一種檢測黃色鐮孢菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，設(shè)及一種檢測黃色鑲抱菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物組合 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆根腐病是一種由多種病原菌引起的，造成大豆根部及莖基部腐爛的病害的通 稱。其分布廣、危害重、病原物種類多達(dá)十幾種且所致病害癥狀不易區(qū)別，防治困難，是大豆 生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。大豆鑲抱根腐病是由鑲抱屬真菌引起的大豆根腐病，于1917年 由美國的化ommell首次報道目前已經(jīng)在中國W?、美國m、印度、菲律賓及日本等國報 道發(fā)生，是我國東北和黃淮海地區(qū)大豆產(chǎn)區(qū)的重要病害。大豆鑲抱根腐病在大豆整個生育 期均可發(fā)病，感病植株首先從根尖開始變色，初期呈水浸狀，然后變成褐色，病株的根W及 莖基部產(chǎn)生褐色楠圓形、長條形至不規(guī)則形凹陷斑，并逐漸擴(kuò)展成環(huán)繞主根的大斑塊，有時 還會為害側(cè)根。病菌主要為害表皮及皮層，使其變黑壞死，有時根和莖的中下部維管束變?yōu)?淡褐色，在潮濕條件下，病部表皮會有白色或粉紅色霉層，嚴(yán)重時主根下半部全部爛掉，造 成整株死亡。幼苗期主根病斑呈紅褐色、鐵誘色或黑褐色，重病株的主根和須根腐爛，造成 "秀根";成株期病株根部形成褐色斑，病重時根系開裂，植株的地上部葉片由下而上逐漸發(fā) 黃，感病植株有矮化現(xiàn)象；花期和芙期為發(fā)病高峰期，此時發(fā)病，根系腐爛，田間出現(xiàn)大量黃 葉，病株矮化，結(jié)芙少，巧粒小并且產(chǎn)量嚴(yán)重降低W1U。近年來，該病的發(fā)生呈現(xiàn)擴(kuò)大蔓延、 加重危害的趨勢，對大豆生產(chǎn)造成很大威脅。
[0003] 迄今為止，我國已報道的可W引起大豆鑲抱根腐病的病原菌有：尖鑲抱菌 (F'usariumoxysporum)、茄腐鑲抱菌（F.solani)、木賊鑲抱菌（F.equiseti)、禾谷鑲抱菌 化graminearum)、層出鑲抱菌化proliferatum)、Ξ線鑲抱菌化tricinctum)、燕麥鑲抱 菌化avenaceum)、半裸鑲抱菌化semitecteum)、輪枝鑲抱菌化ve;rticillioides)等 1S3。魏巍等M3結(jié)合DGGE條帶克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析從大豆根腐病樣本中鑒定到黃色 鑲抱菌（F.culmorum)，我們也從發(fā)生根腐病的大豆植株上分離到了黃色鑲抱菌。由于鑲抱 菌常在大豆植株上發(fā)生復(fù)合侵染，而且依據(jù)形態(tài)特征不易鑒別，因此針對黃色鑲抱菌的快 速分子檢測，我們進(jìn)行了一系列的研究。
[0004] 黃色鑲抱菌是非常重要的引起谷類根腐病和赤霉病的±傳真菌M。黃色鑲抱菌 可W侵染小麥引起小麥赤霉病M、小麥根腐病，侵染玉米引起玉米穗腐病，還能寄生于 黃春菊、翠菊、甜椒、番茄、四季豆、矮芙菜豆等。該菌廣泛分布于世界各地，許多歐洲國家、 澳大利亞都有發(fā)生，我國的青海M、甘肅M、山西及黃淮海地區(qū)都有發(fā)生。黃色鑲抱 菌在25°C條件下，PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，菌落直徑達(dá)90mm，氣生菌絲絮狀而茂盛，表面淺 黃色，后期產(chǎn)生紫紅色色素；用1%CMC培養(yǎng)基搖菌（25°C，120巧m)，5d后產(chǎn)生大量大型分 生抱子?，長鑲刀形，中上部膨大彎曲，頂細(xì)胞漸尖，足細(xì)胞不明顯，3-5分隔，無小型分生 抱子。黃色鑲抱菌可產(chǎn)生T-2,脫氧雪腐鑲抱菌締醇值0腳，雪腐鑲抱菌締醇（NIV)，玉米締 酬狂ΕΝ)和玉米赤霉締酬狂OH)等毒素E223,能引起人畜中毒。
[0005] 傳統(tǒng)病原菌的分類、鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測定等，操作繁瑣，耗時長、 靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾^ 23^，不能在病害潛伏期和初發(fā)期做出診斷， 很難對病害發(fā)生進(jìn)行及時的監(jiān)測和有效的控制。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)如普通PCR的方 法已逐步應(yīng)用到各種病原菌的研究中。但如今，普通PCR已經(jīng)是陳舊的技術(shù)且具有很多缺 陷，例如檢測耗時偏長，對祀基因區(qū)段識別位點(diǎn)較少，誤檢率偏高，檢測特異性與靈敏度偏 低，檢測過程較繁瑣等。
[0006]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本 的榮研株式會于2000年發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)EW，因?yàn)槠洳僮骱唵?、快速、特異?高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為可W替代普通PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是針對祀基因的6個區(qū)域設(shè) 計4條特異性的引物，在鏈置換DNA聚合酶度stDNApolymerase)的作用下引起自循環(huán)鏈 置換反應(yīng)，經(jīng)過60~65°C恒溫擴(kuò)增30~85min，就能大量合成目標(biāo)DNA。LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物 可通過濁度儀觀測，反應(yīng)后加入SYBRGreenI或反應(yīng)前加入HNB(^基糞酪藍(lán)）等方法，來 判斷結(jié)果。HNB是金屬離子Mg2+的滴定劑，其顏色隨著反應(yīng)液的抑變化而變化，因此可W 通過檢測LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度的變化及溶液抑而起到顏色指示劑的作用。陽性樣品 溶液顏色由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，陰性樣品溶液顏色保持紫色不變。由于LAMP擴(kuò)增過程依賴識 別祀序列6個獨(dú)立區(qū)域，所W反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過程是在恒溫條件下進(jìn)行，普 通的水浴鍋或者有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，因此檢測成本大大降低。
