專利名稱：一種5-磷酸木酮糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5-磷酸木酮糖的制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種 利用基因工程技術(shù)和固定化酶技術(shù)制備5-磷酸木酮糖的方法。
背景技術(shù)：
木糖是半纖維素的主要組成成分,在植物纖維材料水解液中占 30%左右，是僅次于葡萄糖的自然界最豐富的糖分。利用微生物工程 發(fā)酵轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)乙醇是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。
自然界存在某些天然利用木糖的微生物，包括細(xì)菌、酵母和絲狀 真菌。真菌和細(xì)菌的代謝木糖的方式不盡相同，但都必需利用PP途徑。 酵母及絲狀真菌的木糖代謝方式是經(jīng)一系列酶(木糖還原酶、木糖醇 脫氫酶和木酮糖激酶)作用將木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-磷酸，進(jìn)入PP途 徑，然后再進(jìn)行其它代謝。細(xì)菌的木糖代謝途徑也是經(jīng)一系列酶(木糖 異構(gòu)酶、木酮糖激酶)的作用下將木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-磷酸，進(jìn)入PP 途徑，然后再進(jìn)行其它代謝。
5-磷酸木酮糖是木糖代謝的中間產(chǎn)物，也是研究木糖代謝途徑中 重要轉(zhuǎn)化酶一轉(zhuǎn)酮酶的底物，也是研究肝臟組織糖代謝途徑的重要物 質(zhì)。目前獲得5-磷酸木酮糖的方法為天然提取法，方法繁瑣，并且得 率低。
本發(fā)明在此背景下，為了克服目前制備工藝的不足，利用基因工 程表達(dá)技術(shù)和木酮糖激酶固定化酶技術(shù)制備5-磷酸木酮糖，簡(jiǎn)化了制 備工藝，并提高了得率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程技術(shù)和固定化酶技術(shù)制 備5-磷酸木酮糖的方法。本發(fā)明的目的是釆用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提供的 一種5-磷酸木酮糖的制備方法，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶基因，然后在樹(shù)脂層析柱中通過(guò)組氨酸標(biāo)簽與層析柱的特異性結(jié)合，對(duì)表達(dá)的木酮糖激酶進(jìn)行分離純化，同時(shí)固定化木酮糖激酶，最后加入底物木酮糖和三磷酸腺苷，合成5-磷酸木酮糖。
本發(fā)明的目的還可以釆用以下的技術(shù)措施來(lái)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明涉及的木酮糖激酶基因來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇菌
(T77W附oa"am^a"er ef/zaw //cw;y),但也包括含有木酮糖激酶的其它微生物，如野油菜黃單胞菌(I""^2omo"as camp&s Ws )、 大腸桿菌(Esc/^n'c/z/a )、白熱帶假絲酵母(CW"6^/a fl/6z'cara )、釀酒酵母(Sacc/zara，ces1 cereWw'ae)、 移動(dòng)發(fā)酵單胞菌(^vmo脂was mo勵(lì)'s )等。
前述的制備方法，其中所述的木酮糖激酶基因優(yōu)選來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇菌(77zenwoa"aera6ac^ e//za"o/z.ci^ )。
前述的制備方法，其中所述木酮糖激酶具有SEQIDNO.l所示的基因序列和SEQ ID NO,2所示的氨基酸序列。由其編碼表達(dá)的木酮糖激酶具有耐熱性，可耐8(TC以上的高溫。從而后一步的合成反應(yīng)可較高效的進(jìn)行，并且降低了染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)。
前述的制備方法，釆用親和層析法分離純化表達(dá)產(chǎn)物。
前述的制備方法，其中所述分離純化包括步驟1)以NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiS04溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-0緩沖液(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl)洗柱；2 )將含有過(guò)表達(dá)的木酮糖激酶的大腸桿菌破碎菌體離心后得到的上清加入到N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中，反復(fù)加入2 ~ 3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(即NAT-0緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白。前述的制備方法，其中按上述方法洗去雜蛋白后，在Ni2+-NTA樹(shù)脂柱中保留帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶，將含有木酮糖和三磷酸腺苷的體系加熱至70-85°C,反應(yīng)體系在螯合有His-tag-XK的N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中保溫2h，得到含有木酮糖和5-礫酸木酮糖的反應(yīng)體系，利用液相色譜技術(shù)分離純化5-木酮糖。
