專利名稱：具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌及其N₂O生物控逸方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能的菌株，具體地說是具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047及其N20生物控逸方法。
背景技術(shù)：
在目前已應(yīng)用的多種脫氮方法中，生物脫氮仍然是廢水脫氮處理中的主要手段，其中對異養(yǎng)硝化菌脫氮作用的研究，是對傳統(tǒng)硝化-反硝化理論的豐富與突破。異養(yǎng)硝化作用是指異養(yǎng)微生物在好氧條件下，將氨或有機(jī)氮化合物氧化到羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程，異養(yǎng)硝化作用的重要性正日益受到關(guān)注，尤其是具有好氧反硝化特性的異養(yǎng)硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為污水脫氮引入了全新的概念。
發(fā)明人早期專利"具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法"
ZL 200610140872. 3，該專利是一種涉及采用戴爾福特("W/fi3 "w"力afe/ sk)WXZ-9 CGMCC No. 1797菌株在好氧條件下進(jìn)行生物脫氮處理廢水的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的睪丸酮叢毛單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140870.4，該專利是一種涉及采用睪丸酮叢毛單胞菌(Cb/z/a/^/ "fe^ostero/w') WXZ-18 CGMCC No. 1800菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的惡臭假單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140871.9，該專利是一種涉及采用惡臭假單胞菌(/^ewo^/7 o/ asWXZ-4 CGMCC No. 1798菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的草螺菌及其處理廢水的方法"ZL 200610140869. 1，該專利是一種涉及采用草螺菌(yyeWafA2力7A朋力〃"ie7^e) WXZ-14 CGMCC No. 1799菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。這四項(xiàng)專利所涉及的這些菌株具有優(yōu)異的好氧反硝化性能，可以去除廢水中的硝基氮和亞硝基氮。
具有反硝化性能的菌株能進(jìn)行反硝化反應(yīng)，反硝化反應(yīng)過程包括4個(gè)還原步驟(涉及五種含氮物質(zhì)其中后三種物質(zhì)是氣體)，如下式所示。好氧反硝化反應(yīng)就是在有氧條件下進(jìn)行4個(gè)還原步驟，分別由硝酸鹽還原酶Nar、亞硝酸鹽還原酶Nir、 一氧化氮還原酶Nor、氧化亞氮還原酶Nos催化完成。
<formula>formula see original document page 3</formula>異養(yǎng)硝化作用(heterotrophic nitrification)是異養(yǎng)微生物參與無機(jī)氮
氧化的生物化學(xué)過程，它的底物是無機(jī)態(tài)氨氮。近年來，有研究者提出更為嚴(yán)格
的異養(yǎng)硝化作用的定義為(Papen， 1998):異養(yǎng)微生物在好氧條件下將氨/銨或
是有機(jī)態(tài)氮氧化到羥胺，亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程，艮P:
NH3/NH:/RNH2~^NH2OH — N02 — NO;
目前國外尚未見芽孢桿菌具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的報(bào)道，但國內(nèi)已有了相關(guān)的初步研究。郝桂玉研究了 SBR中芽孢桿菌的異養(yǎng)硝化作用，指出SBR周期連續(xù)運(yùn)行后，污泥濃度會相對穩(wěn)定，芽孢桿菌能很好適應(yīng)好氧與缺氧環(huán)境，成為污泥中的優(yōu)勢菌種。馴化過程中，進(jìn)水氨氮濃度在20mg/L左右，且最大氨氮去除率低于60°/。，但未指出究竟是否有反硝化脫氮功能，因此不能判斷是否存在好氧反硝化性能。何霞等從膜生物反應(yīng)器中分離出來的1株異養(yǎng)硝化細(xì)菌Bacillus sp. LY，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌。在氨氮濃度分別為40、 80和120 mg/L 3種情況下，120 h反應(yīng)后，氨氮的去除率分別是100 %、 85.7 %、 73.7 % 。但該菌株的硝化作用啟動慢，在120h才能達(dá)到較好的脫氮效果。
