，模板DNA(20-40ng/ii1)0.6ii1;擴(kuò)增程序94。C5min;94。Clmin、58。Clmin、72。Clmin，40個(gè)循環(huán)；72。C5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切反應(yīng)液組成為反應(yīng)總體積為12.0ul，含ddH202.5iU，10Xbuffer(R)1.2ii1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0ii1，F(xiàn)ermentasBstUI(10U/ii1)0.3ii1。結(jié)果見(jiàn)表1，來(lái)自不育系黎榆A群體的10個(gè)可育株，測(cè)交鑒別有1個(gè)測(cè)交巳代套袋結(jié)實(shí)為86.5%，說(shuō)明這個(gè)&對(duì)應(yīng)的可育株對(duì)不育系有育性恢復(fù)功能，分子鑒別這株可育株基因型為含恢復(fù)基因可育株；另9個(gè)測(cè)交個(gè)巳代套袋結(jié)實(shí)為0%，它們對(duì)應(yīng)可育株對(duì)不育系無(wú)育性恢復(fù)功能，這9株可育株基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因可育株，分子鑒別的基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因。表明分子鑒別與測(cè)交鑒別完全一致，分子鑒別準(zhǔn)確率為100%，且分子鑒別經(jīng)濟(jì)、快速。表1不育系黎榆A群體混雜含恢復(fù)基因可育株的測(cè)交鑒別與分子鑒別法鑒定比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例二來(lái)自滇I型粳稻不育系榆密15A群體共19個(gè)可育株，對(duì)19株分別用測(cè)交鑒別及分子鑒別法鑒定材料的基因型，比較兩種方法鑒別結(jié)果，考察分子鑒別法的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確性。測(cè)交鑒別時(shí)，不育系榆密15A與19個(gè)可育株分別測(cè)交，下一季種植19個(gè)測(cè)交F工代，調(diào)查套袋結(jié)實(shí)率。分子鑒別時(shí)，取19個(gè)可育株葉片，提取水稻總DNA;用恢復(fù)基因Rf-l的特異性引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶在4。C酶切48h;酶切混合物加入3iU的loadingbuffer,混勻上樣6yl，用1%瓊脂糖凝膠、1XTAEbuffer、120V電泳50min;紫外透射儀上檢測(cè)，依據(jù)電泳結(jié)果鑒定材料基因型。基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp;基因型為含恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp，這種基因型為含恢復(fù)基因可育株。本發(fā)明的效果用途能經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液組成及擴(kuò)增程序如下反應(yīng)液組成反應(yīng)總體積為12.5ul，含ddH208.95iU，10Xbuffer(含NH4+)1.25ii1，MgCl2(25mM)0.9ii1，dNTP(2.5mM)0.3ii1，2個(gè)弓|物(lOpmol)各0.2ii1，F(xiàn)ermentasTaq(5U/ii1)0.1ii1，模板DNA(20-40ng/ii1)0.6ii1;擴(kuò)增程序94。C5min;94。Clmin、58。Clmin、72。Clmin，40個(gè)循環(huán)；72。C5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切反應(yīng)液組成為反應(yīng)總體積為12.0ul，含dc^O2.5iU，10Xbuffer(R)1.2ii1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0ii1，F(xiàn)ermentasBstUI(10U/ii1)0.3ii1。結(jié)果見(jiàn)表2，來(lái)自不育系榆密15A群體的19個(gè)可育株，測(cè)交鑒別有7個(gè)測(cè)交R代套袋結(jié)實(shí)在63%以上，說(shuō)明這7個(gè)R對(duì)應(yīng)的可育株對(duì)不育系有育性恢復(fù)功能，分子鑒別這7株可育株基因型為含恢復(fù)基因可育株；另12個(gè)測(cè)交個(gè)R代套袋結(jié)實(shí)為0%，它們對(duì)應(yīng)可育株對(duì)不育系無(wú)育性恢復(fù)功能，這12株可育株基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因可育株，分子鑒別的基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因。表明分子鑒別與測(cè)交鑒別完全一致，分子鑒別準(zhǔn)確率為100%，且分子鑒別經(jīng)濟(jì)、快速。表2不育系榆密15A群體混雜含恢復(fù)基因可育株的測(cè)交鑒別與分子鑒別法鑒定比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例三來(lái)滇I型粳稻不育系楚粳23A群體共14個(gè)可育株，對(duì)14株分別用測(cè)交鑒別及分子鑒別法鑒定材料的基因型，比較兩種方法鑒別結(jié)果，考察分子鑒別法的快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確性。測(cè)交鑒別時(shí)，不育系楚粳23A與14個(gè)可育株分別測(cè)交，下一季種植14個(gè)測(cè)交F工代，調(diào)查套袋結(jié)實(shí)率。分子鑒別時(shí)，取14個(gè)可育株葉片，提取水稻總DNA;用恢復(fù)基因Rf-l的特異性引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶在4。C酶切48h;酶切混合物加入3iU的loadingbuffer,混勻上樣6yl，用1%瓊脂糖凝膠、1XTAEbuffer、120V電泳50min;紫外透射儀上檢測(cè)，依據(jù)電泳結(jié)果鑒定材料基因型?；蛐蜑闊o(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp;基因型為含恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp，這種基因型為含恢復(fù)基因可育株。