前述的制備方法，其中所述含有木酮糖和三磷酸腺苷的體系為D-木酮糖重量百分比為1 °/。，CoCl2'6H2O:2xl0-4mol/L，ATP:0.5mol/L,MgS047H20: 2><10'3mol/L， pH8.0。
前述的制備方法，其中洗去雜蛋白后，可用含有300mmol/L咪哇的NAT-0緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶，并做SDS-PAGE分析和Western blot分析。
本發(fā)明利用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR技術(shù))擴(kuò)增XK的基因，然后把該基因片段插入到表達(dá)載體pET-28b(+)，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并表達(dá)XK。
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)親和色譜技術(shù)，利用帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶能與蛋白純化樹(shù)脂Ni-NTA層析柱特異性結(jié)合的原理，再用含有低濃度的咪唑洗去雜蛋白，保留在Ni-NTA層析柱上的6xHis-XK，從而簡(jiǎn)化6xHis-XK分離純化步驟。
本發(fā)明涉及固定化酶技術(shù)，帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶與蛋白純化樹(shù)脂Ni-NTA層析柱特異性結(jié)合，在洗去雜蛋白后，Ni-NTA層析柱保留特異性成分一木酮糖激酶(XK),在有合適濃度的底物木酮糖和三磷酸腺苷情況下，合成5-磷酸木酮糖。
借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果
1)簡(jiǎn)化木酮糖激酶分離純化和固定化的工藝，即克服了分離純化和固定化由多個(gè)步驟完成的缺點(diǎn)，釆用親和層析法，對(duì)過(guò)表達(dá)的帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶同時(shí)進(jìn)行分離純化及固定化， 一步完成；2)該固定化酶可反復(fù)使用；3)該酶在高溫環(huán)境下工作，克服工
6藝存在染菌的技術(shù)不足；4)該酶轉(zhuǎn)化效率高，提高了得率，轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%,因此本發(fā)明降低了 5-磷酸木酮糖的生產(chǎn)成本。


圖1為本發(fā)明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析圖；圖2為本發(fā)明表達(dá)載體pET-28b(+)-砂/S雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析圖3 純化的木酮糖激酶的SDS-PAGE電泳；
圖4 Western blot分析純化的木酮糖激酶；
圖5 5-磷酸木酮糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜分析(HPLC);
圖6木酮糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖7異構(gòu)化后反應(yīng)液樣品的HPLC分析圖8純化收集液中的5-磷酸木酮糖樣品的HPLC分析圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1木酮糖激酶基因(A ，/B)的獲得
以ljig嗜熱厭氧乙醇菌(772erwo""aera6"cter e//wwo//cw<s)基因組
DNA為PCR反應(yīng)模板，按SEQ ID NO.l的序列設(shè)計(jì)正向引物xy舊-F
為5'- r7TCC4rGGGCATGTATTTTCTTGGGATAGATT-3',反向引物xylB-R為5'-7TrCTC04GGTAGCTAATTTCAACAATTCTT-3',其中
斜體字母部分分別為酶切位點(diǎn)MroI和^01，為保證讀碼框正確，我們額外地在正向引物5'端加了兩個(gè)堿基，同時(shí)下游引物序列中的終止密碼子變了一個(gè)堿基，被換為表達(dá)酪氨酸的密碼子。PCR反應(yīng)在50pL總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94。C變性5min后開(kāi)始循環(huán)，然后94°C變性50s， 58。C退火lmin， 72。C延伸2min,共30個(gè)循環(huán)后，再于72°C延伸10min。取3pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖l所示。取100pLPCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。實(shí)施例2表達(dá)載體pET-28b(+)-"/5的構(gòu)建
凝膠回收實(shí)施例1的PCR產(chǎn)物和pET-28b(+)載體分別用M/el和雙酶切，并通過(guò)凝膠回收試劑盒回收，然后進(jìn)行連接(16"C，16h),轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切分析驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒被稱為pET-28b(+)-矽/凡
實(shí)施例3 Ay/5在E.coli BL21 (DE3 )中的表達(dá)及XK的純化與鑒定
1 xy/5基因的表達(dá)