因?yàn)楸绢I(lǐng)域中主要的任務(wù)是去除廢水中的氮，所以一般來說人們對上述現(xiàn)有好氧反硝化菌株的關(guān)注點(diǎn)僅僅保留在反硝化到氣體產(chǎn)物能達(dá)到去除廢水中氮的目的即可。由于氣體N0的毒性很大，菌株為了自身不受傷害，在早期研究中就發(fā)現(xiàn)，還原酶Nir和Nor基本成對出現(xiàn)，因此一般脫氮產(chǎn)物是N20或N2。但是隨著全球變暖危機(jī)的到來，人們越來越多地關(guān)注溫室氣體，C02為我們所熟知的溫室氣體，可N"的單體溫室效應(yīng)比C02要強(qiáng)310倍。除此之外大氣中化0經(jīng)紫外線照射還能分解為毒性更大的氣體NO;還能與臭氧分子反應(yīng)，破壞臭氧層。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員一直致力于研究如何降低脫氮過程的產(chǎn)物N20，其中生物學(xué)控制的方法即選擇效果更好的菌株可將脫氮反應(yīng)完全進(jìn)行至N"這樣的菌株應(yīng)該具有上述反應(yīng)式全部的四種酶，目前尚未見有關(guān)N力生物控逸菌株報(bào)道。
現(xiàn)有其他脫氮產(chǎn)物AO控逸的有工藝控逸報(bào)道，如通過調(diào)節(jié)脫氮反應(yīng)的工藝操作條件，如溫度、pH或制造輻射氛圍等。這些方法原理基本是通過提高脫氮菌群中氧化亞氮還原酶Nos的活性來達(dá)到實(shí)現(xiàn)控制N,O排放的目的。但工藝控逸方法不能解決某些菌株根本缺乏氧化亞氮還原酶Nos的問題，即不能從根本上解決N」0能否被還原的問題，因此工藝操作條件改變往往改善N20產(chǎn)生的比例十分有限，一般改善后N20占從水體中脫除氮量的10 30%。我們的方案是尋找一種菌株，
4具有上述反應(yīng)式全部的四種酶，而且Nor還原酶位點(diǎn)需要非常接近Nos還原酶位點(diǎn)，使得產(chǎn)生N》的同時(shí)能夠迅速被Nos還原酶催化還原為N2。因?yàn)槿舨荒苎杆俦籒os還原酶催化還原為N2.氣體N20 —旦產(chǎn)生將有可能迅速揮發(fā)到空氣中。
綜上所述，篩選到既生成&0量少，又能保證一定脫氮效率的高效菌株，是本發(fā)明的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株既以硝酸鹽也以氨氮為氮源進(jìn)行生長的菌株；將其接種于常規(guī)好氧污泥中，即可實(shí)現(xiàn)含氨氮廢水的直接脫氮作用，可以解決傳統(tǒng)廢水處理中脫氮需要利用不同的硝化和反硝化菌群，可以解決因不同菌群生物習(xí)性不同，如反硝化需要在缺氧環(huán)境、硝化在好氧環(huán)境分段處理的問題，更重要的是本菌株脫氮產(chǎn)物中N20發(fā)生量僅萬分之五以下，可以有效地實(shí)現(xiàn)N20生物控逸。
本發(fā)明的發(fā)明思路是篩選具有N20生物控逸特性的天然生長優(yōu)勢的高效異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株，并對菌株進(jìn)行測序鑒別。將篩選得到的菌株，接種于含硝酸鹽的廢水中，其能有效地進(jìn)行好氧反硝化脫氮；將該菌株接種于不同濃度的氨氮廢水中，并通過不同反應(yīng)條件試驗(yàn)(溶解氧，碳氮比，pH等)，也能有效地進(jìn)行好氧脫氮，證實(shí)該菌株為一株異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌，并且有較廣泛的適應(yīng)性。
本發(fā)明的技術(shù)方案為 一株具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(^sc/77m cere^)，于2009年4月30日，在北京保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，其保藏號為CGMCCNO. 3047。
上述的一株具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047，該菌株16SrRNA具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，序列長度為1404bp。
一種N》的生物控逸方法，其是將上述的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047接種于氨氮廢水中。接種前需要恒溫保持3(TC，搖床轉(zhuǎn)速120 160r/min進(jìn)行菌株活化，活化12 16小時(shí)后，取對數(shù)生長期菌株，以體積百分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種到氨氮廢水中?；罨^程不會影響菌種性能，只能使得最終效果更佳。
上述的N力的生物控逸方法，所述蠟狀芽孢桿菌CGMCC N0. 3047接種于氨氮廢水中的條件為以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度40 4(TC，C0D/N=15 30， pH=5.0 9.0，轉(zhuǎn)速=90 180r/min， NH/-N初始濃度約為80 120mg/L。