[0007] 祀標(biāo)基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。普通PCR常用的祀標(biāo)基因，如核糖 體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspace, 口巧口5]不能在種的水平上準(zhǔn)確的區(qū)分 鑲抱菌屬真菌。通過查找相關(guān)文獻(xiàn)，選取多種在種內(nèi)保守、種間存在豐富變化的潛在的祀標(biāo) 基因。本發(fā)明最終將黃色鑲抱菌的CYP51C特異區(qū)段作為祀標(biāo)基因序列，設(shè)計篩選了四條特 異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP引物和兩條環(huán)引物，并在此基礎(chǔ)上建立了基于顏色判定的簡便、 快速和靈敏的黃色鑲抱菌的LAMP檢測體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢測黃色鑲抱菌的環(huán)介導(dǎo)等 溫擴(kuò)增引物組合物。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供該引物組合物的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的又一目的是提供一種檢測黃色鑲抱菌的LAMP試劑盒。
[0011] 本發(fā)明的目的可通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[001引一種用于LAMP檢測黃色鑲抱菌的引物組合物，由SEQIDNO. 2所示的正向外引 物CYP51C-F3,沈QIDNO. 3所示的反向外引物CYP51C-B3,沈QIDNO. 4所示的正向內(nèi)引 物CYP51C-FIP，沈QIDNO. 5所示的反向內(nèi)引物CYP51C-BIP，沈QIDNO. 6所示的環(huán)引物 CYP51C-LF，SEQIDNO. 7 所示的環(huán)引物CYP51C-LB組成。
[0013] 本發(fā)明所述的引物組合物在檢測黃色鑲抱菌中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所述的引物組合物在制備黃色鑲抱菌檢測試劑中的應(yīng)用。
[0015] 一種用于檢測黃色鑲抱菌的LAMP試劑盒，包含本發(fā)明所述的引物組合物。
[001引 所述的LAMP試劑盒優(yōu)選包含：2. 5μL10XThermo化1Buffer，8mMΜ拆04， 1. 2mMdNTPs，內(nèi)引物FIP和BIP各1. 6μM，外引物F3和B3各0. 4μM，環(huán)引物L(fēng)F和LB各0.8μM，0.8M甜菜堿，0.1%Trion-X，20mMTris-肥l(PH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)S04， SU·wLiBstDM聚合酶，ISOmMHNB組成的檢ii溶液。
[0017] 一種LAMP檢測黃色鑲抱菌的方法，包括取24μL所述的檢測溶液，加入2μL待檢 DM溶液，總體積為26μL進(jìn)行LAMP反應(yīng)；反應(yīng)程序?yàn)椋?2°C，85min;反應(yīng)后觀察溶液顏色 變化，如果反應(yīng)管變?yōu)樘焖{(lán)色，則表示存在黃色鑲抱菌，為紫色則表示不存在黃色鑲抱菌， 或所含黃色鑲抱菌未達(dá)到檢測限。
[0018] 本申請文件中所述的"陽性"表示存在黃色鑲抱菌陰性"表示不存在黃色鑲抱菌 或所含黃色鑲抱菌未達(dá)到檢測限。
[001引本發(fā)明詳述：
[0020] 1.引物的設(shè)計
[0021] 祀標(biāo)基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測的關(guān)鍵因素。首先查找相關(guān)文獻(xiàn)選 取潛在祀標(biāo)，如TEF-la(translationelongationfactor1al地agene)、RPB1(RNA polymeraseIIsubunit1)、TUB2(tubulinbeta-2chaingene)、TRI5(trichodiene synthase5gene)、T0P2(topoisomeraseIIgene)、Hyd5化ydrophobin5precursor gene)、CYP51C(醬醇14a脫甲基酶基因的第3種拷貝）等。在NCBI網(wǎng)站查找并下載黃色 鑲抱菌及其相近種的祀標(biāo)序列，然后使用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對，依次比對篩選各個 祀標(biāo)，我們在序列比對分析時發(fā)現(xiàn)CYP51C基因在種內(nèi)不同菌株間高度保守，種間有明顯差 異，因此將CYP51C基因作為檢測黃色鑲抱菌的備選祀標(biāo)之一。在黃色鑲抱菌的CYP51C序 列（SEQIDNO. 1)中選取一段特異序列作為目標(biāo)序列（200~400bp)，用PrimerExplore V4軟件在線設(shè)計引物。根據(jù)引物長度、引物自由能及GC含量等，從軟件設(shè)計的多組引物中 選取部分進(jìn)行篩選。我們需要對種內(nèi)不同來源的菌株進(jìn)行通用性試驗(yàn)，與屬內(nèi)相近種W及 屬間多種病原菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)等大量工作，最終才能篩選出一組通用性好、特異性強(qiáng)、靈 敏度高，能快速準(zhǔn)確地檢測出黃色鑲抱菌的引物