以測(cè)序驗(yàn)證的pET-28b(+)-:^/S表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性克隆，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD,值約為0.7時(shí)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG， "'C誘導(dǎo)3h。接種上述轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21于1000mLLB培養(yǎng)基，待OD,值約達(dá)2.0時(shí)，誘導(dǎo)與上述相同。離心收集菌體，以50mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl (含lmmol/L )緩沖液懸浮(濕菌體與緩沖液的比例為lg濕菌體5mL緩沖液)，在冰洛中以超聲波破碎菌體，離心后收集上清。
2木酮糖激酶(XK)的純化與鑒定
NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加NiS04溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-0緩沖液(20mMTris-HClpH7.9， 0.5MNaCl)洗柱。將上述收集破碎菌體離心后得到的上清加入到N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中，反復(fù)加入2 ~ 3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(即NAT-0緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的上述緩沖液洗脫帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶，并做SDS-PAGE分析(圖3 )和Western blot分析(圖4 )。實(shí)施例4木酮糖激酶的酶活檢測(cè)
木酮糖激酶的酶活分析液為50 mmol/L Tris, 50 mmol/L氨基乙酸，10廳ol/L NaF, 50 mmol/L KC1， 1 mmol/L EDTA， 0.5 mmol/LATP， 5mmol/LMgCl2， 0.3 mmol/LNADH， 1 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，25U乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶，O.lmL粗酶提取液，無(wú)菌水調(diào)終體積至0.5mL，反應(yīng)時(shí)間從加入1 mmol/L木酮糖時(shí)開(kāi)始。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中，酶活力單位(U)定義在分析條件下每分鐘轉(zhuǎn)化lpmol底物所需要的酶量。
實(shí)施例5 5-磷酸木酮糖和木酮糖的檢測(cè)
采用高效液相色譜法檢測(cè)5-磷酸木酮糖和木酮糖。檢測(cè)用的色譜儀為Agilent 1200 HPLC ( Agilent 1200色譜工作站)，離子交換色譜柱為87H3，柱溫6(TC,檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相是0.005mo1/L的H2S04,流速0.5ml/min，進(jìn)樣量為20^1。檢測(cè)用的試樣均是色譜純級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果如圖5和圖6。實(shí)施例6利用Ni2+-NTA樹(shù)脂柱制備5-磷酸木酮糖
按實(shí)施例3的方法，上述收集破碎菌體離心后得到的上清上樣到N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中，反復(fù)加入3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液(NAT-0緩沖液含有80mmol/L咪唑)洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，在實(shí)施例3中已證明在洗去雜蛋白后，在N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中保留帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶。
將含有木酮糖和三磷酸腺苷(ATP)的體系(組份D-木酮糖1%，CoCl2.6H20 2xl(T4mol/L， ATP 0.5mol/L, MgS04.7H20 2xlO-3mol/L， pH8.0)加熱至80°C，反應(yīng)體系在His-tag漏XK的N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中保溫2h,得到含有木酮糖和5-磷酸木酮糖的反應(yīng)體系。按實(shí)施例5的條件進(jìn)行HPLC鑒定，結(jié)果如圖7。利用液相色譜分離技術(shù)分離純化5-磷酸木酮糖，根據(jù)5-磷酸木酮糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間收集樣品，樣品的HPLC結(jié)果如圖8所示，樣品純度較高。收集的樣品經(jīng)蒸鎦濃縮后得到結(jié)晶的5-磷酸木酮糖成品。
雖然，上文中已經(jīng)用 一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表
<110>安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司
<120〉 一種5-磷酸木酮糖的制備方法
<130> KHP09113201.2
<160> 4
〈170〉 Patent In version 3. 5
<210> 1
<211> 1503
<212〉 DNA
<213〉 Thermoanaerobacter ethanolicus
<220>
〈221> CDS
〈222> (1). . (1503)
<400> 1