本發(fā)明所述菌株CGMCC NO. 3047具有以下特征(1)菌落特征在BTB平板上培養(yǎng)2 3天，菌落成圓形，光澤度很好，黃色，中心無突起。(2)細(xì)胞形態(tài)特征適宜于pH中性左右，常溫下培養(yǎng)，細(xì)胞為桿狀，革蘭氏染色陰性。(3)蠟狀芽孢桿菌(AsciW^ cere"s) CGMCC NO. 3047的16SrRNA基因序列特征其16SrRNA具有序列表所示的核苷酸序列，序列長度為序列長度為1404bp，在Genbank中的登錄號為EF440610。
參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)的內(nèi)容，根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征，以及根據(jù)其16S rDNA基因序列在Genbank中的檢索，鑒定該菌株(CGMCCNo.)為蠟狀芽孢桿菌(ifecW〃s cer面)。
該菌株CGMCC NO. 3047接種于硝基氮模擬廢水中，在轉(zhuǎn)速為100 r/min，對應(yīng)溶解氧濃度為4. 2 5. 0 mg/L;硝基氮濃度為10 130mg/L左右；碳氮比10 25， pH值為6.5 7.5的條件下，對該菌進(jìn)行反硝化性能測定。結(jié)果表明4天后N0:r-N還原率78. 0%， 4天后總氮(TN)去除率為76. 8%，該菌株能有效的進(jìn)行反硝化作用，該菌株的生長細(xì)胞、細(xì)胞懸浮液均能以硝基氮為氮源生長。
該菌株CGMCC NO. 3047接種于氨氮模擬廢水中，對溶解氧、溫度的耐受程度強(qiáng)，在轉(zhuǎn)速為90 180r/min (對應(yīng)的溶解氧濃度為25% 98%飽和溶解氧)條件下，溫度為20 40°C，碳氮比為15 30， pH為5. 0 9. 0，初始氨氮濃度20 120mg/L的條件下反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)24h后，氨氮的去除率達(dá)96.3%,總氮去除率達(dá)93.81%。過程中無硝基氮、亞硝基氮的積累，該菌株能有效地進(jìn)行異養(yǎng)硝化脫氮。
該菌株CGMCC NO. 3047為一株異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株。具體地講，本發(fā)明涉及一株蠟狀芽孢桿菌(^3cy^M cere"s) CGMCC NO. 3047，該菌株的生長細(xì)胞、細(xì)胞懸浮液均能以氨氮為氮源生長，也能以硝基氮為氮源生長，其可在好氧條件下實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化，使廢水中氮化合物降低，達(dá)到脫氮的目的，同時(shí)經(jīng)檢測在脫氮過程中有害氣體產(chǎn)物N20的逸出少，僅占從水體中脫除氮的0. 047%。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是
1、該菌株CGMCC NO. 3047接種于含不同濃度氨氮的廢水中，選擇不同條件如溶解氧、C0D/N、 pH等在不同實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算硝化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株在反應(yīng)轉(zhuǎn)速90 180rpra，相當(dāng)于溶解氧濃度為飽和溶解氧的25W 98%, C0D/N=15 30，氨氮廢水濃度在20 120mg/L， pH=5. 0 9. 0的實(shí)驗(yàn)范圍
6內(nèi)，其氨氮最大去除速率可達(dá)到51.91 mg/(L*d)， 24h后，氨氮去除率可達(dá)到 96. 3%，總氮去除率達(dá)93. 81%。
2、在該菌株CGMCC NO. 3047接種于含氨氮的廢水中，在以檸檬酸三鈉為唯 一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度=20 40°<:， COD/N=15 30， pH=5.0 9.0，轉(zhuǎn) 速二90 180r/min，NHr-N初始濃度約為20 120mg/L，空氣密封培養(yǎng)96h后，NH/-N 去除率為90.52%，總氮去除率為91.54%。產(chǎn)生的仏0氣體為0. 00945mg，占從水 體中脫除的氮的0.047%;在純氧密封培養(yǎng)96h后，NHZ-N去除率為91.45%,總氮 去除率為92.49%。產(chǎn)生的N力為O. 00425mg，占從水體中脫除的氮的0. 024%。
3、 本發(fā)明中涉及的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO. 3047在培養(yǎng)液溶解氧濃度為2 7mg/L時(shí)，培養(yǎng)初始硝基氮濃度10 130mg/L，且該菌株兼具異養(yǎng)硝化一好氧反 硝化性能和NaO的生物控逸能力。
4、 采用空氣密封和純氧培養(yǎng)兩個(gè)條件，證實(shí)這兩個(gè)條件對N20的產(chǎn)生量影響 很小，AO的產(chǎn)生量均占從水體中脫除總氮量的不足0. 05%，表明該菌株具有很 強(qiáng)的氧化亞氮還原能力，確實(shí)能夠達(dá)到^0的控逸目的，同時(shí)表明空氣密封培養(yǎng) 提供的氧氣就能夠滿足菌株培養(yǎng)的溶解氧控逸條件。