本發(fā)明的效果用途能經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液組成及擴(kuò)增程序如下反應(yīng)液組成反應(yīng)總體積為12.5ul，含ddH208.95iU，10Xbuffer(含NH4+)1.25ii1，MgCl2(25mM)0.9ii1，dNTP(2.5mM)0.3ii1，2個(gè)引物(lOpmol)各0.2ii1，F(xiàn)ermentasTaq(5U/ii1)0.1ii1，模板DNA(20_40ng/ii1)0.6ii1;擴(kuò)增程序94。C5min;94。Clmin、58。Clmin、72。Clmin，40個(gè)循環(huán)；72。C5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切反應(yīng)液組成為反應(yīng)總體積為12.0ul，含ddH202.5iU，10Xbuffer(R)1.2ii1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0ii1，F(xiàn)ermentasBstUI(10U/ii1)0.3ii1。結(jié)果見(jiàn)表3，來(lái)自不育系楚粳23A群體共14個(gè)可育株，測(cè)交鑒別有3個(gè)測(cè)交^代套袋結(jié)實(shí)在69%以上，說(shuō)明這3個(gè)巳對(duì)應(yīng)的可育株對(duì)不育系有育性恢復(fù)功能，分子鑒定這3株可育株基因型為含恢復(fù)基因可育株；另11個(gè)測(cè)交個(gè)巳代套袋結(jié)實(shí)為0%，它們對(duì)應(yīng)可育株對(duì)不育系無(wú)育性恢復(fù)功能，這11株可育株基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因可育株，分子鑒別的基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因。表明分子鑒別與測(cè)交鑒別完全一致，分子鑒別準(zhǔn)確率為100%，且分子鑒別經(jīng)濟(jì)、快速。表3不育系楚粳23A群體混雜含恢復(fù)基因可育株的測(cè)交鑒別與分子鑒別法鑒定比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表1表3看出，用M49609BstUI為引物鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株時(shí)，準(zhǔn)確率為100%，且分子技術(shù)鑒定成本低，所需時(shí)間短。權(quán)利要求一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法，其步驟是1)將待鑒別水稻材料葉片提取總DNA；2)用水稻育性恢復(fù)基因Rf-1的特異性引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶，在4℃酶切48h；4)酶切混合物加入3μl的loadingbuffer，混勻上樣6μl，用含0.1μg/mlEtBr的1％瓊脂糖凝膠，1×TAEbuffer，120V電泳50min；4)在紫外透射儀上檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切混合物及電泳結(jié)果；5)可育株基因型為無(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp；基因型為含恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp；6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp的可育株基因型為含恢復(fù)基因可育株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法，其特征是所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液組成及擴(kuò)增程序?yàn)榉磻?yīng)液組成反應(yīng)總體積為12.5ul，含ddH208.95ii1，10Xbuffer(含NH4+)1.25y1，MgCl2(25mM)0.9ii1，dNTP(2.5mM)0.3ii1，2個(gè)引物(lOpmol)各O.2iil，F(xiàn)ermentasTaq(5U/y1)0.1ii1，模板DNA(20-40ng/ii1)0.6ii1;擴(kuò)增程序94°C5min;94°Clmin、58。Clmin、72。Clmin，40個(gè)循環(huán)；72°C5min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法，其特征是所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切反應(yīng)液組成為反應(yīng)總體積為12.Oul，含ddH202.5iU，10Xbuffer(R)1.2ii1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8.0ii1，F(xiàn)ermentasBstUI(10U/ii1)0.3ii1。全文摘要本發(fā)明涉及一種粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株分子鑒別的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
或育種領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是提取水稻總DNA，用水稻Rf-1基因引物M49609BstUI進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物加入BstUI酶在4℃酶切48h，加入3μlloadingbuffer，上樣6μl，用1％瓊脂糖凝膠，120V電泳50min；經(jīng)UVP檢測(cè)，依據(jù)電泳結(jié)果鑒定材料基因型?？捎昊蛐蜑闊o(wú)育性恢復(fù)基因的PCR產(chǎn)物酶切分子量為611bp和199bp；含恢復(fù)基因可育株基因型的PCR產(chǎn)物酶切分子量為810bp、611bp及199bp。本發(fā)明的用途能快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確鑒別粳稻不育系混雜含恢復(fù)基因可育株。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101709330SQ200910218250公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月26日優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日發(fā)明者張忠林,文建成,洪汝科,譚亞玲,譚學(xué)林,金壽林,黃大軍申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)