atg tat ttt ctt ggg ata gat ttg ggt aca tea get gta aag ata att 48Met Tyr Phe Leu Gly lie Asp Uu Gly Thr Ser Ala Val Lys Me Me15 10 15
tta gta gag gaa aat gga aat gta ata gga age aca tea aaa gaa tat 96Leu Val Glu Glu Asn Gly Asn Val Me Gly Ser Thr Ser l_ys Glu Tyr
20 25 30
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atg aca C3C ast Met Thr His Asn 365
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480
3tt 1488
1503Val Glu Ile Ser 500
〈210> 2
〈211> 500
<212> PRT
〈213> Thermoanaerobacter ethanolicus
<400> 2 Met Tyr Phe
Leu Gly Me Asp l_eu Gly Thr Ser Ala Val l_ys
1
Leu
5
10
Vai Glu Glu Asn Gly Asn Val lie Gly Ser Thr Ser 20 25
lie Me 15
Glu Tyr
Pro Val Tyr Tyr
35 40 Trp Trp Asn Ala Thr l_ys Asp Gly
Lys 30
Pro Gin Pro Gly Trp Ser Glu Gin Asn Pro Glu Asp
Gly
65
His
Asp
50 55 60
Val Lys Asn Asp Asp Me l_ys Gly lie Gly Leu
45
e Arg Glu l_eu lie lie Lys Thr
Ser Gly
Gly
70 75 Gly Leu Val Leu l_eu Asp Glu Asn Asn Asn Val Leu Leu
85 90 lie l_eu Trp Asn Asp Gin Arg Thr Gin Glu Glu Cys Asp
Gin Thr
Thr 130
Leu "5 Gly
100 105 Gly Lys Glu Arg匕eu Thr匕ys Tyr Thr
Tyr 110 Asn
Gin Met
80 Pro Ala 95
lie Thr l_ys Ala
Phe Thr Ala
Pro 135
Gly
120 125 Lys lie Leu Trp Val Arg Lys His Arg 140
Pro Asp Val Tyr l_ys Lys Me His His Me Leu Leu Pro Lys Asp Tyr150 155 160
Leu Thr Asn Glu Tyr Ala Thr Asp Val Ser Asp Ala 165 170 175
Ser Gly Thr l_eu Leu Phe Asp Val Glu Asn Arg Lys Trp Ser Lys Asp
185 190
Met l_eu Asp Ala l_eu Asp I le Pro Tyr Asn Trp Met Pro l_ys Cys Tyr
200 205
Tyr Val Thr Lys Asp Val Ala Asp Leu
145
I le Arg Phe l_ys
匕eu 180 Asp Ala 195 Thr
Glu Ser Thr Glu Val Thr Gly 210 215 Gly匕eu匕ys Glu Gly Thr
Asp 220
le Val Val Gly Gly Gly Gly
Thr Gly Leu Lys Glu Gly Thr Me Val Val Gly Gly Gly Gly Asp Gin 225 230 235 240
Ala Ser Gly Ala Val Gly Thr Gly Thr Val Lys Ser Gly lie Val Ser
255
l_ys Tyr
Val 250
Ala Leu Gly Thr Ser Gly Val Val Phe Ala Ser Gin
Val 245 Thr
Val Val
Asp 275 His
Gly Thr Ser Gly Val Val Phe Ala Ser Gin Asp 260 265 270
Glu Glu Asn Arg l_eu His Ser Phe Cys His Ala Asn Gly
Leu 280
Lys Trp His Val Met Gly Val Met Leu Ser Ala A(a Ala Cys Leu Lys
His 285 A(a
Trp His Val Met Gly Val Met Leu Ser Ala A(a 290 295 300
Trp Trp Ile Asp Asn Me lie Asn Phe Asn Gly Ser Ser Ile 305 310 315
Glu Lys Leu Leu Glu Glu Ala Gly Lys Val Thr Pro Ala Ser
325 330 Leu Ile Phe匕eu Pro Tyr l_eu Met Gly Glu Arg Thr Pro Tyr 340 345 350
Pro Tyr Ala Arg Gly Ser Phe lie Gly Leu Asn Met Thr His Asn Arg
355 360 365
Gly His lie Thr Arg Ala Me Leu Glu Gly Val Ala Phe Gly Leu Arg
Thr Tyr 320 Gly Gly 335
Ser Asp
His 370
le 375
Ala 380Asp Ser Leu Glu lie Ne Lys Glu Leu Asn Me Pro Val Asn Glu Val 385 390 395 400
Arg Val Ser Gly Gly G(y Ala Lys Ser Val Leu TVp Arg Gin Val l_eu
405 410 415