5、 本發(fā)明提供的蠟狀芽孢桿菌(fec^7"s cere^) CGMCC NO. 3047能在硝 酸鹽廢水中生長，在好氧條件下降解利用硝酸鹽，進(jìn)行反硝化脫氮作用；也能在 氨氮廢水中生長，在好氧條件下利用氨氮進(jìn)行異養(yǎng)硝化一好氧反硝化脫氮，且脫 氮過程中氣體產(chǎn)物&0逸出量少；也能在以牛肉蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂等為碳源、氮 源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。


圖1為實(shí)驗(yàn)中為測定^0所用特制雙孔培養(yǎng)搖瓶示意圖2為GC-ECD法測定廢水生物脫氮過程中產(chǎn)生的N力氣體典型色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的篩選
該菌株來自于本實(shí)驗(yàn)室，以硝酸鹽為底物，高溶解氧條件馴化下的SBR曝氣 反應(yīng)器A (總氮TN去除率60.0 83.0X， COD去除率85. 0 90. 0%)中的活性污 泥，菌株編號為WXZ-8，保藏編號為CGMCC NO. 3047。
利用BTB培養(yǎng)基中所含的溴百里酚藍(lán)遇堿變藍(lán)的特點(diǎn)(作為產(chǎn)堿指示劑)， 采用梯度稀釋及涂布法將本實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器A中的混合液均勻涂布于BTB培養(yǎng)基，3(TC恒溫好氧培養(yǎng)數(shù)天后，挑取周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色的暈圈并且菌落形態(tài)不相同 的單菌落作為初篩的好氧反硝化菌，在平板上劃線進(jìn)行菌株的純化。劃線篩選得 到的純菌株在試管中劃斜面保存。接著對菌株進(jìn)行反硝化性能測試(以硝基氮去 除率來衡量)，復(fù)篩出純的好氧反硝化菌。
將篩選出的好氧反硝化菌株接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，測定菌株的硝化性能 (硝化性能以氨氮去除率和總氮的去除率來衡量)，選取氨氮去除率較高的的菌
株WXZ-8，至此認(rèn)為篩選出異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株。
實(shí)施例2:蠟狀芽孢桿菌CGMCC N0.3047好氧反硝化性能的測定方法
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，硝酸鹽模擬廢水i和硝酸鹽模擬廢水n均在
高溫滅菌鍋0. IMP中滅活20min。取50mL滅菌后的硝酸鹽模擬廢水I于100mL錐 形瓶中，將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(^3"Wws cere"s) CGMCC NO. 3047 接入硝酸鹽模擬廢水I，置于氣浴恒溫?fù)u床，恒溫保持3(TC，搖床轉(zhuǎn)速120 160r/min進(jìn)行菌株活化。活化12 16小時(shí)后，以5%的接種量接種到裝有200 raL 硝酸鹽模擬廢水II的250mL錐形瓶中進(jìn)行反硝化、脫氮性能測定。每隔24小時(shí)， 用裝有0.2um混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品5mL，測定 NO「-N和NO:r-N濃度。通過計(jì)算NO,,—-N還原率和總氮(廢水中氨氮、硝酸鹽和亞 硝酸鹽濃度之和)去除率分析菌株的NO:「-N還原性能和脫氮性能。
硝酸鹽模擬廢水I (/L):琥珀酸鈉8.5g， KN03: l.Og， KH2P04: l.Og， FeCl2-6H20 : 0.5g， CaCl2.7H20: 0.2g， MgS04.7H20 : l.Og。
硝酸鹽模擬廢水II (/L):琥珀酸鈉2.4g， KN03: 0.722g， KH2P04: l.Og， MgS04-7H20: l.Og。
實(shí)施例3:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的好氧反硝化測定
廢水好氧反硝化條件為溶解氧濃度，通過控制不同轉(zhuǎn)速rpm(r/min)實(shí)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)速為100r/min，對應(yīng)溶解氧濃度為4. 2 5. 0 mg/L;硝基氮濃度為126mg/L; 碳氮比10 25， pH值為6. 5 7. 5的條件下，對該菌CGMCC NO. 3047進(jìn)行反硝化 性能測定。
按照實(shí)施例2方法進(jìn)行反硝化性能測定，試驗(yàn)結(jié)果4天后NO:,—-N還原率 78.0%, 4天后TN (總氮為硝基氮和亞硝基氮之和)去除率為76.8%。 實(shí)施例4:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的測定方法