Ala Asp Me Phe Gly Val Arg Val Asp Met Val Asn Ala Thr Glu Gly
420 425 430
Pro Ala Phe Gly Ala Ala Ue Met Ala Ala Val Gly Tyr Gly Me Phe
435 440 445
l_ys Asp Val Glu Glu Ala Thr Ser Glu Leu Ue Lys IIe Asn Asp Ser
450 455 460
Val Tyr Pro Me Glu Glu Asn Lys Glu l_ys Tyr Asn Glu Val Tyr Thr 465 470 475 480
Val Tyr Lys Asp Leu Tyr Tyr Leu Leu Lys Asn Thr Phe l_ys Arg lie 485 490 495
Val Glu Ile Ser 500
<210> 3 <211> 33 〈212> DNA <213>人工序列
<400> 3
tttccatggg catgtatttt cttgggatag att 33
〈210> 4 〈211> 31
16<212> DNA 〈213〉人工序列
<400> 4
tttctcgagg tagctaattt caacaattct t 3權(quán)利要求
1.一種5-磷酸木酮糖的制備方法，其特征在于，在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮糖激酶基因，然后在樹(shù)脂層析柱中通過(guò)組氨酸標(biāo)簽與層析柱的特異性結(jié)合，對(duì)表達(dá)的木酮糖激酶進(jìn)行分離純化，同時(shí)固定化木酮糖激酶，最后加入底物木酮糖和三磷酸腺苷，合成5-磷酸木酮糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于其中所述的木酮 糖激酶基因來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇菌(T7z^7Woa"aera6""er ^2fl"o/Zc^ )、 野油菜黃單胞菌(X贈(zèng)/;cw20was campe血's )、 大腸桿菌(^EscAm-c/n'a co// )、白熱帶假絲酵母(C""^i(3 a/6/c"m )、釀酒酵母(Sacc/^rawyc^y)或移動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymo
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于其中所述的木酮 糖激酶基因來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇菌(r/zwwofl"aerak7C^" ^2<3"o//cw;s )。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于其中所述木酮糖 激酶具有SEQ ID NO.l所示的基因序列和SEQ ID N0.2所示的氨基酸 序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于分離純化包括步 驟l)以NTA介質(zhì)填柱，用2倍柱體積的去離子水洗滌，接著加MS04 溶液至NTA介質(zhì)結(jié)合度達(dá)到飽和，用5倍柱體積的NAT-0緩沖液洗柱， NAT-0緩沖液為20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl; 2)將含有過(guò)表 達(dá)的木酮糖激酶的大腸桿菌破碎菌體離心后得到的上清加入到 N產(chǎn)-NTA樹(shù)脂柱中，反復(fù)加入2 3次后，用5倍柱體積的NAT-1緩沖液 洗滌介質(zhì)以去除雜蛋白，NAT-l緩沖液為含有80mmol/L咪唑的NAT-0 緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于按上述方法洗 去雜蛋白后，在Ni2+-NTA樹(shù)脂柱中保留帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的木酮 糖激酶，將含有木酮糖和三磷酸腺苷的體系加熱至70-85°C，反應(yīng)體系在螯合有His-tag-XK的N嚴(yán)-NTA樹(shù)脂柱中保溫2h，得到含有木酮 糖和5-磷酸木酮糖的反應(yīng)體系，利用液相色譜技術(shù)分離純化5-磷酸木 酮糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述含有木酮 糖和三磷酸腺苷的體系為D-木酮糖重量百分比為1%，CoC12'6H20: 2xl(T4mol/L,ATP: 0.5mol/L， MgS047H20: 2xl(T3mol/L， pH8.0。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備5-磷酸木酮糖的方法，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的耐80℃高溫的木酮糖激酶；然后通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物C-端的組氨酸標(biāo)簽，一步法完成酶分離純化和酶固定化的工藝，木酮糖-5-磷酸木酮糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)85％。本發(fā)明提供的制備5-磷酸木酮糖方法簡(jiǎn)單實(shí)用。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101665815SQ200910093090
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者松 付, 斌 徐, 李榮杰, 薛培儉 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司