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水I和氨氮模擬廢水II均在高溫滅菌鍋0. IMPa中滅活20min。將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(fe"77"s cere〃5)CGMCC NO. 3047接入氨氮模擬廢水I ，置于氣浴恒溫?fù)u床，恒溫保持30°C ， 搖床轉(zhuǎn)速120 160r/min進(jìn)行菌株活化?；罨?2 16小時(shí)后，以5%的接種量接 種到裝有200ml氨氮模擬廢水n的250mL錐形瓶中進(jìn)行硝化、脫氮性能測定。每 隔24小時(shí)，用裝有0. 2 u m混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品 5mL，測定麗/^ ， NO廣N和NO廣N濃度。通過計(jì)算氨氮去除率和總氮(廢水中 氨氮，硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度之和)的去除率分析菌株的硝化性能和脫氮性能。
氨氮模擬廢水I (/L):(亂SO" 0.47g， K跳:lg， FeCl2.6H20: 1.25g， CaCl" 7Ha0: 0. 2g， MgSO., 7H20: lg，檸檬酸三鈉(Qi;Na:i07 2H20): 5. lg，碳源 用量依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)COD/N比調(diào)節(jié)，并同時(shí)調(diào)節(jié)初始pH值。
氨氮模擬廢水II (/L): (NH.丄S(X為氮源，檸檬酸三鈉(C晶Na:A 2H20)為
碳源，(注氮源用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)中初始氨氮濃度的不同要求而調(diào)節(jié)，碳源用量依
據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)COD/N比調(diào)節(jié))，維氏鹽溶液50ml;加水溶解，補(bǔ)充蒸餾水至1L，并 同時(shí)調(diào)節(jié)初始pH值。其中維氏鹽溶液(/L): K2HP01: 5.0g; FeS04'7H20: 0. 05g; NaCl: 2. 5g; MgSOi 7H^: 2. 5g; MnS(X 4H20: 0. 05g，溶解后加水定容至1L。 實(shí)施例5 10不同培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的異養(yǎng)硝化-好氧 反硝化性能測定
按照實(shí)施例4方法進(jìn)行異養(yǎng)硝化性能測定，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) CGMCC NO. 3047的6次試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1實(shí)施例5 10的廢水硝化脫氮試驗(yàn)條件及脫氮效率
編號COD /N溫度 廠CpH值轉(zhuǎn)速 /rpm氨氮初始 濃度(mg/L)4天后氨氮 去除率/%4天后TN 去除率％
實(shí)施例525209.01809886.4887.50
實(shí)施例615307.018010059.4362.79
實(shí)施例720309.0卯10669.8672.52
實(shí)施例825305.013010067.6470.97
實(shí)施例920355.018011480.6881.55
實(shí)施例1020307.01803698.7199.23
從表1可以看出，對蠟狀芽孢桿菌(&cj7"s cere^)菌株的氨氮去除能
9力影響因素最主要的是COD/N，其次為溶解氧和pH，溫度的影響最小。 實(shí)施例ll:在優(yōu)選培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的異養(yǎng)硝化-好氧 反硝化性能測定
采用優(yōu)選的硝化、反硝化優(yōu)選培養(yǎng)條件溫度為30°C、 C0D/N為25、初始 pH值為9. 0、轉(zhuǎn)速為180 r/min。此條件下，蠟狀芽孢桿菌(^scj77m ce/^a ) CGMCC NO. 3047在24h時(shí)氨氮去除率達(dá)最大，為96. 30%。24h時(shí)TN去除率達(dá)93. 81%。 該菌株對數(shù)生長期發(fā)生在最初24小時(shí)內(nèi)，菌體生長量在第24小時(shí)達(dá)到最大，0D6。。 值為1. 094。 TN的去除與NH/-N的去除有著相同的趨勢，在第16小時(shí)TN去除率 達(dá)95.21%，在整個(gè)硝化過程中僅有極少量的NO:,—-N、 N02—-N的累積，菌株在硝化 過程中將NH/-N氧化為N0:「-N、 N0廣N，且通過好氧反硝化作用被去除。 實(shí)施例12:空氣密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源， 對蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術(shù)
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水i和氨氮模擬廢水n均在高溫
滅菌鍋0. IMPa中滅活20min。將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(勘c/"z^ ce/'e^)CGMCC NO. 3047接入氨氮模擬廢水I ，置于氣浴恒溫?fù)u床，恒溫保持30°C， 搖床轉(zhuǎn)速120 160r/min進(jìn)行菌株活化。活化12 16小時(shí)后，以5%的接種量接 種到裝有200tnl氨氮模擬廢水II的1L帶有密封橡膠塞的三角瓶中進(jìn)行硝化能力、 脫氮產(chǎn)物NL'0氣體測定。在20 40°C ， ， pH=7. 0 9. 0，轉(zhuǎn)速為90 180r/min， C0D/N 為15 30的條件下，用氣浴恒溫?fù)u床下進(jìn)行培養(yǎng)，分析測定。同樣條件下，空 白廢水樣品(未接菌株的氨氮模擬廢水II)作為對比基準(zhǔn)試驗(yàn)。
每隔24小時(shí)，用10ml鎖式進(jìn)樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接 分析檢測&0。同時(shí)用抽取液體樣品，測定NH/-N ， N0廣N和N0廣N濃度。通過 計(jì)算氨氮去除率、總氮去除率以及N力的氣體產(chǎn)量分析菌株的硝化性能和脫氮性 能。
N"采用GC-ECD法測定，Varian 3800氣相色譜儀；10mci63Ni電子捕獲檢 測器(ECD); 3mX3mm不銹鋼柱，填充固體Porapak Q柱，80/100目。選用的 綜合色譜條件檢測器溫度(L)( 350'C)、分離柱溫度(Tj ( 5(TC)、載氣流速 (fc) ( 20mL/min)，在此條件下具有較高的靈敏度和精確度，重現(xiàn)性較好(相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差C.V=1.05%， n=23)。如圖2所示，依據(jù)上述測試條件可以看出，02和 仏0分離度較大，說明氣體成分清楚，下述結(jié)果測量精準(zhǔn)。
10實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在空氣密封培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌(5sw7/m cere^) CGMCCNO. 3047菌株在以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度^3(TC， COD/N=25， pH=8. 0，轉(zhuǎn)速-160r/min， 初始濃度為100mg/L，實(shí)驗(yàn)條件下，
96h后NH一N去除率為90. 52%，總氮去除率=91. 54%，產(chǎn)生的N20為0. 00945mg， 占從水體中脫除的氮的0. 047%。
實(shí)施例13:純氧密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源, 對蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術(shù)
與實(shí)施例11不同，本試驗(yàn)中將200ml氨氮模擬廢水II接入1L帶有雙孔密封 橡膠塞的三角瓶中進(jìn)行硝化能力、脫氮產(chǎn)物N"氣體測定。如圖1所示，為實(shí)驗(yàn) 中為測定N20所用特制雙孔培養(yǎng)搖瓶示意圖；其中該培養(yǎng)搖瓶包括雙孔橡膠塞1、 氣體取樣口2、閥門3、液體取樣口4、出氣口5 (帶有夾子的橡膠管另一端連著 玻璃管)和進(jìn)氣口6 (帶有夾子的橡膠管另一端連著玻璃管)。
培養(yǎng)中，將99.999%的高純氧氣以相同流速注入到培養(yǎng)瓶中，充氧時(shí)間為60 秒(注通過前期的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，40秒的充氧時(shí)間能夠保證化瓶中含95%以上的 氧氣)，立刻用夾子夾緊連著玻璃管的橡膠管，然后進(jìn)行搖床培養(yǎng)。每隔24小時(shí)， 用10ml鎖式進(jìn)樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接分析檢測N20。同時(shí) 用抽取液體樣品，測定NH.r-N ， N0「N和NO:,—-N濃度。通過計(jì)算氨氮去除率、總 氮去除率以及N20的氣體產(chǎn)量分析菌株的硝化性能和脫氮性能。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蠟狀芽孢桿菌(&"W"s ce/^/s)菌株在以檸檬酸三鈉為 唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度30。C， C0D/N二25， pH=8.0，轉(zhuǎn)速460r/min， NH:-N初始濃度為100mg/L實(shí)驗(yàn)條件下，96h后NH,-N去除率為91. 45%,總氮去 除率=92. 49%,產(chǎn)生的N20為0. 00425mg，占從水體中脫除的氮的0. 024%。 實(shí)施例14:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測 定
將蠟狀芽孢桿菌WXZ-8 (&w77m cere")接種到100 y L雙蒸水中，沸水 浴煮5min，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。用于16SrRNAPCR反應(yīng)的引物為一對通用引物， 即正向引物為 f27(5' -AGAGTTGATCCTGGCTAG-3')和反向引物為 r1492(5， -GGTTACCTTCGACTT-3，)。引物由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合 成。PCR反應(yīng)體系(50uL): 10XBuffer 5yL， dNTPs4uL，引物f27和r1492 各1 u L，雙蒸水39 u L，離心混勻后加入DNA模板0. 5 u L， Taq酶0. 5 u L。 PCR
11反應(yīng)程序包括(1) 94。C預(yù)變性5min; (2) 94"變性lmin; (3) 5(TC退火lmin;
(4) 72。C延伸2min;進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后再次72。C延伸10 min.瓊脂糖凝膠電 泳(1XTAE電泳緩沖液，1%凝膠)分析PCR結(jié)果，交由北京華大中生科技發(fā)展有 限公司進(jìn)行16SrRNA測序，16SrRNA基因序列長度為1404bp，在Genbank中的登 錄號為EF440610。序列表
<110> 北京工商大學(xué)
〈120>具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌及其仏0的生物控逸方 法
<130〉
〈160〉 1
<170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 1406
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<400> 1
catgcagtcgsacggtaacaggtcttcggacgctgacgagtggcg織gggtgagtaata60
catcggaacgtgcccagtcgtgggggataactactcgaaagagtagctaataccgcatac120
gatctgaggatgaaagcgggggaccttcgggcctcgcgcgattggagcggccgatggcag180
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cgggtcttgtacac3ccgcccgtcacaccatgggagcgggtctcgccagaagtaggtagc1380
ctaaccgcaaggagggcgct3CC3Cg140權(quán)利要求
1、一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其特征在于，所述蠟狀芽孢桿菌保藏編號為CGMCC NO.3047。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047，其特征在于，該菌株16SrRNA具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，序列長度為1404bp。
3、 一種脫氮產(chǎn)物N20生物控逸方法，其特征在于，將權(quán)利要求1或2所述的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047接種于氨氮廢水中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的仏0生物控逸方法，其特征在于，接種前需要恒溫保持20 35°C，搖床轉(zhuǎn)速120 160r/min進(jìn)行菌株活化，活化12 16小時(shí)后，取對數(shù)生長期的菌株，以5%的接種量接種到氨氮廢水中。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的N》生物控逸方法，其特征在于，所述蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO. 3047接種于氨氮廢水的條件為以擰檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度^20 40。C， C0D/N二15 30， pH=5.0 9. 0，轉(zhuǎn)速=90 180r/min， NH4'-N初始濃度為80 120mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株具有異養(yǎng)硝化—好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其保藏編號為CGMCC NO.3047，及其N₂O生物控逸方法。本發(fā)明菌株在好氧條件下能降解硝酸鹽，并進(jìn)行反硝化脫氮作用；也能在氨氮廢水中生長，在好氧條件下利用氨氮進(jìn)行異養(yǎng)硝化—好氧反硝化脫氮，且脫氮過程中氣體產(chǎn)物N₂O逸出量極低，可以從生物學(xué)角度實(shí)現(xiàn)N₂O控逸。
文檔編號C12N1/20GK101665777SQ20091009260
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者劉健楠, 尹明銳, 廖小紅, 蘋 汪, 磊 王, 項(xiàng)幕飛 申請人:北京工商大學(xué)